醫(yī)學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)-教案教程文件

醫(yī)學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)-教

案

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《醫(yī)學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》教案

第1次課2學(xué)時

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)測定還原糖

實(shí)驗(yàn)性質(zhì)設(shè)計性實(shí)驗(yàn)

1、了解糖的還原性

教學(xué)目的和

2、掌握還原糖定量測定的原理和方法。

要求

3、熟悉分光光度計的使用方法。

教學(xué)重點(diǎn)與重點(diǎn):繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，分光光度計的使用原理和使用方法。

難點(diǎn)難點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線的應(yīng)用。

1試.劑

(1)Img/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取干燥恒重的葡萄糖lOOmg,加少

量蒸僧水溶解后，以蒸儲水定容至100mL,即含葡萄糖為1.0mg/mL。

(2)3,5-二硝基水楊酸試劑：稱取6.3g3,5-二硝基水楊酸并量取262

mL2mol/LNaOH加到酒石酸鉀納的熱溶液中(182g酒石酸鉀納溶于500

mL水中)，再加5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸氫鈉溶于其中，攪拌溶解，冷卻

實(shí)驗(yàn)材料

后定容到1000mL貯于棕色瓶中。

(3)未知濃度還原糖。

2材.料

小麥淀粉或玉米淀粉。

3器.材

分光光度計，天平，水浴鍋，電爐，試管若干等。

一、實(shí)驗(yàn)原理★:在NaOH和丙三醇存在下，3,5-二硝基水楊酸(DNS)

與還原糖共熱后被還原生成氨基化合物。在過量的NaOH堿性溶液中此化

合物呈桔紅色，在540nm波長處有最大吸收，在一定的濃度范圍內(nèi)，還原

糖的量與光吸收值呈線性關(guān)系，利用比色法可測定樣品中的含糖量。

OHNO2OHNH2

HOOC^^S>+還原糖—-HOOC—

NO2NO2

(DNS)(3-氨基一5一硝基水楊酸)？

黃色桔紅色

二、實(shí)驗(yàn)步驟：

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.取7支具塞刻度試管編號，按表1分別加入濃度為Img/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、蒸僧

水和DNS試劑，配成不同濃度的葡萄糖反應(yīng)液。

表1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

竹且lmg/ml葡萄糖蒸儲水DNS葡萄糖含光密度值(OD.

標(biāo)準(zhǔn)液(mL)⑥(_)(mL)量(mg)540nm)

100.50.50

20.10.40.50.1

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30.20.30.50.2

40.30.20.50.3

50.40.10.50.4

60.500.50.5

7（未知濃度還原

、0.500.50.5

格）

將各管搖勻，在沸水浴中準(zhǔn)確加熱5min取出，冷卻至室溫，用蒸儲水補(bǔ)足至

5mL,加塞后顛倒混勻，在分光光度計上進(jìn)行比色。調(diào)波長540nm,用1號管調(diào)零

點(diǎn)，分別測出2~6號管的光密度值。

2.繪制標(biāo)曲▲

以光密度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量(mg)為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(電腦

Excel完成最好)。計算7號管還原糖的百分含量。

三、結(jié)果與計算▲:

計算出7號管光密度值的平均值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上分別查出相應(yīng)的還原糖毫克數(shù)，

按下式計算出樣品中還原糖和總糖的百分含量。

查曲線所得葡萄糖毫克數(shù)X提取液總體積/測定時取用體積

還原糖(%)=X

100%

樣品毫克數(shù)

教學(xué)過程中師生活動設(shè)計

糖的還原性，具有還原性的糖結(jié)構(gòu)有何特點(diǎn)？

提綱、板書設(shè)計

實(shí)驗(yàn)原理及反應(yīng)方程式，實(shí)驗(yàn)步驟中表1及計算公式

1、為什么要設(shè)置空白對照？

作業(yè)

2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的定義？

主要[1]《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》，何幼鸞、湯文浩，華師出版社，2013

參考資料[2]《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》，董曉燕主編，化學(xué)工業(yè)出版社，2010

1、讓學(xué)生理解糖定量測定的原理及方法；

總結(jié)分析2、強(qiáng)調(diào)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制要點(diǎn)；

3、需要和學(xué)生一起推導(dǎo)還原糖濃度的公式

《醫(yī)學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》教案

第2次課2學(xué)時

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實(shí)驗(yàn)項(xiàng)

糖的呈色反應(yīng)和還原糖檢驗(yàn)

目

實(shí)驗(yàn)性

驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

質(zhì)

教學(xué)目1.了解糖類某些顏色反應(yīng)的原理

的和要2.學(xué)習(xí)應(yīng)用糖的顏色反應(yīng)鑒別糖類的方法

求

教學(xué)重重點(diǎn)：顏色反應(yīng)鑒別糖的方法

點(diǎn)與難難點(diǎn)：鑒別糖的反應(yīng)原理

點(diǎn)

1、儀器：試管及試管架、滴管、移液管及恒溫水浴鍋

實(shí)驗(yàn)材

2、試劑：莫氏試劑、塞氏試劑、托倫試劑；1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶

料

液、1%果糖溶液、1%阿拉伯糖溶液、1%半乳糖溶液

一、實(shí)驗(yàn)原理★:

a—蔡酚反應(yīng)：糖在濃無機(jī)鹽作用下，脫水生成糠醛衍生物，后者在濃硫

酸的作用下能與a—蔡酚生成紫紅色物質(zhì)，在糖液面與濃硫酸液面間出現(xiàn)紫色

環(huán)。但一些非糖物質(zhì)對此反應(yīng)也呈陽性

間苯二酚反應(yīng)：在酸作用下，酮糖脫水生成羥甲基醛，后者可與間苯二酚

作用生成紅色物質(zhì)。此反應(yīng)是酮糖的特異反應(yīng)。醛糖在同樣條件下呈色反應(yīng)

慢。

托倫反應(yīng)：戊糖在濃酸作用下脫水生成糠醛，后者可與間苯三酚結(jié)合生成

櫻桃紅色物質(zhì)。本反應(yīng)常用來鑒定戊糖，戊糖此反應(yīng)最快，可以和其他糖類區(qū)

分。

二、操作步驟▲:

a—蔡酚反應(yīng)：先取3支試管，分別加入1%葡萄糖溶液、1%淀粉溶液、1%蔗糖溶液，然

實(shí)驗(yàn)內(nèi)后向3支試管中各加入2滴莫氏試劑，混勻。另外取1支試管，只加2滴莫氏試劑作為空

容白對照，傾斜4支試管，沿各試管壁緩慢加入濃硫酸約1.5mL,慢慢立起試管，切勿搖

動。試管中液體分成兩層，濃硫酸在試液下面。在兩液分界處有紫紅色環(huán)出現(xiàn)。觀察、記

錄各管顏色。

間苯二酚反應(yīng)：取3支試管，分別加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%果糖溶液

各0.5mL。再向各管分別加入塞氏試劑2.5mL,混勻。將3支試管同時置于沸水浴中，注

意觀察顏色的變化及變化時間。

托倫反應(yīng)：取3支試管，分別加入1%阿拉伯糖溶液、1%半乳糖溶液、1%葡萄糖溶

液各0.1mL,再向各管分別加入托倫試劑1mL,混勻。將3支試管同時置于沸水浴中，

觀察、記錄顏色的變化及顏?zhàn)兓臅r間。

教學(xué)過程中師生活動設(shè)計

觀察和記錄各管顏色及顏色變化的時間后，說出各管顏色變化的原因。

提綱、板書設(shè)計

原理及操作步驟

1.簡述a—蔡酚反應(yīng)原理。

作業(yè)

2.可用何種顏色反應(yīng)鑒別酮糖存在。

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主要[1]《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》，何幼鸞、湯文浩，華師出版社，2013

參考資[2]《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》，董曉燕主編，化學(xué)工業(yè)出版社，2010

料

總結(jié)分1、讓學(xué)生掌握糖顯色反應(yīng)的原理；

析2、給學(xué)生強(qiáng)調(diào)注意觀察各管顏色變化的時間

《醫(yī)學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》教案

第3次課2學(xué)時

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和沉淀反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)性質(zhì)基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)

1.了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)。

教學(xué)目的和

2學(xué).習(xí)測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的方法。

要求

3.了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系及沉淀蛋白質(zhì)的方法以及其實(shí)用意義。

重點(diǎn)：學(xué)習(xí)測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的方法及沉淀蛋白質(zhì)的方法。

教學(xué)重點(diǎn)

難點(diǎn)：蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系，沉淀的蛋白質(zhì)不一定表現(xiàn)為變性；變性

與難點(diǎn)

的蛋白質(zhì)不一定表現(xiàn)為沉淀。

（一）材料

新鮮雞蛋

（二）試劑

1、0.4%酪蛋白醋酸鈉溶液200mL

2、1.00mol/L醋酸溶液100mL

3、0.10mol/L醋酸溶液300mL

4、0.01mol/L醋酸溶液50mL

5、蛋白質(zhì)溶液500mL

5%卵清蛋白溶液或雞蛋清的水溶液（新鮮雞蛋清:水=1:9）

6、pH4.7醋酸一醋酸鈉的緩沖溶液100mL

實(shí)驗(yàn)材料7、3%硝酸銀溶液10mL

8、5%三氯乙酸溶液50mL

9、95%乙醇250mL

10、飽和硫酸鍍?nèi)芤?50mL

11、硫酸鏤結(jié)晶粉末10000mL

12、0.1mol/L鹽酸溶液300mL

13、0.1mol/L氫氧化鈉溶液300mL

14、0.05mol/L碳酸鈉溶液300mL

15、甲基紅溶液20mL

（三）器具

水浴鍋、溫度計、200mL錐形瓶、100mL容量瓶、吸管、試管及試管架

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.實(shí)驗(yàn)原理★:

蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在蛋白質(zhì)溶液中存在下列平衡：

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COOH

P

NH2

童白質(zhì)分子

COO-+七COO-+H.COOH

陰喜干鬃性離于陽離子

pH>pIpH=plpH<pl

最常用的方法是測其溶解度最低時的溶液pH值。

蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類。

（1）可逆的沉淀反應(yīng)

此時蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生顯著變化，除去引起沉淀的因素后，蛋

白質(zhì)的沉淀仍能溶解于原來溶劑中，并保持其天然性質(zhì)而不變性。如大多

數(shù)蛋白質(zhì)的鹽析作用或在低溫下用乙醇（或丙酮）短時間作用于蛋白質(zhì)。

提純蛋白質(zhì)時，常利用此類反應(yīng)。

（2）不可逆沉淀反應(yīng)

此時蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變，蛋白質(zhì)常變性而沉淀，不再溶

于原來溶劑中。加熱引起的蛋白質(zhì)沉淀與凝固。蛋白質(zhì)與重金屬離子或某

些有機(jī)酸的反應(yīng)都屬于此類。

蛋白質(zhì)變性后，有時由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在（如電荷），

并不析出。因此變性蛋白質(zhì)并不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未

必都已變性。

二、實(shí)驗(yàn)步驟：

（一）酪蛋白等電點(diǎn)的測定

（1）取同樣規(guī)格的試管4支，按下表順序分別精確地加入各試劑，然

后混勻。

蒸儲水0.01mol/Ldig

0.1mol/L蠟1.0mol/L

試管號（mL酸

酸(mL)蠟酸(mL)

）(mL)

18.40.6-—

28.7-0.3—

38.0-1.0—

47.4--1.6

（2）向以上試管中各加酪蛋白的醋酸鈉溶液1mL,加一管，搖勻一

管。此時1、2、3、4管的pH依次為5.9、5.5、4.7、3.5。觀察其混濁度。

靜置10分鐘后，再觀察其混濁度。最混濁的一管pH即為酪蛋白的等電

點(diǎn)。

（二）蛋白質(zhì)的沉淀及變性

1、蛋白質(zhì)的鹽析

無機(jī)鹽（硫酸鏤、硫酸鈉、氯化鈉等）的濃溶液能析出蛋白質(zhì)。鹽的濃

度不同，析出的蛋白質(zhì)也不同。

如球蛋白可在半飽和硫酸鏤溶液中析出，而清蛋白則在飽和硫酸鏤溶液

中才能析出。

由鹽析獲得的蛋白質(zhì)沉淀，當(dāng)降低其鹽類濃度時，又能再溶解，故蛋

白質(zhì)的鹽析作用是可逆過程。

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加蛋白質(zhì)溶液5mL于試管中，再加等量的飽和硫酸鏤溶液，混勻后靜

置數(shù)分鐘則析出球蛋白的沉淀。倒出少量混濁沉淀，加少量水，觀察是否

溶解，為什么？將管內(nèi)容物過濾，向?yàn)V液中添加硫酸鏤粉末到不再溶解為

止。此時析出沉淀為清蛋白。

取出部分清蛋白，加少量蒸儲水，觀察沉淀的再溶解。

2、重金屬有穹子沉淀蛋白質(zhì)：重金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶于水的復(fù)合

物。

取1支?或管，加入蛋白質(zhì)溶液2mL,再加3%硝酸銀溶液1一2滴，振

蕩試管，有沉淀產(chǎn)生。放置片刻，傾去上清液，向沉淀中加入少量的水，

沉淀是否溶解？為什么？

3、某些有方兒酸沉淀蛋白質(zhì)

取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2mL,再加入lmL5%三氯乙酸溶液，振

蕩試管，觀察沉淀的生成。放置片刻傾出清液，向沉淀中加入少量水，觀

察沉淀是否溶解。

4、有機(jī)溶?q」沉淀蛋白質(zhì)

取1支試管，加入2mL蛋白質(zhì)溶液，再加入2mL95%乙醇。觀察沉淀的

生成(如果沉淀不明顯，加點(diǎn)NaCl,混勻。

5、乙醇引聲G的變性與沉淀

取3支試,管，編號。依下表順序加入試劑：

試劑0.1mol/L

(mL蛋白質(zhì)0.1mol/LpH4.7緩

氫氧化鈉95%乙醇

)溶液鹽酸溶液沖溶液

管號溶液

1111

2111

3111

振搖混勻后，觀察各管有何變化。放置片刻向各管內(nèi)加入水8mL,然后

在第2,3-省管中各加一滴甲基紅，再分別用O.lmol/L醋酸溶液及

0.05mol/LE受酸鈉溶液中和之。觀察各管顏色的變化和沉淀的生成。每管再

加0.1mol/L鹽酸溶液數(shù)滴，觀察沉淀的再溶解。解釋各管發(fā)生的全部現(xiàn)

象。

教學(xué)過程中師生活動設(shè)計

蛋白質(zhì)沉淀原理，什么是蛋白質(zhì)變性？根據(jù)性質(zhì)推測其應(yīng)用

提綱、板書設(shè)計

原理及簡要操作步驟

1.什么是等電點(diǎn)？

作業(yè)2.臨床上為什么可以用蛋清或牛乳解救誤服金屬鹽的病人？

主要[1]《生物4匕學(xué)實(shí)驗(yàn)》，何幼鸞、湯文浩，華師出版社，2013

參考資料[2]《生物伙，學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》，王金亭，方俊主編，華中科技大學(xué)出版社，

2010

1、通過原土里分析，幫助學(xué)生理解“沉淀的蛋白質(zhì)不一定表現(xiàn)為變性；變性

總結(jié)分析的蛋白質(zhì)不一定表現(xiàn)為沉淀”；

2、重點(diǎn)區(qū)手山“可逆沉淀”與“不可逆沉淀”

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《醫(yī)學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》教案

第4次課2學(xué)時

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)蛋白質(zhì)和氨基酸顯色反應(yīng)

目

實(shí)驗(yàn)性基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)

質(zhì)

教學(xué)目1.學(xué)習(xí)和了解常用的幾種鑒定蛋白質(zhì)與氨基酸的方法。

的和要

求2.了解蛋白質(zhì)與氨基酸的顯色反應(yīng)原理。

教學(xué)重重點(diǎn)：蛋白質(zhì)與氨基酸的顯色反應(yīng)原理。

點(diǎn)與難難點(diǎn)：鑒定蛋白質(zhì)與氨基酸的方法。

八占、、

試劑:0.5%醋酸鉛1mL、10%NaOH、1%CUSO

實(shí)驗(yàn)材4

器具：水浴鍋、溫度計、200mL錐形瓶、100mL容量瓶、吸管、試管及試管

料

架

一、實(shí)驗(yàn)原理★:

1.雙縮服反應(yīng)（biuretreaction）

蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此

反應(yīng)稱為雙縮胭反應(yīng)，雙縮版反應(yīng)可用來檢測蛋白質(zhì)水解程度。

2.苯環(huán)的黃色反應(yīng)

Tyr（Trp）+濃硝酸一?黃色

Phe+少量濃硫酸+濃硝酸一>黃色

3.醋酸鉛反應(yīng)（半胱氨酸和胱氨酸）

R-SH+2NaOH-?R-OH+Na2S+H2O

Na2s+Pb2+―>PbS+2Na+

PbS+2HCl—?PbCb+H2s

二、實(shí)驗(yàn)步驟▲:

實(shí)驗(yàn)內(nèi)1.雙縮股反應(yīng)（biuretreaction）

容取1支試管，加乳蛋白溶液（蛋清冰=1:9）約1mL和10%NaOH約2mL,

搖勻，再加l%CuSCU溶液2滴，隨加隨搖。觀察現(xiàn)象，記錄。

2.苯環(huán)的黃色反應(yīng)

問6個試營中按卜表力口試劑，觀祭現(xiàn)象開記求。雞蛋清溶液（蚩清:水=1:9）

管號123456

材料雞蛋清指甲頭發(fā)0.5%苯酚0.3%色氨酸0.3%酪氨酸

液

（滴）4少許少許444

濃硝酸22020444

（滴）

現(xiàn)象

逐滴加

10%NaOH

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后現(xiàn)象變

化

3.醋酸鉛反應(yīng)

0.5%醋酸鉛1mL、10%NaOHlmL、卵清蛋白1mL三樣試劑混勻加熱，觀

察現(xiàn)象。然后冷卻至20~30℃,加10滴濃HCL,再將濕潤的醋酸鉛試紙放于

管口，加熱，嗅其氣味同時觀察試紙顏色變化。

教學(xué)過程中師生活動設(shè)計

含苯環(huán)的氨基酸有哪些？雙縮版反應(yīng)顏色與什么相關(guān)？

提綱、板書設(shè)計

原理及簡要操作步驟

1.在實(shí)驗(yàn)室如何區(qū)分核酸和蛋白質(zhì)？

作業(yè)

2.黃色反應(yīng)中為何會出現(xiàn)深淺不一的黃色？

主要[1]《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》，何幼鸞、湯文浩，華師出版社，2013

參考資

[2]《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》，王金亭，方俊主編，華中科技大學(xué)出版社，2010

料

總結(jié)分1、實(shí)驗(yàn)過程中讓學(xué)生重點(diǎn)觀察顏色變化的過程；

析2、醋酸鉛反應(yīng)的每一步都要記錄現(xiàn)象

《醫(yī)學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》教案

第5次課2學(xué)時

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)糖的薄層層析

目

實(shí)驗(yàn)性基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)

質(zhì)

教學(xué)目1.了解薄層層析的基本原理。

的和要2.熟悉薄層層析的操作過程。

求

教學(xué)重重點(diǎn)：掌握薄層層析的吸附原理。

點(diǎn)與難難點(diǎn)：掌握分配系數(shù)，Rf值。

/占、、、

實(shí)驗(yàn)材

四種糖樣品、染色液、擴(kuò)展劑、層析缸、層析板等

料

一、實(shí)驗(yàn)原理★:

薄層層析（簡稱TLC）是在吸附層析基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種微量而快速的層析

法，它是在吸附劑或支持劑均勻涂布的薄層上進(jìn)行的，故稱薄層層析。為了使所

實(shí)驗(yàn)內(nèi)要分析的樣品各組分得到分離，必須選擇合適的吸附劑。硅膠、氧化鋁和聚酰胺

容是廣泛采用的吸附劑，在吸附劑或支持劑中添加合適的粘合劑后再涂布，可使薄

層緊貼在玻璃板上。

糖是多羥基化合物在硅膠G薄層上展層時，被吸附的強(qiáng)弱有差異，同時在

展開劑中溶解性質(zhì)也有差異。吸附力主要與糖的相對分子質(zhì)量和羥基數(shù)有關(guān)，一

般為三糖〉二糖〉單糖，醛糖〉酮糖〉脫氧糖。經(jīng)過適當(dāng)?shù)娜軇┱归_后，糖在薄

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板上的移動速度是戊糖〉己糖〉雙糖〉三糖。

薄層層析與其他方法比有明顯的優(yōu)點(diǎn)：層析時間短、樣品用量范圍大(1圈-

0.5g)、觀察結(jié)果方便、可以分離多種化合物等，其靈敏度比紙層析高10-100

倍，顯色方法甚至可以用腐蝕性顯色劑。而且薄層層析法操作方便，設(shè)備簡單，

所以薄層層析法目前應(yīng)用范圍相當(dāng)廣泛。

二、實(shí)驗(yàn)步驟▲:

1.點(diǎn)樣

選取制備好的薄板一塊，在距底邊1.5cm的直線上均勻選4個點(diǎn)。用毛細(xì)管

分別點(diǎn)上不同的糖樣品于4個點(diǎn)，樣品量控制在5-10隔，斑點(diǎn)直徑不超過

3mm。點(diǎn)樣完畢，立即用電熱吹風(fēng)機(jī)吹干樣點(diǎn)。

2.展層

將薄板置于盛有層析溶劑的層折缸中，自下向上展層，當(dāng)展層溶劑到達(dá)離薄

板頂端約1cm處時取出薄板，在溶劑前沿處作一記號，于80℃下烘干5min。

3.顯色

除盡溶劑后，向薄層板上噴霧糖顯色劑，于80℃下烘干lOmin,則各種糖分

別顯出不同的顏色。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果上?

(1)記下各斑點(diǎn)的位置、顏色，計算Rf值。

(2)鑒定混合糖中糖的種類，并繪出層析圖譜。

教學(xué)過程中師生活動設(shè)計

還有哪些層板方法？

提綱、板書設(shè)計

原理及簡要操作步驟

作業(yè)何謂Rf值？Rf值與什么因素有關(guān)？

《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》，董曉燕主編，化學(xué)工業(yè)出版社，

主要參[1]2010

⑵《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》，王金亭，方俊主編，華中科技大學(xué)出版社，

考資料2010

1、點(diǎn)樣是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，教師在指導(dǎo)學(xué)生操作時，強(qiáng)調(diào)點(diǎn)樣要輕、快，穩(wěn)、小

總結(jié)分

并且點(diǎn)樣點(diǎn)要集中；

析2、施展￡時，點(diǎn)儲點(diǎn)不要浸如展層溶液中

《醫(yī)學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》教案

第6次課2學(xué)時

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)酶的特性

目

實(shí)驗(yàn)性基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)

質(zhì)

教學(xué)目掌握酶促反應(yīng)速度的幾個主要影響因素

的和要了解淀粉水解程度的鑒定。

求

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教學(xué)重重點(diǎn)：唾液淀粉酶催化的酶促反應(yīng)；淀粉水解程度的判斷。

點(diǎn)與難難點(diǎn)：酶活性的影響因素。

點(diǎn)

儀器：水浴鍋、電爐、白瓷板、試管、量筒、漏斗、脫脂棉。

實(shí)驗(yàn)材

試劑：0.2%、0.5%淀粉液、0.3%NaCl、0.85%NaCl溶液、1%CUSC）4溶液、

料

l%Na2so4、pH=5.0、pH=8.0、pH=6.8緩沖溶液。

一、實(shí)驗(yàn)原理★:

溫度與酶促反應(yīng)速度關(guān)系密切。溫度降低時，酶促反應(yīng)速度降低以至完全

停止；隨著溫度升高，反應(yīng)速度逐漸加快。在某一溫度時反應(yīng)速度達(dá)到最大

值，此溫度稱酶作用的最適溫度。溫度繼續(xù)升高，反應(yīng)速度反而下降。人體內(nèi)

大多數(shù)酶的最適溫度在37℃左右。

pH值也會影響酶促反應(yīng)速度。因?yàn)槊副旧硎堑鞍踪|(zhì)，pH不僅影響酶蛋白分

子某些基團(tuán)的解離，也影響底物的解離程度，從而影響酶與底物的結(jié)合。當(dāng)酶

促反應(yīng)速度達(dá)到最大值時的溶液pH值，稱為該酶的最適pH。不同的酶最適

pH值不盡相同，人體多數(shù)酶的最適pH值在7.0左右。例如唾液淀粉酶的最適

pH值為6.8。

凡是能夠提高酶活性，加快酶促反應(yīng)速度的物質(zhì)都稱為酶的激活劑。例如

cr是唾液淀粉酶的激活劑。

凡是能夠降低酶的活性，使酶促反應(yīng)速度減慢，又不使酶變性的物質(zhì)稱為

酶的抑制劑。例如C/+是唾液淀粉酶的抑制劑。

在不同溫度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度不同，可由水解混合物遇碘顯

現(xiàn)的顏色不同來判斷：

淀粉（藍(lán)色）f紅色糊精（紅色）一無色糊精（不顯色）+麥芽糖（不顯色）〉葡萄糖

實(shí)驗(yàn)內(nèi)（不顯色）

容二、實(shí)驗(yàn)步驟：

1.制備稀釋50倍的唾液淀粉酶：用蒸儲水漱口清除食物殘渣，再含一口蒸儲水

一分鐘

后使其流入量筒并稀釋50倍，混勻備用。

2溫.度對酶促反應(yīng)速度影響實(shí)驗(yàn)

（1）取試管3支，編號，各管按下表依次加入各種試劑。

__________溫度對酶促反應(yīng)速度影響實(shí)驗(yàn)加樣表

管號123__________________

0.1%淀粉溶液（mL）1.51.51.5

稀釋唾液（ml）111

煮沸唾液一一1

搖勻

水浴溫度37℃0℃37℃____________

（2）水浴8min后，向各管中各滴加1滴KI-L溶液，混勻，觀察各管顏色并

解釋結(jié)果上

3.pH對酶促反應(yīng)速度的影響實(shí)驗(yàn)

（1）取試管3支，編號，按下表依次加入各種試劑。

______________pH對酶促反應(yīng)速度影響實(shí)驗(yàn)加樣表________

管號123

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0.2%淀粉液(mL)222

PH5.0緩沖液(mL)3——

PH6.8緩沖液(mL)—3

PH8.0緩沖液(mL)——3

稀釋唾液酶(mL)222

(2)混勻后，將各管置于37℃水浴5分鐘后，取2號管中混合液1滴于點(diǎn)滴

板上，加1滴KI-L溶液顯色，以檢驗(yàn)淀粉的水解程度。若不是棕黃色，則繼

續(xù)保溫，然后每隔Imin繼續(xù)取2號管的混合液1滴于點(diǎn)滴板上，加1滴KI-L

溶液顯色，直至變成棕黃色時，向所有試管內(nèi)依次滴加2滴KI-b溶液顯色。

觀察各管顏色并解釋結(jié)果

4.激活劑和抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響

(1)取試管4支，編號，按下表依次加入各種試劑。

激活劑和抑制劑對酶促反應(yīng)速度影響實(shí)驗(yàn)加樣表

管號1234

0.1%淀粉液(mL)1.51.51.51.5

l%NaCl溶液(mL)2———

1%Na2s04溶液(mL)—2

1%CUSO4溶液(mL)——2

蒸儲水(mL)———2

稀釋唾液酶(mL)0.50.50.50.5

(2)混勻后，將各管置于37c水浴8分鐘后，取1號管中混合液1滴于點(diǎn)滴

板上，加1滴KI%溶液顯色，以檢驗(yàn)淀粉的水解程度。若不是棕黃色，則繼

續(xù)保溫，然后每隔Imin繼續(xù)取1號管的混合液1滴于點(diǎn)滴板上，加1滴KI-I2

溶液顯色，直至變成棕黃色時，向所有試管依次滴加1滴KI-I2溶液顯色。觀

察各管顏色并解釋結(jié)果

教學(xué)過程中師生活動設(shè)計

隨著淀粉水解，為什么與碘有顏色反應(yīng)變化？

提綱、板書設(shè)計

原理及簡要操作步驟

1在作離子對酶活的影響時3、4號管有何作用？

2.在激活劑和抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響實(shí)驗(yàn)中如何證明cr是唾液淀粉酶的

作業(yè)

激活劑？

3.酶的抑制劑與變性劑有何區(qū)別？

主要參[1]《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》，董曉燕主編，化學(xué)工業(yè)出版社，2010

考資料[2]《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》，王金亭，方俊主編，華中科技大學(xué)出版社，2010

1、對照實(shí)驗(yàn)要注意同步性；

總結(jié)分

2、不同人的唾液淀粉酶活性不盡相同，讓學(xué)生注意到樣本差異；

析

3、重點(diǎn)分析激活劑和抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響

《醫(yī)學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》教案

第7次課2學(xué)時

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實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目Folin-酚試劑法測蛋白質(zhì)濃度

實(shí)驗(yàn)性質(zhì)綜合性實(shí)驗(yàn)

教學(xué)目的1.學(xué)習(xí)會用Folin-酚試劑法測蛋白質(zhì)濃度的方法。

和要求2.鞏固分光光度計的使用。

教學(xué)重點(diǎn)1、重點(diǎn)：分光光度計的使用

與難點(diǎn)2、難點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

試劑：標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，F(xiàn)olin-酚試劑，樣品液蛋白質(zhì)

實(shí)驗(yàn)材料

器材：分光光度計、恒溫水浴鍋、試管、移液管

一、實(shí)驗(yàn)原理支

Folin-酚試劑法測蛋白質(zhì)濃度的顯色原理與雙縮胭方法是相同的，只是加入了第

二種試劑，即Folin-酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這

兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成

復(fù)合物。Folin-酚試劑中的磷鋁酸鹽-磷鴇酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基

還原，產(chǎn)生深蘭色（鑰蘭和鴇蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的

量成正比。

二、實(shí)驗(yàn)步驟上

1.曲線的測定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩

組，分別加入0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（濃度為

250mg/ml）。用水補(bǔ)足到1.0毫升，然后每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合

器上迅速混合，于室溫（20?25℃）放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙

（Folin-酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會使顯色程度減弱。

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照，于

700nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫座標(biāo)，吸光度值為縱座

標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.樣品的測定：取1毫升樣品溶液（其中約含蛋白質(zhì)20~250微克），按上述方法進(jìn)

行操作，取1毫升蒸儲水代替樣品作為空白對照。通常樣品的測定也可與標(biāo)準(zhǔn)曲線

的測定放在一起，同時進(jìn)行。即在標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的各試管后面，再增加3個試管。

如上表中的8、9、10試管。

根據(jù)所測樣品的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量，從而計算出樣

品溶液的蛋白質(zhì)濃度

教學(xué)過程中師生活動設(shè)計

測定蛋白質(zhì)濃度其他方法有哪些？

提綱、板書設(shè)計

原理及簡要操作步驟

作業(yè)簡述Folin-酚試劑法比較其他蛋白質(zhì)測定方法的優(yōu)點(diǎn)。

主要[1]《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》，何幼鸞、湯文浩，華師出版社，2013

參考資料[2]《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》，董曉燕主編，化學(xué)工業(yè)出版社，2010

1、強(qiáng)調(diào)Folin-酚試劑法測蛋白質(zhì)濃度的顯色原理；

總結(jié)分析

2、鞏固分光光度計的使用

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《醫(yī)學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》教案

第8次課2學(xué)時

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)血清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳

目

實(shí)驗(yàn)性基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)

質(zhì)

教學(xué)目1.了解電泳技術(shù)的一般原理。

的和要2.掌握醋酸纖維薄膜電泳的操作。

求

教學(xué)重重點(diǎn)：掌握醋酸纖維薄膜電泳的操作方法。

點(diǎn)與難難點(diǎn)：電泳技術(shù)的原理。

點(diǎn)

器材：DYY-HI6型常壓電泳儀、醋酸纖維薄膜（2cmx8cm）、.培養(yǎng)皿、蓋玻

片、濾紙、鏡子。

試齊

1.巴比妥緩沖液（pH8.6,離子強(qiáng)度0.07）：巴比妥2.76g,巴比妥鈉15.45g,用

實(shí)驗(yàn)材蒸儲水定容至1000mL。

料2.染色液：氨基黑10B0.25g,用甲醇50mL、冰醋酸10mL、水40mL溶解（可重

復(fù)使用）。

3.漂洗液:甲醇或乙醇45mL,冰醋酸5mL,水50mL,混勻。

4.透明液（僅在定量分析時使用）：無水乙醇7份，冰醋酸3份，混勻。

一、實(shí)驗(yàn)原理★:

電泳是帶電顆粒在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象。醋酸

纖維薄膜電泳（CAME）是一種區(qū)帶電泳技術(shù)，將血清樣品點(diǎn)樣于醋纖膜上，在

pH8.6的緩沖液中電泳時，血清蛋白質(zhì)均帶負(fù)電荷移向正極。由于血清中各蛋

白組分等電點(diǎn)不同而致表面凈電荷量不等，加之分子大小和形狀各異，因而電泳

遷移率不同，彼此得以分離。

影響電泳遷移率的外界因素：電場強(qiáng)度、溶液的pH值、溶液的離子強(qiáng)度和電

滲現(xiàn)象。

影響電泳遷移率的內(nèi)在因素：質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷的量、質(zhì)點(diǎn)的大小和形狀。

實(shí)驗(yàn)內(nèi)

本實(shí)驗(yàn)以醋酸纖維素為電泳支持物，它是纖維素的羥基乙酰化所形成的纖維

容

素醋酸酯，將它溶于有機(jī)溶劑（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂

抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結(jié)構(gòu)，厚度約

為120nm,有很強(qiáng)的通透性，對分子移動阻力很小。醋酸纖維素薄膜電泳具有

微量、快速、簡便、分辨力高，對樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)中用于電泳分離各種血清蛋白。血清中含有清蛋白、a-球蛋白、p-球

蛋白、丫-球蛋白和各種脂蛋白等，各種蛋白質(zhì)在電場中的遷移速度不同。正常人

血清在pH8.6的緩沖體系中電泳，染色后可顯示5條區(qū)帶。其中清蛋白的泳動速

度最快，其余依次為al-、a2-、（3-及y-球蛋白。

二、實(shí)驗(yàn)步驟：1）預(yù)處理；2）點(diǎn)樣：3）電泳；4）染色；5）漂洗，吸干。

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1預(yù).處理：用鏡子取醋酸纖維薄膜2張，識別出光澤面與粗糙面，將粗糙面朝上

放在電泳槽中的緩沖液中浸泡20mino

2點(diǎn).樣：事先用點(diǎn)樣器在濾紙上點(diǎn)幾個樣，熟悉一下點(diǎn)樣器的用法。然后把膜條

從緩沖液中取出，夾在兩層濾紙內(nèi)用手指快速捋一下，以吸干表面多余的液體，

隨即將粗糙面朝上平鋪在玻璃板上。注意，切勿將膜條長時間放在濾紙上，以免

膜條中的緩沖液過度吸出。用蓋玻片蘸一點(diǎn)血清，使血清均勻地分布在蓋玻片切

面。將蓋玻片在膜條一端2~3cm處輕輕地垂直落下并隨即提起，這樣即在膜條上

點(diǎn)上了細(xì)條狀的血清樣品，每張膜點(diǎn)一個樣。（要求：輕、勻、直、細(xì)）

3.電泳：預(yù)先要在電泳槽內(nèi)加入緩沖液，使兩個電極槽內(nèi)的液面等高，做好濾

紙橋。用鑲子將膜條平懸于電泳槽支架的濾紙橋上，要平直。膜條光面朝上，點(diǎn)

樣端靠近負(fù)極、且懸空（可用鏡子再將膜條兩端壓服帖一些）。蓋嚴(yán)電泳室，檢

查一下電泳槽和穩(wěn)壓電源是否已經(jīng)連接好。通電，調(diào)節(jié)電壓至110V,電泳時間

約為30min。

4.染色：電泳完畢后，關(guān)上電源開關(guān)，用鏡子將薄膜條取下并放在裝有染色液

的培養(yǎng)皿中浸泡3~4min（注意蓋好培養(yǎng)皿的蓋子，以免溶劑揮發(fā)）。

5.漂洗：將膜條從染色液中取出，在培養(yǎng)皿的邊緣上瀝去表面多余的染色液，

依次放入裝有漂洗液的培養(yǎng)皿（共有2套）中漂洗2次（未漂洗時注意蓋好培養(yǎng)皿

的蓋子，以免溶劑揮發(fā)），至色帶清晰的電泳圖譜。

三、分析結(jié)果▲:

實(shí)驗(yàn)采用小牛血清故出現(xiàn)三條色帶：清蛋白；四球蛋白；aa球蛋白，且清蛋

白顏色最深。

（本實(shí)驗(yàn)由于時間有限，授課時間安排首先由教師簡單講解實(shí)驗(yàn)步驟并向?qū)W生演

示操作方法后指導(dǎo)學(xué)生操作，在電泳的30min里教師給學(xué)生詳盡講解實(shí)驗(yàn)原理，

操作步驟及其注意事項(xiàng)。）

教學(xué)過程中師生活動設(shè)計

蛋白質(zhì)顆粒為什么能電泳？依據(jù)什么性質(zhì)？

提綱、板書設(shè)計

原理及簡要操作步驟

1電.泳時，醋酸纖維薄膜點(diǎn)樣的一端應(yīng)靠近哪一極？為什么？

作業(yè)2血.清醋酸纖維薄膜電泳可將血清蛋白依次分為哪幾條區(qū)帶？

主要[1]《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》，何幼鸞、湯文浩，華師出版社，2013

參考資[2]《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》，董曉燕主編，化學(xué)工業(yè)出版社，2010

料

1、需要強(qiáng)調(diào)點(diǎn)樣方法，避免點(diǎn)樣過多，重復(fù)點(diǎn)樣等；

總結(jié)分

2、重點(diǎn)講解遷移速率的因素；

析

3、結(jié)合血清電泳在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用，便于學(xué)生更好的理解

《醫(yī)學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》教案

第9次課2學(xué)時

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)血清ALT活性測定

目

實(shí)驗(yàn)性綜合性實(shí)驗(yàn)

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質(zhì)

教學(xué)目掌握血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測定的基本原理、具體操作方法

的和要了解其臨床意義。

求

教學(xué)重重點(diǎn)：血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測定的原理。

點(diǎn)與難難點(diǎn)：血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測定的方法。

點(diǎn)

試劑：O.lmol/L磷酸鹽緩沖溶液、0.4mol/L氫氧化鈉溶液、lmol/L氫氧化鈉溶液、ALT底

實(shí)驗(yàn)材

物液、2,4-二硝基苯肺溶液、丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液。

料

材料：分光光度計、恒溫水浴鍋、試管、移液管、容量瓶、量筒。

一、實(shí)驗(yàn)原理★:

丙酮酸可與2,4-二硝基苯腫在酸性溶液中反應(yīng)形成相應(yīng)的2,4-二硝基苯腺，呈黃

色，后者在堿性條件下呈紅棕色。通過測定其在520nm波長處的光吸收來了解丙酮酸的生

成量，借此測定血清ALT的活力，故該類方法又稱比色測定法。該法雖然也有缺點(diǎn)，但

操作簡便，不需要特殊儀器和試劑，故在臨床上被廣泛應(yīng)用。

★該法的單位定義是：每1mL血清在pH7.4,37c保溫條件下與底物作用30分鐘，每

生成2.5%丙酮酸為一個單位。人血清的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶正常值為2~40U?

二、實(shí)驗(yàn)步驟：

1.酶活反應(yīng)體系的配制

試劑測定管測定對照管(2)標(biāo)準(zhǔn)管標(biāo)準(zhǔn)對照管

(1)(3)(4)

ALT底物(mL)0.50.50.5

37度保溫5min(預(yù)熱，可略)

血清(mL)