DB2306T 185-2023牛呼吸道疾病綜合征病原PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)范

2306 本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定楠楠，闕桃林，倪宏波，聞曉波，張曉軒，侯喜林牛呼吸道疾病綜合征病原PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了牛呼吸道疾病綜合征病原PCR檢測(cè)技術(shù)的環(huán)境與設(shè)施、儀器設(shè)備、試劑與材料、樣本GB/T18637牛病毒性腹瀉/粘膜病診斷技術(shù)GB/T27981牛傳染性鼻氣管炎病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范NY/T3234牛支原體PCR檢測(cè)方法SN/T1129牛病毒性腹瀉/粘膜4環(huán)境與設(shè)施具有與采集病料相適應(yīng)的動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)室條件和生物安全防護(hù)水平相適應(yīng)的設(shè)備，以及防4.2操作人員資質(zhì)及防護(hù)要求生物安全柜、4℃離心機(jī)、PCR儀、漩渦震蕩器、水平電泳儀、凝膠成像系細(xì)菌總DNA提取試劑盒、PBS溶液、TrizolReage6.2材料200μL、1000μL）等。離心管（1.5mL、2mL），），），R7.2核酸提取上游引物：5ˊ-CACGGACCTGGTGGACAAGAAG-3ˊ下游引物：5ˊ-CTACCGTCACGTGAGTGGTACG-3擴(kuò)增體系：上、下游引物各50pM，脫氧核糖核苷酸三磷酸（dNTP反應(yīng)條件：共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；每個(gè)溫度循環(huán)由95℃60s、57℃60s和72℃60s組成。最后1用IBRV特異性引物對(duì)分離培養(yǎng)物和IBRV標(biāo)準(zhǔn)株準(zhǔn)株均能擴(kuò)增出與目的基因片段大小一致的特異性條帶，擴(kuò)增結(jié)果清晰，無雜帶，則為上游引物：5ˊ-TGTGGACCTAAACCTCACGGT-3ˊ(57499–下游引物：5ˊ-GTAGTCGAGCAGACCCGTGTC-3ˊ(探針序列：5ˊ-FAM-AGGACCGCGAGTTCTTGCCGC-TAMRA-3ˊ(57525–5通常根據(jù)所選擇的設(shè)備分析軟件說明設(shè)定閾值，來自陰性動(dòng)物病毒分離陰性樣本，用做檢測(cè)系統(tǒng)的背景信號(hào)。每次檢測(cè)反應(yīng)應(yīng)該包括陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和試劑對(duì)照。來自陰性牛的肺組織或者值應(yīng)該在可接受的范圍內(nèi)(±3Ct值），為了盡量減少陽性對(duì)照造成的污染風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)采用稀釋使CT值陰性結(jié)果：未檢測(cè)出Ct值的樣本應(yīng)判定為陰性。陰性對(duì)照和未添加模板應(yīng)檢測(cè)不出C8.2牛病毒性腹瀉病毒根據(jù)BVDV病毒株基因序列5ˊUTR設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物上游引物：5ˊ-AGGCTAGCCATGCC2如被檢樣品有條帶，大小為244bp，與陽性樣品相同，即可判定為陽性。上游引物：5ˊ-CCGCGAMGGCCGA下游引物：5ˊ-TGACGACTNCCC探針序列：5ˊ-FAM-CCATGCCCTTAGTAGGACTAGCA-BH）；核酸，判為陽性；Ct（或Cp）值>35，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線的樣品需復(fù)檢。復(fù)檢仍出現(xiàn)上述結(jié)果的，8.3.2逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量（RT-q探針序列：5ˊ-FAM-TTGCGCTTGCACC-M通常根據(jù)所選擇的設(shè)備分析軟件說明設(shè)定閾值，來自陰性動(dòng)物病毒分離陰性樣本，用做檢測(cè)系統(tǒng)根據(jù)Ct（或Cp）值對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行描述及判定，描述和判定分為：無Ct（或Cp）值，且線，表示樣品中無BPIV3核酸，判為陰性；Ct（或Cp）值<35，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線在BPIV3核酸，判為陽性；Ct（或Cp）值>35，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線的樣品需復(fù)檢。復(fù)檢仍），8.4.2逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-q根據(jù)Ct（或Cp）值對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行描述及判定，描述和判定分為：無Ct（或Cp）值，且線，表示樣品中無BRSV核酸，判為陰性；當(dāng)Ct（或Cp）值<35，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣存在BRSV核酸，判為陽性；Ct（或Cp）值>35，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線的樣品需復(fù)檢。復(fù)檢仍出上游引物：5ˊ-GACGAGCTCTTAGCAGTCGCAGCAGTA-3ˊ下游引物：5ˊ-GGGGTCGACTTAGACATTGCCTTTTGTTGTTACG-3ˊ上游引物：5ˊ-GGGGCTTTTTGTTTTGGTGG-3ˊ(70-8.7.1聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)，遵上游引物：5ˊ-TTTTAGCTCTTTTTGAA擴(kuò)增基因片段長(zhǎng)度1.9kb。擴(kuò)增體系：上、下游引物（10μM）各0.5μL，5U/μLrTaqDNA聚合酶0.5μL，25反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸120s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃取PCR產(chǎn)物經(jīng)EB染色的0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳和成像。待檢樣品擴(kuò)增出的DNA片段為1.9kb，可判定為支原體核酸陽性；未出現(xiàn)1.9kb的DNA片段，則搖動(dòng)，充分混合?？鼓齽┎捎脵幟仕徕c緩沖液，或0.5moL/LEDTA。每6mL血液加1mL抗凝劑。直接滅菌PBS緩沖液（0