DB32T3762.3-2020新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范 第3部分：核酸熒光PCR檢測(cè)程序

ICS11.020

C62

DB32

江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB32/T3762.3—2020

新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范

第3部分：核酸熒光PCR檢測(cè)程序

TechnicalspecificationsforSARS-CoV-2detection

Part3:Real-timefluorescencePCRtestprocedure

2020-03-02發(fā)布2020-03-03實(shí)施

江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB32/T3762.3—2020

新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范第3部分：核酸熒光PCR檢測(cè)程序

1范圍

本部分規(guī)定了新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室核酸熒光PCR檢測(cè)環(huán)境與設(shè)施、設(shè)備與耗材、試劑與材料、樣

本前處理與核酸提取、擴(kuò)增體系配制與擴(kuò)增、結(jié)果判定。

本部分適用于新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室核酸熒光PCR檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增管理辦法原衛(wèi)生部辦公廳

醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則原衛(wèi)生部檢驗(yàn)中心

新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室生物安全指南國(guó)家衛(wèi)生健康委

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件

3.1

熒光PCRreal-timefluorescencePCR

一種新型定量試驗(yàn)技術(shù)，通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)

時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣本模板的初始濃度，用于鑒別病原

微生物。

4環(huán)境與設(shè)施

4.1實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)及級(jí)別要求

應(yīng)按照《新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室生物安全指南》的要求，未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作在采用可靠的

方法滅活前進(jìn)行核酸提取及臨床樣本的滅活等操作，應(yīng)在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-2）進(jìn)行，同時(shí)采

用生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-3）的個(gè)人防護(hù)；感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后進(jìn)行的核

酸檢測(cè)操作應(yīng)在BSL-2進(jìn)行。核酸擴(kuò)增應(yīng)在基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,臨床檢測(cè)機(jī)構(gòu)基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室應(yīng)滿足

GB19489、《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增管理辦法》、《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則》相

關(guān)要求。

4.2操作人員資質(zhì)及防護(hù)要求

1

DB32/T3762.3—2020

實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)經(jīng)過(guò)生物安全培訓(xùn)并取得上崗證，在身體健康狀態(tài)良好的情況下準(zhǔn)入。操作人員按

BSL-3級(jí)實(shí)驗(yàn)室個(gè)人防護(hù)的要求進(jìn)行防護(hù)，需配備N95及以上級(jí)別防護(hù)口罩、醫(yī)用無(wú)紡布帽、護(hù)目鏡或

防護(hù)面屏、連體防護(hù)服、一次性手術(shù)衣、一次性PE手套、乳膠手套、鞋套、防水靴套等防護(hù)裝備。

5設(shè)備與耗材

5.1設(shè)備

生物安全柜、離心機(jī)、渦旋振蕩器、水浴或金屬浴、核酸提取儀、熒光定量PCR儀。

5.2耗材

N95及以上防護(hù)口罩、醫(yī)用無(wú)紡布帽、護(hù)目鏡、連體防護(hù)服、一次性PE手套、一次性手術(shù)衣、乳膠

手套、防水靴套、微量移液器及各種配套帶濾芯Tip頭、1.5mLEP管、凍存管、凍存盒。

6試劑與材料

6.1試劑

核酸提取試劑盒、新型冠狀病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒。

6.2材料

消毒劑：75%乙醇；有效氯5500mg/L的消毒液（需每天新鮮配制）；生理鹽水或磷酸鹽緩沖液

（PH=7.4）；4%NaOH或含1g/L蛋白酶K的磷酸鹽緩沖液或0.1%二硫蘇糖醇的磷酸鹽緩沖液。

7樣本前處理與核酸提取

7.1樣本前處理

7.1.1進(jìn)入BSL-2實(shí)驗(yàn)室，需由兩人同時(shí)操作。

7.1.2在生安柜內(nèi)打開第二層包裝，取出待檢樣本，核對(duì)送檢單，若管壁外有不明液體，應(yīng)用含氯消

毒液擦拭。

7.1.3樣本滅活：56℃水浴或金屬浴滅活30min。

7.1.4特殊樣本處理：痰液樣本：加入檢測(cè)等體積4%NaOH或含1g/L蛋白酶K的磷酸鹽緩沖液或0.1%

二硫蘇糖醇的磷酸鹽緩沖液室溫放置15min～20min液化痰液；糞便樣本：以生理鹽水或磷酸鹽緩沖液

制備10%的便懸液，輕輕吹吸3～5次，靜止10min，8000rpm離心5min，在生物安全柜中取上清

進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

7.1.5將樣本混勻后分裝于2mL帶螺旋蓋內(nèi)有墊圈凍存管。在凍存管上標(biāo)記，注明姓名、樣本類型、

日期等。吸取部分樣本進(jìn)行核酸提取。所有凍存管旋緊管蓋后需用封口膜密封。

7.2核酸提取

7.2.1核酸提取按照核酸提取試劑盒或核酸提取儀操作說(shuō)明進(jìn)行。

7.2.2取出提取好的核酸，轉(zhuǎn)入1.5mLEP管，注明姓名、樣本類型、日期等。

7.2.3將核酸管放入核酸轉(zhuǎn)運(yùn)盒，連同樣本轉(zhuǎn)運(yùn)盒進(jìn)行盒內(nèi)外消毒后轉(zhuǎn)出生安柜。

2

DB32/T3762.3—2020

7.2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，生安柜內(nèi)清場(chǎng)：使用后的核酸提取條/板放入垃圾袋，包扎垃圾袋，含氯消毒液噴

灑消毒外表面，將一次性軟吸收墊噴灑含氯消毒液后折疊。手消毒后將垃圾袋和一次性軟吸收墊一起帶

出生安柜放入核心區(qū)中號(hào)垃圾袋。試管架，試驗(yàn)臺(tái)面、移液器等噴灑含氯消毒液消毒30min后用清水

擦拭。關(guān)閉生安柜，紫外燈消毒30min。

7.2.4.1消毒一次性手術(shù)衣、脫一次性手術(shù)衣放入中號(hào)垃圾袋，包扎垃圾袋。消毒垃圾袋外表面、核

酸和樣本轉(zhuǎn)運(yùn)盒。退出核心區(qū)，將中號(hào)垃圾袋放入緩沖區(qū)大號(hào)垃圾袋內(nèi)。

7.2.4.2每日固定時(shí)間對(duì)核心區(qū)進(jìn)行過(guò)氧化氫終末消毒，消毒前應(yīng)以塑料袋覆蓋機(jī)器如核酸提取儀、

離心機(jī)等，記錄終末消毒記錄。

7.2.4.3在緩沖區(qū)按合理程序脫卸個(gè)人防護(hù)用品。脫內(nèi)層手套前開啟核心間紫外燈消毒30min。

7.2.4.4出緩沖區(qū)，開啟緩沖區(qū)紫外燈消毒。將垃圾袋放入高壓滅菌器中121℃，30min，并記錄。

7.2.4.5將核酸交核酸檢測(cè)人員。樣本轉(zhuǎn)入病毒樣本專用專人保管冰箱。

8擴(kuò)增體系配制與擴(kuò)增

8.1按所用檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書配制熒光PCR擴(kuò)增體系，至少建立2套熒光PCR擴(kuò)增體系。

8.2在生安柜內(nèi)加核酸模板，然后進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增。

8.3在實(shí)驗(yàn)記錄本記錄加樣位置和樣本編號(hào)。

8.4未用完核酸樣本轉(zhuǎn)入病毒樣本專用專人保管冰箱。

8.5按所用試劑盒說(shuō)明書在儀器上設(shè)置擴(kuò)增參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。

9結(jié)果判定

9.1閾值設(shè)定

閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過(guò)陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，結(jié)果顯示陰性為準(zhǔn)。

9.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

9.2.1樣本內(nèi)參基因要求

樣本內(nèi)參RNP基因出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線呈S型，且Ct值小于或等于35。

9.2.2一般要求

檢測(cè)結(jié)果中的陰、陽(yáng)性對(duì)照均符合以下情況，如對(duì)照不成立，此次試驗(yàn)視為無(wú)效。

9.2.3陰性對(duì)照

陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增曲線，或Ct值大于40。

9.2.4陽(yáng)性對(duì)照

陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線呈S型，且Ct值小于或等于30。

9.3結(jié)果判斷

9.3.1陽(yáng)性判定：實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)陽(yáng)性病例需滿足以下兩個(gè)條件中的一個(gè)：

3

DB32/T3762.3—2020

a)同一份樣本中新型冠狀病毒2個(gè)靶標(biāo)（ORF1ab、N）實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。

如果出現(xiàn)單個(gè)靶標(biāo)陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果，則需要重新采樣，重新檢測(cè)。如果仍然為單靶標(biāo)陽(yáng)性，判

定為陽(yáng)性。

b)兩種不同類型樣本實(shí)時(shí)熒光RT-PCR同時(shí)出現(xiàn)單靶標(biāo)陽(yáng)性，或同種類型樣本兩次采樣檢測(cè)中均

出現(xiàn)單個(gè)靶標(biāo)陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果，可判定為陽(yáng)性。

9.3.2陰性判定：在對(duì)照成立下，如果樣本檢測(cè)沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，或Ct值大于40，則判定為陰性。

9.3.3不確定結(jié)果：在對(duì)照成立下，如果檢測(cè)樣本的擴(kuò)增曲線不典型，結(jié)果不確定，建議重復(fù)。如果

核酸檢測(cè)結(jié)果陰性不能排除新型冠狀病毒感染，需要排除可能產(chǎn)生假陰性的因素，包括：樣本質(zhì)量差，

比如口咽等部位的呼吸道樣本；樣本收集的過(guò)早或過(guò)晚；沒(méi)有正確的保存、運(yùn)輸和處理樣本；技術(shù)本身

存在的原因，如病毒變異、PCR抑制等。新型冠狀病毒核酸熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果判斷。

_________________________________

4

DB32/T3762.3—2020

前言

DB32/T3762《新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》目前分為以下部分：

——第1部分：生物樣本采集、運(yùn)輸和保存；

——第2部分：病毒分離與鑒定；

——第3部分：核酸熒光PCR檢測(cè)程序；

——第4部分：重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增程序；

——第5部分：血清IgM和IgG抗體酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)程序；

——第6部分：血清IgM和IgG抗體膠體金免疫層析檢測(cè)程序；

——第7部分：空氣樣本檢測(cè)與評(píng)估；

——第8部分：物體表面檢測(cè)與評(píng)估；

——第9部分：醫(yī)務(wù)人員職業(yè)暴露檢測(cè)與評(píng)估。

本部分為DB32/T3762的第3部分。

本部分按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。

本部分由江蘇省衛(wèi)生健康委員會(huì)提出。

本部分由江蘇省衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。

本部分起草單位：江蘇省疾病預(yù)防控制中心、南京醫(yī)科大學(xué)、蘇州第五人民醫(yī)院、蘇州大學(xué)附二院、

昆山市疾病預(yù)防控制中心。

本部分主要起草人：崔侖標(biāo)、朱寶立、朱小娟、葛以躍、程軍平、徐佳南、錢志遠(yuǎn)、羅曉明、沈歡

喜。

I

DB32/T3762.3—2020

新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范第3部分：核酸熒光PCR檢測(cè)程序

1范圍

本部分規(guī)定了新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室核酸熒光PCR檢測(cè)環(huán)境與設(shè)施、設(shè)備與耗材、試劑與材料、樣

本前處理與核酸提取、擴(kuò)增體系配制與擴(kuò)增、結(jié)果判定。

本部分適用于新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室核酸熒光PCR檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增管理辦法原衛(wèi)生部辦公廳

醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則原衛(wèi)生部檢驗(yàn)中心

新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室生物安全指南國(guó)家衛(wèi)生健康委

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件

3.1

熒光PCRreal-timefluorescencePCR

一種新型定量試驗(yàn)技術(shù)，通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)

時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣本模板的初始濃度，用于鑒別病原

微生物。

4環(huán)境與設(shè)施

4.1實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)及級(jí)別要求

應(yīng)按照《新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室生物安全指南》的要求，未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作在采用可靠的

方法滅活前進(jìn)行核酸提取及臨床樣本的滅活等操作，應(yīng)在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-2）進(jìn)行，同時(shí)采

用生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-3）的個(gè)人防護(hù)；感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后進(jìn)行的核

酸檢測(cè)操作應(yīng)在BSL-2進(jìn)行。核酸擴(kuò)增應(yīng)在基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,臨床檢測(cè)機(jī)構(gòu)基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室應(yīng)滿足

GB19489、《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增管理辦法》、《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則》相

關(guān)要求。

4.2操作人員資質(zhì)及防護(hù)要求

1

DB32/T3762.3—2020

實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)經(jīng)過(guò)生物安全培訓(xùn)并取得上崗證，在身體健康狀態(tài)良好的情況下準(zhǔn)入。操作人員按

BSL-3級(jí)實(shí)驗(yàn)室個(gè)人防護(hù)的要求進(jìn)行防護(hù)，需配備N95及以上級(jí)別防護(hù)口罩、醫(yī)用無(wú)紡布帽、護(hù)目鏡或

防護(hù)面屏、連體防護(hù)服、一次性手術(shù)衣、一次性PE手套、乳膠手套、鞋套、防水靴套等防護(hù)裝備。

5設(shè)備與耗材

5.1設(shè)備

生物安全柜、離心機(jī)、渦旋振蕩器、水浴或金屬浴、核酸提取儀、熒光定量PCR儀。

5.2耗材

N95及以上防護(hù)口罩、醫(yī)用無(wú)紡布帽、護(hù)目鏡、連體防護(hù)服、一次性PE手套、一次性手術(shù)衣、乳膠

手套、防水靴套、微量移液器及各種配套帶濾芯Tip頭、1.5mLEP管、凍存管、凍存盒。

6試劑與材料

6.1試劑

核酸提取試劑盒、新型冠狀病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒。

6.2材料

消毒劑：75%乙醇；有效氯5500mg/L的消毒液（需每天新鮮配制）；生理鹽水或磷酸鹽緩沖液

（PH=7.4）；4%NaOH或含1g/L蛋白酶K的磷酸鹽緩沖液或0.1%二硫蘇糖醇的磷酸鹽緩沖液。

7樣本前處理與核酸提取

7.1樣本前處理

7.1.1進(jìn)入BSL-2實(shí)驗(yàn)室，需由兩人同時(shí)操作。

7.1.2在生安柜內(nèi)打開第二層包裝，取出待檢樣本，核對(duì)送檢單，若管壁外有不明液體，應(yīng)用含氯消

毒液擦拭。

7.1.3樣本滅活：56℃水浴或金屬浴滅活30min。

7.1.4特殊樣本處理：痰液樣本：加入檢測(cè)等體積4%NaOH或含1g/L蛋白酶K的磷酸鹽緩沖液或0.1%

二硫蘇糖醇的磷酸鹽緩沖液室溫放置15min～20min液化痰液；糞便樣本：以生理鹽水或磷酸鹽緩沖液

制備10%的便懸液，輕輕吹吸3～5次，靜止10min，8000rpm離心5min，在生物安全柜中取上清

進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

7.1.5將樣本混勻后分裝于2mL帶螺旋蓋內(nèi)有墊圈凍存管。在凍存管上標(biāo)記，注明姓名、樣本類型、

日期等。吸取部分樣本進(jìn)行核酸提取。所有凍存管旋緊管蓋后需用封口膜密封。

7.2核酸提取

7.2.1核酸提取按照核酸提取試劑盒或核酸提取儀操作說(shuō)明進(jìn)行。

7.2.2取出提取好的核酸，轉(zhuǎn)入1.5mLEP管，注明姓名、樣本類型、日期等。

7.2.3將核酸管放入核酸轉(zhuǎn)運(yùn)盒，連同樣本轉(zhuǎn)運(yùn)盒進(jìn)行盒內(nèi)外消毒后轉(zhuǎn)出生安柜。

2

DB32/T3762.3—2020

7.2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，生安柜內(nèi)清場(chǎng)：使用后的核酸提取條/板放入垃圾袋，包扎垃圾袋，含氯消毒液噴

灑消毒外表面，將一次性軟吸收墊噴灑含氯消毒液后折疊。手消毒后將垃圾袋和一次性軟吸收墊一起帶

出生安柜放入核心區(qū)中號(hào)垃圾袋。試管架，試驗(yàn)臺(tái)面、移液器等噴灑含氯消毒液消毒30min后用清水

擦拭。關(guān)閉生安柜，紫外燈消毒30min。

7.2.4.1消毒一次性手術(shù)衣、脫一次性手術(shù)衣放入中號(hào)垃圾袋，包扎垃圾袋。消毒垃圾袋外表面、核

酸和樣本轉(zhuǎn)運(yùn)盒。退出核心區(qū)，將中號(hào)垃圾袋放入緩沖區(qū)大號(hào)垃圾袋內(nèi)。

7.2.4.2每日固定時(shí)間對(duì)核心區(qū)進(jìn)行過(guò)氧化氫終末消毒，消毒前應(yīng)以塑料袋覆蓋機(jī)器如核酸提取儀、

離心機(jī)等，記錄終末消毒記錄。

7.2.4.3在緩沖區(qū)按合理程序脫卸個(gè)人防護(hù)用品。脫內(nèi)層手套前開啟核心間紫外燈消毒30min。

7.2.4.4出緩沖區(qū)，開啟緩沖區(qū)紫外燈消毒。將垃圾袋放入高壓滅菌器中121℃，30min，并記錄。

7.2.4.5將核酸交核酸檢測(cè)人員。樣本轉(zhuǎn)入病毒樣本專用專人保管冰箱。

8擴(kuò)增體系配制與擴(kuò)增

8.1按所用檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書配制熒光PCR擴(kuò)增體系，至少建立2套熒光PCR擴(kuò)增體系。

8.2在生安柜內(nèi)加核酸模板，然后進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增。

8.3在實(shí)驗(yàn)記錄本記錄加樣位置和樣本編號(hào)。

8.4未用完核酸樣本轉(zhuǎn)入病毒樣本專用專人保管冰箱。

8.5按所用試劑盒說(shuō)明書在儀器上設(shè)置擴(kuò)增參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。

9結(jié)果判定

9.1閾值設(shè)定

閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過(guò)陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，結(jié)果顯示陰性為準(zhǔn)。

9.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

9.2.1樣本內(nèi)參基因要求

樣本內(nèi)參RNP基因出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線呈S型，且Ct值小