酶學(xué)及酶工程課章

酶學(xué)及酶工程課章第五章酶學(xué)新概念:幾種特殊形態(tài)的酶第2頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、核酶Ribozyme

核酶指一類具有酶催化功能的核酸。核酶的發(fā)現(xiàn)打破了酶都是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)概念。早期發(fā)現(xiàn)的核酶都是RNA。1981年美國(guó)科羅拉多大學(xué)Cech等發(fā)現(xiàn)四膜蟲rRNA中I型內(nèi)含子具有自我剪接功能。1983年Altman等發(fā)現(xiàn)一種RNA可催化tRNA前體為成熟tRNA，具有RNaseP的活性。核酶的發(fā)現(xiàn)打破了只有蛋白質(zhì)才可能有酶催化功能的概念。為此獲得1989年度諾貝爾獎(jiǎng)。

第3頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天核酶的催化類型核酶分為催化分子內(nèi)反應(yīng)和分子間反應(yīng)二大類。催化分子內(nèi)反應(yīng)核酶又可分為自我剪接（Self-splicing）和自我剪切（Self-cleavage）二類。已發(fā)現(xiàn)的RNA核酶有幾十種。其中的植物病毒、擬病毒、衛(wèi)星RNA均為以RNA為模板，以滾動(dòng)環(huán)方式復(fù)制的RAN，自我切割是其RNA生命周期中不可缺少的一環(huán)。第4頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天內(nèi)含子的自我剪接

四膜蟲26SrRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可在幾秒鐘內(nèi)自動(dòng)切除413nt的內(nèi)含子。游離G親核攻擊內(nèi)含子剪接點(diǎn)，切開后外顯子接在一起。內(nèi)含子切除19nt后可自身環(huán)化，還可形成能分子間催化的核酶。第5頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天分子間催化反應(yīng)第6頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天底物專一性

第7頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天類病毒的自體剪切

類病毒環(huán)狀220-400nt小分子RNA不編碼蛋白，復(fù)制依賴宿主，為RNA到RNA途徑，滾環(huán)狀復(fù)制模式。環(huán)狀類病毒進(jìn)入宿主后，由正鏈類病毒轉(zhuǎn)錄出多個(gè)負(fù)鏈復(fù)制中間物。負(fù)鏈中間物自我剪切后環(huán)化，再轉(zhuǎn)錄出多個(gè)正鏈復(fù)制中間物。正鏈中間物剪切并環(huán)化后成為有感染性的類病毒。其剪切通過錘頭狀二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行。第8頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天錘頭狀二級(jí)結(jié)構(gòu)錘頭狀二級(jí)結(jié)構(gòu)中有13個(gè)核苷酸保守序列，其中11個(gè)不變時(shí)剪切反應(yīng)即可發(fā)生。第9頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天核酶的應(yīng)用前景1）作為高特異性RNA限制性內(nèi)切酶；2）作為抗病因子：根據(jù)特定生物來源的靶RNA序列為底物設(shè)計(jì)Ribozyme，合成其序列，進(jìn)行克隆或轉(zhuǎn)入體內(nèi)表達(dá)，可用于抑制靶RNA，實(shí)現(xiàn)抗病。這也為艾滋病治療提供了可能的新途徑。3）生命起源探索。第10頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天發(fā)現(xiàn)脫氧核酶1997年Joyce等獲得兩種具有催化活性的DNA。這使酶的概念進(jìn)一步擴(kuò)大。這種有酶活性的DNA稱為脫氧核酶。把錘頭核酶轉(zhuǎn)換為DNA，合理變化后可以得到有催化活性的錘頭脫氧核酶。錘頭脫氧核酶的體外轉(zhuǎn)錄物中發(fā)現(xiàn)有錘頭核酶活性。這種核酶和脫氧核酶的相互轉(zhuǎn)換可能對(duì)生命起源有重要的意義。第11頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天“酶分子環(huán)”假說因此人們?cè)陉P(guān)注核酶是否能翻譯出有活性的酶。目前已有初步結(jié)果發(fā)現(xiàn)這是可能的，并稱這種酶為“肽酶”。有科學(xué)家提出“酶分子環(huán)”假說，提出在生命起源的早期，存在的是均具有催化活性的脫氧核酶、核酶和肽酶，它們可以相互衍生組成酶分子環(huán)。在循環(huán)往復(fù)的進(jìn)化過程中逐漸演化成主要由DNA攜帶遺傳信息，由蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)催化生化反應(yīng)的格局。第12頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、抗體酶Abzyme1986年Lemer和Schultz分別在Science上發(fā)表了具有酶催化功能的抗體的研究報(bào)告，稱為Abzyme?？贵w酶基質(zhì)為免疫球蛋白，在易變區(qū)具有酶的功能。

根據(jù)誘導(dǎo)契合理論，酶與過渡態(tài)互補(bǔ)，是酶催化機(jī)理之一。酶和抗體的不同在于酶結(jié)合過渡態(tài)，抗體結(jié)合的是基態(tài)。如果抗體能結(jié)合過渡態(tài)，就可能有催化能力。

第13頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天抗體酶的制備第14頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天引入法將催化基因引入已有底物結(jié)合能力的抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)上。1）用定點(diǎn)突變技術(shù)將特定氨基酸引入抗原結(jié)合部位。2）用選擇性化學(xué)修飾方法將催化基團(tuán)引入抗原結(jié)合部位。應(yīng)用的條件是事先對(duì)抗體結(jié)構(gòu)要有所了解。第15頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天誘導(dǎo)法以過渡態(tài)類似物為半抗原，和載體（如牛血清白蛋白）偶聯(lián)，再用單克隆技術(shù)制備、分離、篩選抗體酶。第16頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天例：誘導(dǎo)法產(chǎn)生磷酸酯水解抗體酶磷酸二酯鍵是最穩(wěn)定的鍵之一。Janda等用穩(wěn)定的五配位氧代錸絡(luò)合物模擬RNA水解時(shí)的環(huán)形氧代正膦中間物，產(chǎn)生抗體酶催化水解磷酸二酯鍵。第17頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天發(fā)展前景理論研究：驗(yàn)證過渡態(tài)和過渡態(tài)理論。應(yīng)用：可能按特定需要設(shè)計(jì)及制造新的“酶”，如專一性分解病毒特有蛋白的抗體酶可能成為抗特定病毒的藥物。一些天然酶不能催化的反應(yīng)，可能研制特定抗體酶進(jìn)行催化?？贵w酶和固定化技術(shù)等結(jié)合可能有廣泛酶工程應(yīng)用前景。第18頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天尚需解決的問題1）催化效率目前比天然酶低2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。大多數(shù)抗體酶尚未達(dá)到實(shí)用階段。2）抗體酶篩選是通過與半抗原結(jié)合力大小進(jìn)行的，而不是根據(jù)催化活性。但二者并不是完全相同的。3）底（產(chǎn)）物抑制。底物、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與過渡態(tài)類似時(shí)會(huì)有強(qiáng)的底（產(chǎn)）物抑制。第19頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、模擬酶（enzymemimics）

模擬酶：比天然酶結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單但具有酶催化活性的非蛋白質(zhì)的人工合成酶。酶的模擬工作經(jīng)歷的三個(gè)層次：

1）合成有一定酶活性的簡(jiǎn)單絡(luò)合物；

2）模擬活性中心；

3）酶的整體模擬：以模擬酶活性部位空間結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，連接上特定的催化集團(tuán)。目前常用的模擬酶：環(huán)糊精模擬酶和冠醚模擬酶。第20頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.環(huán)糊精模擬酶第21頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天環(huán)糊精：6-8個(gè)D（+）葡萄糖，通過1，4糖苷鍵首尾連接成環(huán)狀。全部為無(wú)變形椅式構(gòu)象。

第22頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天環(huán)糊精

無(wú)還原端，不被淀粉酶水解。醇羥基位于洞穴外邊緣，具親水性，洞穴內(nèi)壁為氫和糖甙鏈氧，有疏水性。一定大小的分子可部分埋入環(huán)糊精洞內(nèi)，其余在洞外，可形成結(jié)合部位。其側(cè)鏈上接上特定基因，配合本身具有的羥基，可形成催化中心，從而模擬全酶。

第23頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天模擬絲氨酸蛋白酶

β環(huán)糊精為結(jié)合部位，側(cè)鏈上接含羧基和味唑基化合物，加上糖基的羥基，形成類似絲氨酸蛋白酶活性中心的催化功能。以α或γ環(huán)糊精為結(jié)合部位，則具有不同的底物選擇性。

第24頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天第25頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天模擬核糖核酸酶

A和B為不同修飾的環(huán)糊精，催化環(huán)狀磷酸二酯水解，模擬核糖核酶水解RNA的磷酸二酯鍵。

第26頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天模擬轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)氨酶催化酮酸和氨基酸的轉(zhuǎn)換反應(yīng)。整個(gè)過程是一個(gè)多步驟反應(yīng)，磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺為輔酶參加反應(yīng)。單獨(dú)磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺也可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)氨，但因缺底物結(jié)合部位，反應(yīng)很慢。將吡哆胺接在環(huán)糊精上，模擬轉(zhuǎn)氨酶，使反應(yīng)加快200倍。第27頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天模擬轉(zhuǎn)氨酶第28頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.冠醚模擬酶

冠醚水解酶：冠醚環(huán)為結(jié)合部位，側(cè)臂為立體識(shí)別部位；側(cè)臂未端為催化部位。第29頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天冠醚模擬水解酶第30頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.三（2－氨乙基胺）化合物

模擬超氧化物歧化酶功能具有清除活性氧功能的模擬物第31頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天模擬超氧化物歧化酶還在不斷制造出新的模擬酶，很具應(yīng)用前景。第32頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天有關(guān)考試的說明考試安排：時(shí)間：5月9日(周五)8:00至9:40

地點(diǎn)：階一6教室?？荚嚪绞剑赫n堂開卷。可帶筆記、講義、參考書等，但不要用電腦。必須個(gè)人獨(dú)立完成，不能交流，不能互相參看答案，不能用手機(jī)（請(qǐng)考試前關(guān)閉）。希望提前上洗手間。到時(shí)準(zhǔn)時(shí)收卷。（后面還有人上課）第33頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天考試范圍：以上課內(nèi)容為限。

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