藥學(xué)分生第二章的復(fù)制和修復(fù)

藥學(xué)分生第二章的復(fù)制和修復(fù)

復(fù)制：以親代DNA或RNA為模板，根據(jù)堿基配對的原則，在一系列酶的作用下，生成與親代相同的子代DNA或RNA的過程。第2頁,共79頁，2024年2月25日，星期天Reversetranscription中心法則圖示第3頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)DNA的復(fù)制第4頁,共79頁，2024年2月25日，星期天DNA復(fù)制是一個(gè)由多種酶催化和有多種蛋白質(zhì)參與的受到精密調(diào)控的過程；

DNA是細(xì)胞中唯一具修復(fù)系統(tǒng)的生物大分子。第5頁,共79頁，2024年2月25日，星期天復(fù)制：以親代（母鏈）DNA為模板合成子代DNA的過程。復(fù)制親代DNA子代DNA一、DNA復(fù)制的一般特征第6頁,共79頁，2024年2月25日，星期天（一）半保留復(fù)制

DNA生物合成時(shí)，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板按堿基配對規(guī)律，合成與模板互補(bǔ)的子鏈。子代細(xì)胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全從新合成。兩個(gè)子細(xì)胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。半保留復(fù)制第7頁,共79頁，2024年2月25日，星期天DNA復(fù)制可能的三種方式第8頁,共79頁，2024年2月25日，星期天半保留復(fù)制的證明：Meselson和Stahl將同位素15N標(biāo)記的15NH4Cl加入大腸桿菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12代，使大腸桿菌的DNA都帶上15N的標(biāo)記，然后將該大腸桿菌轉(zhuǎn)入14N的普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，分離子一代、子二代、子三代、子四代DNA，進(jìn)行氯化銫密度梯度離心，實(shí)驗(yàn)證明了DNA的半保留復(fù)制。第9頁,共79頁，2024年2月25日，星期天由Meselson和Stahl設(shè)計(jì)證明半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)的被譽(yù)為生物學(xué)最美麗的實(shí)驗(yàn)第10頁,共79頁，2024年2月25日，星期天Meselson和Stahl的證明DNA半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)流程第11頁,共79頁，2024年2月25日，星期天15N-DNA的密度大于14N-DNA的密度第12頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第13頁,共79頁，2024年2月25日，星期天按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對的。半保留復(fù)制的意義第14頁,共79頁，2024年2月25日，星期天DNA復(fù)制的起點(diǎn)和方式復(fù)制起點(diǎn)：DNA復(fù)制總是從某一特定區(qū)域開始，這個(gè)特定區(qū)域是基因組內(nèi)的一段特殊堿基序列，稱為復(fù)制起點(diǎn)，ori或O不同生物有不同的復(fù)制起點(diǎn)，但都富含AT配對特征富含A·T配對的區(qū)域經(jīng)常處于開發(fā)與閉合的動(dòng)態(tài)平衡之中，稱為DNA的呼吸作用。在原核生物中，復(fù)制起始點(diǎn)通常為一個(gè)，而在真核生物中則為多個(gè)。

第15頁,共79頁，2024年2月25日，星期天DNA復(fù)制起始區(qū)的特征第16頁,共79頁，2024年2月25日，星期天復(fù)制子（replicon）一個(gè)復(fù)制子只含有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。兩個(gè)相鄰起始點(diǎn)之間的DNA片段，稱為一個(gè)復(fù)制子。復(fù)制子是獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。第17頁,共79頁，2024年2月25日，星期天AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA

復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉子代DNA

復(fù)制叉第18頁,共79頁，2024年2月25日，星期天電鏡下真核生物DNA的多個(gè)復(fù)制叉結(jié)構(gòu)第19頁,共79頁，2024年2月25日，星期天復(fù)制叉的結(jié)構(gòu)當(dāng)DNA復(fù)制從起始區(qū)起動(dòng)的時(shí)候，起始區(qū)的DNA雙鏈因發(fā)生解鏈而形成叉狀結(jié)構(gòu)，這樣的結(jié)構(gòu)被稱為復(fù)制叉

第20頁,共79頁，2024年2月25日，星期天大多數(shù)原核和真核生物復(fù)制時(shí)，DNA都是從固定起始點(diǎn)開始向兩個(gè)方向解鏈，形成兩個(gè)延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制。復(fù)制方向（1）雙向復(fù)制（bidirectionalreplication）（2）單向復(fù)制

從特定的位置開始，單方向進(jìn)行復(fù)制。（3）不對稱的雙向復(fù)制第21頁,共79頁，2024年2月25日，星期天雙向復(fù)制單向復(fù)制第22頁,共79頁，2024年2月25日，星期天（三）、半不連續(xù)復(fù)制

1、體內(nèi)僅存在5’3’的DNA聚合酶

2、先導(dǎo)鏈與后隨鏈（崗崎片段）第23頁,共79頁，2024年2月25日，星期天先導(dǎo)鏈后隨鏈岡崎片段先導(dǎo)鏈：DNA復(fù)制時(shí)，一股以3’5’方向的母鏈作為模板，新合成的鏈以5’3’方向連續(xù)合成的鏈稱為前導(dǎo)鏈。后隨鏈：DNA復(fù)制時(shí)，一股以5’3’方向的母鏈作為模板，新合成鏈沿5’3’合成1000-2000個(gè)核苷酸不連續(xù)的小片段稱為隨從鏈。復(fù)制方向與解鏈方向一致復(fù)制方向與解鏈方向相反岡崎片段第24頁,共79頁，2024年2月25日，星期天

DNA半不連續(xù)復(fù)制：

3’5’方向母鏈為模板，新鏈5’3’方向連續(xù)合成5’3’方向母鏈為模板，新鏈5’3’方向合成許多不連續(xù)的片段（崗崎片段）這種復(fù)制方式稱之為半不連續(xù)復(fù)制。第25頁,共79頁，2024年2月25日，星期天RNA引物

DNA聚合酶不能催化兩個(gè)游離dNTP在DNA模板上聚合需要具3’-OH的引物RNA聚合酶能催化兩個(gè)游離NTP在DNA模板上聚合提供3’-OH引物最后被DNA聚合酶Ⅰ除去、補(bǔ)滿，再由連接酶連接減少突變，提高DNA復(fù)制的真實(shí)性第26頁,共79頁，2024年2月25日，星期天發(fā)現(xiàn)（1968）：同位素實(shí)驗(yàn)，3HdT

短時(shí)間內(nèi)為DNA小片段

一段時(shí)間后檢測到DNA大片段。當(dāng)用DNA連接酶的變異株時(shí)，檢測到大量DNA片段的積累?！C明DNA復(fù)制中有小片段合成。測定DNA小片段，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于合成DNA的一半。由于U替代dT，被尿嘧啶-N-糖基酶切除。在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突變植株中，檢測到一半3H標(biāo)記出現(xiàn)在小片段（岡崎片段）中。第27頁,共79頁，2024年2月25日，星期天二DNA復(fù)制的酶學(xué)1、使DNA鏈解離的酶解旋酶單鏈DNA結(jié)合蛋白DNA旋轉(zhuǎn)酶（拓?fù)洚悩?gòu)酶）第28頁,共79頁，2024年2月25日，星期天（1）解螺旋酶(helicase)（DnaB蛋白）：——利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈（2）單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整

E.Coli中的SSB以四聚體形式存在，與DNA結(jié)合具有協(xié)同作用。DNA復(fù)制的酶學(xué)————第29頁,共79頁，2024年2月25日，星期天108局部解鏈后（3）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNAtopoisomerase)

拓?fù)洚悩?gòu)酶Π：該酶能暫時(shí)性地切斷和重新連接雙鏈DNA，作用是將負(fù)超螺旋引入DNA分子。同復(fù)制有關(guān)。第30頁,共79頁，2024年2月25日，星期天解鏈過程中正超螺旋的形成第31頁,共79頁，2024年2月25日，星期天此酶以DNA為模板合成一段RNA,這段RNA作為合成DNA的引物（Primer)。實(shí)質(zhì)是以DNA為模板的RNA聚合酶。1、RNA引物酶：2、DNA復(fù)制過程中的酶第32頁,共79頁，2024年2月25日，星期天(2)DNA聚合酶：原料：四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dGTPdCTPdTTP)需要模板：以DNA為模板鏈，合成子代DNA，模板可以是雙鏈，也可以是單鏈DNA。合成產(chǎn)物與模板互補(bǔ)。需要引物：一小段RNA(或DNA）為引物，在大腸桿菌中，DNA的合成需要一段RNA鏈作為引物，引物含3’-OH.合成方向：5

3

第33頁,共79頁，2024年2月25日，星期天

3’5’5’3’外切酶聚合酶NC5’3’外切酶小片段大片段（klenow片段）切除RNA引物損傷修復(fù)校讀功能（常用的工具酶）1、DNA聚合酶Ⅰ聚合功能第34頁,共79頁，2024年2月25日，星期天已在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)5種不同的DNA聚合酶

DNAPI:占聚合酶總活性的90%DNAPII:

在DNA修復(fù)中起作用(1999年得到證明)DNAPIII:

主要的DNA復(fù)制酶

DNAPIV:

在DNA修復(fù)中起作用（在1999年發(fā)現(xiàn)）DNAPV:在DNA修復(fù)中起作用（在1999年發(fā)現(xiàn)）

DNA聚合酶家族第35頁,共79頁，2024年2月25日，星期天在真核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶有五種，分別命名為DNA聚合酶α（polα），DNA聚合酶β（polβ），DNA聚合酶γ（polγ），DNA聚合酶δ（polδ），DNA聚合酶ε（polε）。其中，參與染色體DNA復(fù)制的是polα（延長滯后鏈）和polδ（延長前導(dǎo)鏈），參與線粒體DNA復(fù)制的是polγ，polε與DNA損傷修復(fù)、校讀和填補(bǔ)缺口有關(guān)，polβ只在其他聚合酶無活性時(shí)才發(fā)揮作用。

第36頁,共79頁，2024年2月25日，星期天參與DNA復(fù)制的酶與蛋白因子第37頁,共79頁，2024年2月25日，星期天（一）復(fù)制的起始（二）復(fù)制的延長（三）復(fù)制的終止三、DNA復(fù)制過程：第38頁,共79頁，2024年2月25日，星期天復(fù)制原點(diǎn)oriC和原點(diǎn)的識別：DNA的復(fù)制有特定的起始位點(diǎn)，叫做復(fù)制原點(diǎn)。常用oriC(或o）表示。大腸桿菌的復(fù)制原點(diǎn)oriC由245個(gè)bp構(gòu)成，含兩組保守的重復(fù)序列：三個(gè)13bp的序列（富含A、T的序列）和四個(gè)9bp的序列；許多生物的復(fù)制原點(diǎn)也都是富含A、T的區(qū)段。第39頁,共79頁，2024年2月25日，星期天（一）復(fù)制起始1、拓?fù)洚悩?gòu)酶解開超螺旋。2、DnaA蛋白識別并在ATP存在下結(jié)合于四個(gè)9bp的重復(fù)序列。3、在類組蛋白HU、ATP參與下，DanA蛋白變性13個(gè)bp的重復(fù)序列,形成開鏈復(fù)合物。4、DnaB借助于水解ATP產(chǎn)生的能量在DnaC的幫助下沿5’→3’方向移動(dòng)，解開DNA雙鏈，形成前引發(fā)復(fù)合物。5、單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合于單鏈。6、引物合成酶（DnaG蛋白）開始合成RNA引物。第40頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第41頁,共79頁，2024年2月25日，星期天(二)鏈的延長（岡崎片段的合成）

真核生物的岡崎片段為：100-200bp原核生物的岡崎片段為：1000-2000bp第42頁,共79頁，2024年2月25日，星期天DNA鏈的延伸

在DNA聚合酶Ш的催化下，以四種5’-脫氧核苷三磷酸為底物，在RNA引物的3’端以磷酸二酯鍵連接上脫氧核糖核苷酸并釋放出焦磷酸。DNA鏈的延伸同時(shí)進(jìn)行前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成。兩條鏈方向相反。

先導(dǎo)鏈后隨鏈岡崎片段半不連續(xù)復(fù)制岡崎模型第43頁,共79頁，2024年2月25日，星期天岡崎片段引物的切除、缺口的填補(bǔ)和切口的連接:第44頁,共79頁，2024年2月25日，星期天(三)復(fù)制的終止順時(shí)針終止陷阱逆時(shí)針終止陷阱Ter:終止陷阱，引起復(fù)制終止的特定區(qū)域，20bp的序列，終止利用物質(zhì)Tus可識別并結(jié)合，從而導(dǎo)致DNA復(fù)制的終止。第45頁,共79頁，2024年2月25日，星期天真核生物復(fù)制特點(diǎn)真核生物DNA復(fù)制與原核生物DNA復(fù)制的不同點(diǎn)：１．真核DNA有多個(gè)復(fù)制原點(diǎn)；2．真核生物有多種聚合酶。3．真核生物染色體為線性，末端具有端粒結(jié)構(gòu)，由端粒酶合成4．真核生物染色體復(fù)制涉及核小體結(jié)構(gòu)第46頁,共79頁，2024年2月25日，星期天從哺乳動(dòng)物中分出５種DNApol酶。分別為polα、β、γ、δ、ε。Polα（4亞基）：有引物合成酶活性。具有合成RNA后4~5dNTP的活性。無外切酶活性。持續(xù)性中等，約為100核苷酸，完成滯后鏈DNA復(fù)制。Polδ（2亞基）：有持續(xù)合成DNA鏈的能力，有3'—5'核酸外切酶活性（具有校正功能），完成前導(dǎo)鏈DNA復(fù)制。

Polε（>1亞基）：相當(dāng)于E.coli的polⅠ，是一種修復(fù)酶，具有3

'→5'

核酸外切酶活性。Polβ（1亞基）：與損傷修復(fù)有關(guān)。Polγ（2亞基）：是線粒體DNA合成酶（3'→5'外切酶）

第47頁,共79頁，2024年2月25日，星期天四、特殊類型的復(fù)制（一）線粒體復(fù)制線粒體DNA雙鏈閉環(huán)結(jié)構(gòu)：重鏈、輕鏈取代環(huán)復(fù)制（D環(huán)復(fù)制）第48頁,共79頁，2024年2月25日，星期天D-環(huán)復(fù)制線粒體和葉綠體DNA通常以D-環(huán)的方式進(jìn)行復(fù)制。少數(shù)病毒，如腺病毒，也進(jìn)行D-環(huán)復(fù)制。催化線粒體DNA復(fù)制的酶是DNA聚合酶γ，兩條鏈的合成都需要先合成RNA引物，但都不形成岡崎片段，因此都是連續(xù)合成。兩條子鏈的合成在時(shí)間上的不同步。第49頁,共79頁，2024年2月25日，星期天D環(huán)復(fù)制（displacement

replication）線粒體DNA的雙股鏈分為輕鏈和重鏈。它的復(fù)制是一種單向不對稱的特殊復(fù)制方式,稱為Ｄ—環(huán)復(fù)制。復(fù)制從重鏈（Ｈ鏈）的原點(diǎn)開始，新合成的Ｈ鏈置換原來鏈，游離的單鏈稱為取代鏈（displacement）或Ｄ環(huán)。當(dāng)Ｈ鏈合成進(jìn)行到約2/3時(shí)，輕鏈（Ｌ鏈）的原點(diǎn)暴露出來，并引發(fā)其合成，延伸方向與Ｈ鏈的相反。第50頁,共79頁，2024年2月25日，星期天D環(huán)復(fù)制

第51頁,共79頁，2024年2月25日，星期天（二）、噬菌體和病毒DNA的復(fù)制1.單鏈環(huán)狀DNA病毒的復(fù)制1、第一階段：以親本單鏈（＋）為模板，合成互補(bǔ)鏈（－），形成閉合的雙鏈環(huán)狀復(fù)制形。2、第二階段：滾環(huán)復(fù)制。一個(gè)負(fù)鏈可以合成許多正鏈，正鏈用于噬菌體包裝。3′-OH5′-P3′-OH5′-P第52頁,共79頁，2024年2月25日，星期天2.線狀DNA病毒的復(fù)制1、雙鏈線狀DNA的復(fù)制有兩種起始類型：從DNA分子的中間起始從DNA分子末端起始腺病毒DNA的復(fù)制：從DNA分子末端起始，以單鏈置換形式進(jìn)行。第53頁,共79頁，2024年2月25日，星期天圖p116頁第54頁,共79頁，2024年2月25日，星期天（2）、單鏈線狀DNA的復(fù)制：微小病毒的復(fù)制圖p118頁第55頁,共79頁，2024年2月25日，星期天RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA3.逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制：

從單鏈RNA到雙鏈DNA的生成分三步第56頁,共79頁，2024年2月25日，星期天逆轉(zhuǎn)錄酶有三種活性：①RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；②RNase活性；③DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性。第57頁,共79頁，2024年2月25日，星期天逆轉(zhuǎn)錄過程：①逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA與宿主tRNA分子互補(bǔ)形成局部雙鏈，以tRNA為引物，合成DNA負(fù)鏈5′端。②由RNaseH水解去除雜化雙鏈中的RNA5′端。③新合成DNA負(fù)鏈的3′端跳到模板RNA的3′端，并通過兩條鏈上共同的R序列形成雜交鏈。④DNA負(fù)鏈向5′端延伸。⑤RNaseH去除雜化雙鏈中的絕大部分RNA。第58頁,共79頁，2024年2月25日，星期天⑦RNaseH去除RNA和tRNA引物。DNA正鏈的3′端跳到DNA負(fù)鏈的3′端，以兩條鏈共有的PBS序列雜交，形成局部雙鏈。⑨雙向延伸完成DNA雙鏈合成。⑥以剩余的一段RNA作引物合成DNA正鏈的3′端。第59頁,共79頁，2024年2月25日，星期天第60頁,共79頁，2024年2月25日，星期天

第二節(jié)、DNA的損傷與修復(fù)第61頁,共79頁，2024年2月25日，星期天（一）內(nèi)源性損傷1.DNA復(fù)制錯(cuò)誤：錯(cuò)配等2.堿基存在互變異構(gòu)體，形成錯(cuò)誤堿基配對3.自發(fā)的化學(xué)變化：脫嘌呤、脫氨基4.氧化作用損傷堿基一DNA損傷類型第62頁,共79頁，2024年2月25日，星期天（一）內(nèi)源性損傷1、DNA的復(fù)制錯(cuò)誤：復(fù)制錯(cuò)誤引起損傷，在DNA損傷中最為多見。2、由于堿基本身存在互變異構(gòu)體，可能形成錯(cuò)誤的堿基配對。復(fù)制錯(cuò)誤最多見于尿嘧啶（U）的滲入，另外偶有其它堿基的滲入。一DNA損傷類型第63頁,共79頁，2024年2月25日，星期天3、自發(fā)的化學(xué)變化：（1）脫嘌呤或脫嘧啶作用：是指DNA分子上丟掉了嘌呤堿或嘧啶堿，形成無堿基位點(diǎn)，稱為AP部位(apyrimidine，apurinesite,AP)。在生理狀態(tài)下，脫嘌呤是脫嘧啶的20倍。（2）脫氨基作用：即胞嘧啶、腺嘌呤及鳥嘌呤的環(huán)外氨基自發(fā)丟失。

胞嘧啶→尿嘧啶；腺嘌呤→次黃嘌呤；鳥嘌呤→黃嘌呤。脫氨基所至的堿基轉(zhuǎn)變可影響DNA的復(fù)制，由此產(chǎn)生突變。第64頁,共79頁，2024年2月25日，星期天4、氧化作用損傷堿基：代謝產(chǎn)生活性氧基團(tuán)，使DNA氧化損傷第65頁,共79頁，2024年2月25日，星期天（二）外源性損傷物理因素化學(xué)因素紫外線損傷（共軛雙鍵）電離輻射損傷（X線/

線）亞硝酸鹽CU5-溴尿嘧啶5-BUA氮芥類烷化劑羥胺C-AGG羥胺第66頁,共79頁，2024年2月25日，星期天

物理因素：由紫外線、電離輻射、X射線等引起的DNA損傷。其中，X射線和電離輻射常常引起DNA鏈的斷裂，而紫外線常常引起嘧啶二聚體的形成，如TT，TC，CC等二聚體。這些嘧啶二聚體由于形成了共價(jià)鍵連接的環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)，因而會引起復(fù)制障礙。

第67頁,共79頁，2024年2月25日，星期天

化學(xué)因素：堿基類似物：5-BU,齊多夫定……堿基修飾劑：亞硝酸、烷化劑……第68頁,共79頁，2024年2月25日，星期天二DNA損傷在藥物評價(jià)中的應(yīng)用遺傳毒性試驗(yàn)：檢測DNA損傷以及損傷的固定多種方法組合實(shí)驗(yàn)第69頁,共79頁，2024年2月25日，星期天誘變育種常用誘變劑：射線、烷化劑、堿基類似物、移碼突變劑等三DNA損傷與抗生素菌種誘變第70頁,共79頁，2024年2月25日，星期天在長期的進(jìn)化過程中，生物體演化出了一整套十分有效的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)，包括：①糾正偶然復(fù)制錯(cuò)誤的系統(tǒng)——復(fù)制修復(fù)DNA聚合酶的3′→5′校讀功能DNA糖苷酶修復(fù)系統(tǒng)錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)等第三節(jié)DNA修復(fù)③復(fù)制后修復(fù)：主要包括重組修復(fù)系統(tǒng)、SOS修復(fù)系統(tǒng)。②修復(fù)環(huán)境因素致DNA損傷的系統(tǒng)——損傷修復(fù)主要包括：光修復(fù)系統(tǒng)、切除修復(fù)系統(tǒng)第71頁,共79頁，2024年2月25日，星期天1、尿嘧啶糖苷酶修復(fù)系統(tǒng)：

對于糾正復(fù)制錯(cuò)誤尤為重要。ATCGAGTTAGCUCAATCGAGTTAGCCAATCGAGTTAGCCAATCGAGTTAGCTCA尿嘧啶糖苷酶UAP內(nèi)切酶連接酶外切酶修復(fù)