生物工程實(shí)習(xí)報(bào)告

Novoprotein專(zhuān)業(yè)實(shí)踐報(bào)告報(bào)告人：學(xué)號(hào)：2014.1.18

熟悉、了解、掌握質(zhì)粒EGFP和LGALS1分別作為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增EGFP基因和LGALS1基因，通過(guò)Novorec的方法將兩個(gè)片段同時(shí)重組到pET21a載體上的相關(guān)理論知識(shí)。綠色熒光蛋白-人LGALS1融合蛋白大腸桿菌的表達(dá)載體的構(gòu)建及純化理論學(xué)習(xí)抽提質(zhì)粒作為模板，擴(kuò)增EGFP基因和LGALS1基因，重組到pET21a載體上，表達(dá)篩選，蛋白檢測(cè)，蛋白純化。實(shí)驗(yàn)操作A接菌抽提、PCR反應(yīng)、電泳檢測(cè)

BC重組、轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性鑒定D酶切過(guò)夜、電泳檢測(cè)、產(chǎn)物回收

質(zhì)粒抽提、電泳檢測(cè)

SDS電泳檢測(cè)EWesternBlot免疫印跡

FG帶His標(biāo)簽的人重組蛋白的純化

一、接菌抽提、PCR反應(yīng)、電泳檢測(cè)

Kit抽提↓

PCR反應(yīng)

↓電泳上樣檢測(cè)

質(zhì)粒抽提檢測(cè)PCR反應(yīng)檢測(cè)

二、

酶切過(guò)夜、電泳檢測(cè)、產(chǎn)物回收PCR反應(yīng)產(chǎn)物酶切↓37℃恒溫水浴鍋過(guò)夜↓配膠↓電泳檢測(cè)↓割膠回收酶切產(chǎn)物電泳檢測(cè)三、

重組、轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性鑒定目的基因、載體重組↓轉(zhuǎn)化↓挑菌、37℃培養(yǎng)↓PCR陽(yáng)性鑒定↓電泳檢測(cè)四、質(zhì)粒抽提、電泳檢測(cè)堿法抽提質(zhì)?！娪緳z測(cè)

六、WesternBlot免疫印跡標(biāo)簽C-His抗體C-His抗體-HRPLaneA:PrestainedMolecularweightmarkerLaneB:I-1-1LaneC:I-1-2LaneD:I-1-3LaneE:誘前LaneF:陽(yáng)LaneG:81LaneH:82LaneI:83ABCDEFGHI結(jié)論：綜合SDS,此株菌均有表達(dá)。

七、RFPPurification

batch20140117Proteinexpression(2014-01-12)ABMKMedium:XY1,4L,OD600:2.0,add0.1mMIPTG,incubateat16℃overnight.EndOD600:7.1Cellweight:48.4gBatch:RFP-4L-20140112菌種編號(hào)：RFP-1-20140110TargetproteinwasexpressesobviouslyLaneA:non-inducedcrudeLaneB:inducedcrudeMK:Molecularweightmarker60KD120KD20KD90KD40KD30KD14KDLysisbyultrasonication(2014-01-17)Lysisbuffer:20mMTris,250mMNaCl，10mMimidazolepH8.0(40ml)Cell:2g(:RFP-4L-20140112)

ABC

MKLaneA:FulllysateLaneB:PrecipitationoflysateLaneC:SupernatantoflysateMK:MolecularweightmarkerInclusionbodyproteinwasexpressedobviously60KD120KD40KD20KD14KD30KD90KDPurificationbyChelatingSFF(Ni)column（2014-01-17）Sample:Supernatantoflysate(2014-01-17)BufferA:20mMTris,250mMNaCl,10mMImidazole,pH8.0BufferB:20mMTris,250mMNaCl,500mMImidazole,pH8.0Column:ChelatingSFF(Ni)column(CV20ml)LaneA:Loadsample(23ml)LaneB:Flowthrough(28ml)LaneC:Elutionby50mMImidazole(5ml)LaneD:Elutionby100mMImidazole(6ml)LaneE:Elutionby250mMImidazole(4ml)LaneF:Elutionby500mMImidazole(2ml)MK:MolecularweightmarkerMK