第34章 DNA的復(fù)制和修復(fù)課件

第34章

DNA的復(fù)制和修復(fù)DNAReplicationandRepairDNAReplication第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

DNA復(fù)制

DNA修復(fù)合成

反轉(zhuǎn)錄DNA的體外復(fù)制：分子克?。≒CR）。DNA生物合成第一節(jié)

DNA的生物合成DNA生物合成的方式：第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-（一）.DNA半保留復(fù)制

1953年，Watson和Crick在提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型時，就推測DNA可能按照半保留機制進行自我復(fù)制。

1、半保留復(fù)制(semiconservativereplication)：

定義：DNA復(fù)制的一種方式，每條鏈都可用作合成互補鏈的模板，合成出兩分子的雙鏈DNA，每個分子都是由一條親代鏈和一條新合成的鏈組成。P408DNA復(fù)制具有兩個特點：（半保留復(fù)制）和（半不連續(xù)復(fù)制）

一、DNA復(fù)制第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-彌散式possiblecopyingmechanismOFDNADNA復(fù)制方式有三種可能性：全保留、半保留和分散式。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

2.

DNA半保留復(fù)制的證明(兩個)(1)

密度梯度離心

(重同位素標(biāo)記）1958年Meselson和Stahl采用重同位素15N作DNA標(biāo)記，同時可以否定另外兩種復(fù)制方式第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-密度梯度離心第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-(2)

放射性同位素自顯影?

1963年，Cairns設(shè)計了一個更為嚴謹?shù)膶嶒灐派渥燥@影的方法，進一步證實了DNA的半保留復(fù)制；?

1957年，Taylor的實驗證明，在真核生物中，DNA的復(fù)制也是半保留的 B:（雙鏈標(biāo)記）A和C:（單鏈標(biāo)記）H3-標(biāo)記的脫氧胸苷第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-?

單鏈DNA首先復(fù)制合成雙鏈的復(fù)制型（單鏈DNA復(fù)制時，通常先形成雙鏈復(fù)制型，再進行半保留復(fù)制）。

無論是復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或逆轉(zhuǎn)錄，在形成雙鏈螺旋分子時都是通過堿基配對來完成的。半保留復(fù)制非常普遍第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

DNA半保留復(fù)制的意義

意義：按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。是物種穩(wěn)定的分子基礎(chǔ)，但是相對的。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-1.設(shè)計實驗證明DNA是半保留復(fù)制

-2012大連理工大學(xué)生物化學(xué)2.

豬流感病毒HRN1是反轉(zhuǎn)錄病毒，試想出實驗方案以阻止病毒在細胞內(nèi)復(fù)制而不影響細胞內(nèi)DNA正常復(fù)制

-2012山東大學(xué)生物化學(xué)3.簡述MettewMeselson和FranklinStahl設(shè)計了一個什么樣的實驗,證實DNA的復(fù)制是半保留復(fù)制思考題華東師范大學(xué)2007年生物化學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題2010年南開大學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-（二）、半不連續(xù)復(fù)制（P418）（1）DNA聚合酶只能在5`→3`方向延長DNA（2）DNA是反向雙螺旋

DNA聚合酶如何同時完成2條鏈的復(fù)制?

第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-半不連續(xù)復(fù)制

定義：

DNA一條鏈連續(xù)合成和另一條鏈不連續(xù)合成的復(fù)制方式,稱為DNA的半不連續(xù)復(fù)制。DNA聚合酶只能按5‘→3’方向催化合成DNA，不能催化3‘—5’方向合成,領(lǐng)頭鏈隨從鏈岡崎片段:引物第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-半不連續(xù)復(fù)制(續(xù)1)

領(lǐng)頭鏈:對應(yīng)3’—5‘的模板鏈，順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進行的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈。

隨從鏈:對應(yīng)5‘—3’的模板鏈，復(fù)制的方向與解鏈方向相反，復(fù)制不是連續(xù)延長，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為隨從鏈。

岡崎片段:隨從鏈中不連續(xù)的DNA片段稱為岡崎片段。

原核生物:

1000~2000個核苷酸，相當(dāng)于一個順反子真核生物:

100~200個核苷酸（相當(dāng)一個核小體）第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題1.

是非判斷題

DNA分子是由兩條鏈組成，其中一條鏈作為前導(dǎo)鏈的模板，另一條鏈作為后隨鏈的模板。

廈門大學(xué)2005年生物化學(xué)前導(dǎo)鏈和滯后鏈?zhǔn)轻槍δ硞€復(fù)制叉而言的第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

思考題（1）如何證明岡崎片斷的存在？（2）最初對岡崎片斷測定的實驗表明，其數(shù)量遠超過新合成

DNA的一半，好象兩條鏈都是不連續(xù)的，試分析原因？提示：（1）同位素標(biāo)記dNTP，經(jīng)過一段時間后終止合成，檢查發(fā)現(xiàn)標(biāo)記出現(xiàn)在小片段DNA上，且小片段

DNA分子量相同，數(shù)量較多。

（2）前導(dǎo)鏈會少量的dUMP摻入，后尿嘧啶堿基被切除形成AP位點，后該處磷酸二酯鍵打斷，部分核苷酸，水解，造成一個缺口，后被修復(fù)，該過程會產(chǎn)生一些類似岡崎片斷的DNA片段。P418第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-脫氧胸腺嘧啶核苷酸的合成：dUTP一旦形成就被轉(zhuǎn)化成dUMP

?dUTPase活性高低的影響？DNA復(fù)制DNA復(fù)制X第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-UUAAUUAA

解釋糖苷酶(ung)+其他酶U等被切除（如果糖苷酶失活ung-，結(jié)果會如何？）判斷：DNA聚合酶可以利用dUTP做底物。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

解釋UUdenature

糖苷酶-

ung–

dump片段越長,大約有一半的新生DNA為被脈沖標(biāo)記的岡奇片段AA

dut

–

dump片段越短dUTPase

DNA沒有U！第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

解釋E.colidUTPase，它能使

dUTP變成dUMP，dUMP是不能作為DNA合成的底物，這樣它就不再能加入DNA中。尿嘧啶N-糖苷酶（uracilN-glycosylase），它可以切斷混合尿苷的糖苷鍵，形成無Pu和Py位點（apurinicorapyrimidinic，AP），再由AP內(nèi)切酶在AP位點切出一個缺口，進一步進行切除修復(fù)。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-解釋(1)在dut-突變體（

dUTPase缺失）中岡崎片段比在dut+中為短。這是因為U摻入機會增加；(2)在

ung-

（尿嘧啶N-糖苷酶缺失）突變體中，新合成的DNA約有一半由片段組成。(3)

因為尿嘧啶N-糖苷酶缺失，不會切除U的糖苷鏈，也就不會出現(xiàn)AP位點，所以堿沉淀時不易斷裂，從而保持了半不連續(xù)的原貌。在dut-,ung-雙突變體中，結(jié)果和實驗（2）相同，更進一步證實了此推測。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題1.細胞DNA復(fù)制是半不連續(xù)的，這是因為：

A.DNA聚合酶只能從3→5合成DNA鏈

B.模板雙鏈?zhǔn)欠雌叫械?/p>

C.DNA聚合酶只能一個一個地加接核苷酸殘基

D.DNA酶法合成是個自發(fā)過程

南開大學(xué)2006年生物化學(xué)2.論述半保留復(fù)制和半不連續(xù)復(fù)制的過程

2011年天津大學(xué)生物化學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題3.

DNA是以半保留方式進行復(fù)制的，如果放射性全標(biāo)記的雙鏈DNA分子在無放射性標(biāo)記的溶液中經(jīng)兩次復(fù)制，那么所產(chǎn)生的4個DNA分子其放射性狀況如何？A、兩個分子含有放射性；

B、全部含有放射性；C、雙鏈中各有一半含有放射性；D、所有分子的兩條鏈都沒有放射性。

華南理工大學(xué)2006年生物化學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題3.

DNA復(fù)制時候后隨鏈?zhǔn)菍槠?，為什么前?dǎo)鏈也是小片段

山東大學(xué)2010年生物化學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-二、DNA復(fù)制的起點和方式

復(fù)制子:基因組中可以獨立進行復(fù)制的單位，它包括DNA每條鏈的一個復(fù)制起點序列，可能還有一些終止序列。（復(fù)制在起始階段進行調(diào)控,一旦起始，將復(fù)制下去，直到完成）1、原核生物和病毒為單復(fù)制子，真核生物為多復(fù)制子P408第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題

岡崎片段不是一個復(fù)制子，其起點也非復(fù)制起點第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

復(fù)制的類型和方式

復(fù)制方向大多數(shù)是雙向的（等速進行或異速進行），形成兩個復(fù)制叉，少數(shù)是單向復(fù)制，形成一個復(fù)制叉。（1）、直線雙向復(fù)制

單點雙向：T7

多點雙向：真核染色體DNA（2）、θ型復(fù)制：環(huán)狀雙鏈DNA，單向或雙向（E.coli.）第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

復(fù)制的類型和方式第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

首先將E.coli染色體，切成1%染色體長度的片段，分別進行（分子雜交），后放射自顯影大腸桿菌OriC在liv位點P409

大腸桿菌復(fù)制起點：OriC（originof

Chromosomalreplication）2、復(fù)制往往具有一定的起點第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

復(fù)制的方向判斷

先低放射性再高放射性（3H-脫氧胸苷）P409第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DNA復(fù)制起點的特點（1）復(fù)制起點較保守富含AT，含一些反向重復(fù)序列（2）兩條鏈復(fù)制起點可以在不同的點上（如：D-環(huán)復(fù)制）（3）DNA復(fù)制的控制在起點控制，復(fù)制的速度決定于起始頻率（延伸的速度比較恒定，不決定于培養(yǎng)基狀況）DNA鏈的呼吸作用：DNA（復(fù)制原點處）氫鍵迅速斷裂與再生，導(dǎo)致兩條DNA鏈不斷解鏈與聚合，形成瞬間的單泡狀結(jié)構(gòu)的過程。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-判斷題1.通常DNA復(fù)制終止時并不需要特定的信號。(×)

中山大學(xué)2002年生物化學(xué)試題2.

真核生物DNA復(fù)制起點的序列專一性要低于細菌和病毒（×）.思考題第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-特殊的復(fù)制方式—滾環(huán)復(fù)制?

主要發(fā)生在病毒中,細菌F因子(Ffactor)；如φX174噬菌體

（單向復(fù)制？）?

在正鏈DNA上打開一個切口；?

以切口的3’-端為引物開始合成環(huán)鏈DNA的互補鏈，取代開環(huán)的鏈；3’-OHP410第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-滾環(huán)復(fù)制NOTE:cangetsingleunitgenomesormultimericcopies

單向復(fù)制

第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-復(fù)制的類型和方式—滾環(huán)復(fù)制E.coliphage(噬菌體）:ΦX174“Template“rolls”,extrudesleadingstrandOkazakifragsmadeonleadingstrandasitemerges.

單向復(fù)制

？第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

特殊的復(fù)制方式-D環(huán)復(fù)制D環(huán)復(fù)制：

線粒體、葉綠體DNA（不對稱復(fù)制，兩條鏈的復(fù)制起點不在同一點上，一條鏈先復(fù)制，另一條鏈保持單鏈而被取代：當(dāng)一條鏈復(fù)制到一定程度時才暴露出另一條鏈的復(fù)制起點，另一條鏈才開始復(fù)制，

（單向復(fù)制，全連續(xù)復(fù)制，沒有岡崎片段）

第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-?D-環(huán)擴充越過被取代鏈的復(fù)制起點；?被取代鏈啟動復(fù)制，方向與第一條鏈相反；?兩條鏈的合成沒有岡崎片斷單向復(fù)制，全連續(xù)復(fù)制

特殊的復(fù)制方式-D環(huán)復(fù)制第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

特殊的復(fù)制方式-2D環(huán)復(fù)制葉綠體DNA第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-復(fù)制的類型和方式—多復(fù)制叉復(fù)制

第一輪復(fù)制尚未完成，復(fù)制起點就開始第二輪的復(fù)制。

DNA復(fù)制時復(fù)制叉前進的速率比較恒定，DNA復(fù)制的速率實際上取決于起始頻率。

E.coli復(fù)制叉移動的速率約50Kb/min，復(fù)制一代約需40分鐘[4.2X106/（50KbX2）=42]。富營養(yǎng)時，可采取多復(fù)制叉復(fù)制方式，結(jié)果20min可以復(fù)制一代。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

真核生物DNA的復(fù)制

真核復(fù)制叉前進的速率約1000-3000bp/min，采用多復(fù)制子方式，真核染色體復(fù)制一代要6-8小時。

1.一條染色體上具有多個復(fù)制子，同一染色體上，各復(fù)制子長度不同。2.不同生長期，復(fù)制子數(shù)目不同。如果蠅，生長旺盛期，細胞快速分裂，復(fù)制子數(shù)目可擴增十倍。3.每個復(fù)制起點在每個復(fù)制周期中只啟動一次。4.

相鄰復(fù)制子的終點是隨機碰撞會合的。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-1.已知大腸桿菌在37攝氏度時雙向復(fù)制一次約需40分鐘，但在這些培養(yǎng)基內(nèi)，細菌分裂可達20分鐘一次，為什么？

中山大學(xué)2000年生物化學(xué)試題思考題2、名詞解釋：滾環(huán)復(fù)制2013山東大學(xué)3、判斷：滾環(huán)復(fù)制是噬菌體DNA

在細菌中最常用的一種復(fù)制方式2008南京大學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-4、滾滾環(huán)復(fù)制（BDE）

A、是細胞DNA的主要復(fù)制方式。

B、可以使復(fù)制子大量擴增。

C、產(chǎn)生的復(fù)制子總是雙鏈環(huán)狀拷貝。

D、是噬菌體DNA在細菌中最通常的一種復(fù)制方式。

E、復(fù)制子中編碼切口蛋白的基因的表達是自動調(diào)節(jié)的思考題第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-三、

DNA復(fù)制有關(guān)的酶及蛋白質(zhì)因子底物：dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP）模板（template）：解開成單鏈的DNA母鏈引物（primer）：提供3`-OH末端(體內(nèi)為RNA,體外為DNA,如PCR反應(yīng))酶及蛋白質(zhì)因子DNA聚合酶：依賴DNA的DNA聚合酶解鏈（解旋酶）類，單鏈結(jié)合蛋白引物酶，拓撲異構(gòu)酶

DNA連接酶（P410）第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

需4種dNTP（不是dNDP、dNMP、NTP）需DNA模板

需引物

(DNA、RNA)

5`→3`方向越長

（化學(xué)合成方向與此相反）

P413DNA聚合反應(yīng)和聚合酶

DNA+dNTP=DNA(n+1)+PPi第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-āαDNA聚合酶反應(yīng)的特點

DNA+dNTP=DNA-dNMP

+PPiɑ-磷酸dNTP第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題1.一個同學(xué)想研究DNA復(fù)制過程用放射性磷來標(biāo)記底物，他標(biāo)記的磷是第3位的磷，問是否能夠達到目的。

2012年山東大學(xué)生物化學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題2.

用放射性磷元素標(biāo)記dNTP的ɑ-磷酸，參與DNA合成，分離后用檢測其放射性以確定在合成過程中標(biāo)記核苷酸摻入的量1）、這一過程的化學(xué)原理2）、如只標(biāo)記一種dNTP放射性檢測結(jié)果會有什么不同3）、如果在加入時不小心漏加了一種核苷酸，對放射性的影響4）、如標(biāo)記其它位置的磷元素結(jié)果如何。

2012年山東大學(xué)生物化學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

2.

大腸桿菌的DNA聚合酶DNA聚合酶：

DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢDNA-polⅣDNA-polⅤ

依賴DNA的DNA聚合酶（DNAdependentDNApolymerase）或DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶（DNA-directedDNApolymerase），均縮寫為DDDP。（P414）第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

（1）.大腸桿菌的DNA聚合酶

I

單鏈球狀蛋白，含鋅原子，多功能酶。①5`→

3`DNA聚合酶活力（使DNA鏈從5→3方向延長）②3→

5

核酸外切酶活力，起校正功能；③5→

3

核酸外切酶活力，切除引物或修復(fù)由紫外線照射而形成的嘧啶二聚體；④聚合反應(yīng)的逆反應(yīng)（由3`端焦磷酸解）

DNA+dNTP=DNA-dNMP

+PPi第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

DNA復(fù)制過程中堿基對受雙重校對（DNA聚合酶選擇作用）（3`→5`外切酶的校對作用）DNA聚合酶的右手裝結(jié)構(gòu)沒有校對作用的錯誤率：10-5，有校對作用的錯誤率5x10-7第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

3'→5'外切酶活性——校對作用某些T4噬菌體突變株中DNA復(fù)制的真實性降低，而易發(fā)生突變，從此突變株分離得到的T4DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性很低，起著促突變因子的作用。相反，另外一些具有抗突變能力的T4突變株中的T4DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA復(fù)制真實性好，變異率低。可見，3'→5'外切酶活性對DNA復(fù)制真實性的維持是十分重要的。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DNA聚合酶I的部分水解DNA-polⅠ木瓜蛋白酶N端C端小片段大片段/Klenow片段

53核酸外切酶活性

DNA聚合酶活性35

核酸外切酶活性（P414）第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DNA聚合酶

I的特點

Klenow片段(Klenowfragment)：

E.coliDNA聚合酶I經(jīng)部分水解生成的C末端605個氨基酸殘基片段。該片段保留了DNA聚合酶I的5`-3`聚合酶和3`-5`外切酶活性，

Klenow片段是實驗室合成DNA，進行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。

Sanger法（雙脫氧非）DNA測序中使用Klenow片段優(yōu)于全酶？最好使用沒有校對活性的酶？第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DNA聚合酶I的功能

遺傳學(xué)分析表明DNA聚合酶I復(fù)制速度慢，持續(xù)合成能力差，不是主要的復(fù)制酶，主要是參與引物切成或DNA的損傷修復(fù)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-（2）.大腸桿菌的DNA聚合酶Ⅱ

5′→3’聚合酶活性

3’→5′外切酶活性

無5’→3’外切酶活性它只是在無polI及polⅢ的情況下才起作用，其真正的功能也未完全清楚，可能在損傷修復(fù)中有特殊作用。在DNA聚合酶

I活性低的細菌中發(fā)現(xiàn),多亞基第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

(3).大腸桿菌的DNA聚合酶Ⅲ①結(jié)構(gòu)特點：含鋅原子

由10種亞基組成不對稱異源二聚體。核心酶（αεθ）

α亞基：5′→3′聚合酶活性

ε亞基：3′→5′外切酶活性和

堿基選擇功能，是復(fù)制保真性所必需

θ亞基:可能起組裝作用β亞基：夾穩(wěn)模板鏈并使酶沿模板鏈滑動,維持進行性γ-復(fù)合物：促進全酶組裝至模板及增強核心酶活性EpsilonTheta第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DNA聚合酶Ⅲ全酶功能：原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用的酶第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-大腸桿菌的三種DNA聚合酶小節(jié)催化DNA聚合，主要復(fù)制酶參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)修復(fù)合成、切除引物、填補空隙功能2040400分子數(shù)/細胞1011亞基數(shù)--+5

外切酶活性+++

5

外切酶活性+++5

聚合酶活性polIIIpolIIpolI突變后的致死性

可能？可能P414第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-（4）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ.

新近發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ，參與易錯鏈的修復(fù)。polIV:(encodedbydinBgene)

a)SOSrepairenzymeofdamagedDNApolV:(encodedbyumuD’2Cgene)a)SOSrepairenzymeofdamagedDNA第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

連接DNA鏈3

-OH末端和相鄰

DNA鏈5

-P末端，形成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成完整的鏈。反應(yīng)需要提供能量

能量：細菌的連接酶利用NAD+。

能量：動物和噬菌體的連接酶利用ATPP4173.

DNA連接酶（DNAligase）

第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-酶ATP(或NAD+)+酶ConnecttwoadjacentssDNAstrandsbyjoiningthe3′-OHofoneDNAstrandtothe5′-PofanotherDNAstrand.

DNA連接酶過程

P417共價催化共價的酶-AMP中間物第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-ThereactioncatalyzedbyDNAligase(1)NAD+或ATP將其腺苷?；D(zhuǎn)移到DNA連接酶的一個賴氨酸殘基的ε─氨基上形成共價的酶-AMP中間物，同時釋放出煙酰胺單核苷酸(NMN)或焦磷酸；(2)將酶-腺苷酸中間物上的AMP再轉(zhuǎn)移到DNA的5'-磷酸基端，形成一個焦磷酰衍生物，即DNA-腺苷酸;(3)被激活的5'-磷酰基端可以和DNA的3'-OH端反應(yīng)合成磷酸二酯鍵，同時釋放出AMP。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

細菌的連接酶只能連接堿基互補基礎(chǔ)上雙鏈中的單鏈缺口，不能連接單獨存在的DNA或RNA單鏈。若DNA兩股都有單鏈切口，只要缺口前后堿基互補也可連接

DNA連接酶在復(fù)制、DNA修復(fù)、重組、剪接中均起縫合缺口作用，是重要的工具酶之一。

DNA連接酶

第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-4.

引物酶

(primerase)（P419）

前導(dǎo)鏈只需要一個引物，滯后鏈需要多個引物引物為一小段RNA第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

引物酶(primerase)

DNA聚合酶不能發(fā)動新鏈的起始，只能催化鏈的延伸-DNA合成需要引物，復(fù)制的引物為一小段RNA,岡崎片斷的5’末端連接有小段RNA做引物,以提供自由的3’-OH，使子代DNA鏈能夠開始聚合。

∴(1)DNA合成除需要dNTP外，還需要(NTP)-引物需要，引物為RNA

(2)DNA復(fù)制需RNA聚合酶-（引物合成酶）,一種依賴DNA的RNA聚合酶第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-引物酶

?

引物酶對RNA聚合酶抑制劑不敏感，對利福平不敏感?引物酶,本身無活性,需組裝成引發(fā)體才能催化RNA引物的合成。大腸桿菌的引物酶：DnaG

合成引物50-100nt（長）真核生物的引物酶：DNA聚合酶a

合成引物10nt左右第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

DNA復(fù)制為什么要用引物？（為什么DNA聚合酶要用引物，RNA聚合酶不需要引物？為什么引物為RNA?）

⑴從模板復(fù)制最初幾個核酸時，堿基堆集力和氫鍵都較弱，易發(fā)生錯配

⑵新復(fù)制的最初幾個核苷酸，沒有與模板形成穩(wěn)定雙鏈，DNA聚合酶的3，→5，校對功能難發(fā)揮作用。

為什么需要引物第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-5.DNA復(fù)制的拓撲異構(gòu)性質(zhì)UnwoundParentalDuplexOver-Woundregion

天然DNA存在著負超螺旋，這對于DNA分子的解旋非常由利。但隨著復(fù)制的進行，復(fù)制叉前方的親代DNA會形成正超螺旋，然會積累巨大的張力，這種張力主要是通過DNA拓撲異構(gòu)酶作用消除的。P419第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DNA復(fù)制的拓撲異構(gòu)性質(zhì)拓撲異構(gòu)酶Ⅰ:(與轉(zhuǎn)錄有關(guān))切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。每一次催化作用可消除一個負超螺旋，L值增加1.反應(yīng)不需ATP拓撲異構(gòu)酶Ⅱ:(與復(fù)制有關(guān))切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子引入負超螺旋狀態(tài)。每次催化作用使L減少2，又稱促旋酶。（DNAtopoisomerase）第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-TypeItopoisomerases共價催化第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-TypeItopoisomerases共價催化第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-細菌中的旋轉(zhuǎn)酶細菌中稱為旋轉(zhuǎn)酶（gyrase)，屬于拓撲異構(gòu)酶Ⅱ引入負超螺旋狀態(tài)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-Topoisomerasesasdrugtargets:

BecausedividingcellsrequiregreatertopoisomeraseactivityduetoincreasedDNAsynthesis,topoisomeraseinhibitorsareusedaschemotherapeuticagents.Camptothecin(喜樹堿)--TopoIinhibitorDoxorubicin(阿霉素或多柔比星)--TopoIIinhibitor

ThesedrugsactbystablilzingtheDNA-Topoisomerasecomplex.Also,someantibioticsareinhibitorsofthebacterial-specifictoposisomeraseDNAgyrasee.g.ciprofloxacin喹諾酮類

殺菌與抗癌第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-6.

DNA解螺旋酶（解旋酶，解鏈酶）?

解鏈酶依賴于單鏈DNA，對單鏈DNA親和力強?

解旋過程消耗ATP：2ATP/bp；具有ATPase活性

DnaB

蛋白在后隨鏈模板沿5’→3’移動；?

Rep蛋白或PriA

蛋白沿前導(dǎo)鏈模板

3’→5’移動

DNA解螺旋酶（解旋酶）不是拓撲異構(gòu)酶，細菌中拓撲異構(gòu)酶稱為旋轉(zhuǎn)酶P421第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-7.單鏈DNA結(jié)合蛋白

四聚體的蛋白；與DNA單鏈發(fā)生結(jié)合；

結(jié)合具有協(xié)同效應(yīng)穩(wěn)定DNA解鏈后的單鏈狀態(tài)，并保護核酸不被降解。使DNA的Tm下降真核生物中為Rp-A缺失會致死

SingleStrandDNABandingProtein(SSB)P421第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

四、原核生物DNA復(fù)制的過程復(fù)制過程分為：起始，延伸，終止三個基本步驟P421(一).

DNA復(fù)制的起始(initiation)

E.coli的復(fù)制起點OriC是決定和控制E.coli染色體復(fù)制的唯一片段。大腸桿菌的復(fù)制起點（OriC）第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

E.coli復(fù)制起始點—oriC的序列特征

E.coli的復(fù)制起點OriC中有二個復(fù)制必需區(qū)域：4個是9bp重復(fù)序列，能與起始蛋白DnaA特異結(jié)合，對于DNA復(fù)制的起始十分重要；3個是個連續(xù)出現(xiàn)的13bp序列，富含A和T，有利于雙螺旋DNA局部解旋并暴露兩條復(fù)制模板鏈。富含A和T第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-原核生物DNA復(fù)制起始的相關(guān)蛋白質(zhì)蛋白功能曾用名DnaA辨認復(fù)制起點

DnaB結(jié)合于DnaA,

提供解旋酶活性解螺旋酶DnaC與DnaB形成復(fù)合體

DnaG合成引物

引物酶

HU刺激起始，促進復(fù)合體形成

Gyrase解除正超螺旋，引入負超螺旋

旋轉(zhuǎn)酶

SSB穩(wěn)定單鏈DNA單鏈結(jié)合蛋白P422第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DNA復(fù)制的起始DnaBDnaGDnaC引發(fā)體(DnaB+DnaG)+ATPHU前引發(fā)復(fù)合物負超螺旋第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DNA復(fù)制的起始復(fù)制起始消耗ATP第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-復(fù)制的起始

復(fù)制的起始，要求DNA呈負超螺旋，這是因為DnaA只能與負超螺旋的DNA相結(jié)合，負超螺旋比正超螺旋有更好的模版作用。

復(fù)制的起始，要求起點附近的基因處于轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，RNA聚合酶對復(fù)制起始的作用，可能是因為其在起始點附近合成一段RNA，形成RNA突環(huán)，影響起點的結(jié)構(gòu)，因而有利于DnaA的作用．第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌DNA復(fù)制唯一一個受到調(diào)節(jié)的階段為起始階段，DNA的甲基化與細菌質(zhì)膜的的作用可以影響復(fù)制起始的時間，DNA復(fù)制的發(fā)動與DNA甲基化和細菌質(zhì)膜有關(guān)。大腸桿菌復(fù)制起點叫oriC，由245bp構(gòu)成，在oriC中有11個含4bp的回文序列“GATC”，Dam甲基化酶可使該序列中的A第6位N甲基化。

細菌DNA的復(fù)制調(diào)控發(fā)生在起始階段P422第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

細菌DNA的復(fù)制調(diào)控發(fā)生在起始階段oriC

的11個回文序列

半甲基化DNA不啟動復(fù)制，因為oriC與膜結(jié)合DNA全部復(fù)制完并延遲一定時間后，子鏈DNA被甲基化新一輪復(fù)制第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

2.復(fù)制的延伸DNA聚合酶IIIDNA聚合酶IIIDNA聚合酶III引物引物引物前導(dǎo)鏈：DNA旋轉(zhuǎn)酶，解螺旋酶，SSB，DNA聚合酶Ⅲ，焦磷酸酶第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

復(fù)制的延伸

前導(dǎo)鏈

(leadingstrand):以一條鏈(3′5′)為模板時,子代鏈的合成方向是5′3′,由引物酶在原點合成一條短RNA鏈，DNA多聚酶III結(jié)合于引物并加接脫氧核糖核苷酸殘基一旦合成開始,前導(dǎo)鏈的合成便連續(xù)地進行,緊跟著復(fù)制叉移動,合成是連續(xù)的.

隨后鏈

(laggingstrand):

以另一條親代鏈(5′3′)為模板時,子代鏈的合成方向5′3′滯后鏈的合成是不連續(xù)的以短的岡崎片斷的形式完成的,每合成一個岡崎片段都需起始一次,由引物酶合成一個引物.

第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

前導(dǎo)鏈合成一個引物,滯后鏈則合成許多岡崎片段的引物。在同一復(fù)制叉上，引物的合成前導(dǎo)鏈早于滯后鏈。引物第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-引物?

是短鏈RNA。（體外為PCR中DNA)?

長度一般：原核生物,10-60bp（長）真核生物,2-10bp(哺乳動物)

前導(dǎo)鏈引物長于滯后鏈岡崎片段引物?合成方向是5'→3'方向。?提供的3‘-OH，可在DNA-polⅢ催化下，利用dNTP

生成磷酸二酯鍵。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-后隨鏈的模板在全酶上繞轉(zhuǎn)180.形成一個小環(huán)

原核同一個DNA聚合酶III以二聚體形式在同一時間分別進行復(fù)制DNA前導(dǎo)鏈和滯后鏈。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-引發(fā)體(primosome)與引物合成

解鏈酶

DnaB有兩個功能,其一是解螺旋酶;另一是活化引物合成酶（DnaG）,與DnaG引物合成酶構(gòu)成一個基本功能單位,稱為引發(fā)體（DnaB+DnaG），合成引物。在某些噬菌體DNA的復(fù)制過程中,引發(fā)體還包括一些輔助蛋白。P423第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DNA復(fù)制的延伸

引發(fā)體方向移動（與引物或?qū)槠魏铣傻姆较蛘孟喾矗c復(fù)制叉移動的方向相同），移到一定位置上即可引發(fā)RNA引物的合成第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-岡崎片段的連接

岡崎片段的連接:在DNA聚合酶Ⅰ的催化下,除去RNA引物,同時催化DNA片段繼續(xù)延長至另一DNA片段的5'端，后在連接酶的催化下連接成完整的DNA分子。123第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-岡崎片段的連接切口平移DNA連接酶

DNApolIDNApolIIIDNApolIII

DNApolIDNA連接酶第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DNA切口平移所用的酶為（）。A、Klenow酶，B、Taq酶，C、DNA聚合酶ID、DNA連接酶NickTranslation（自學(xué)）切口平移中國科學(xué)院06年第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

拓撲異構(gòu)酶細菌領(lǐng)頭鏈和隨從鏈的延長差異前導(dǎo)鏈：DNA旋轉(zhuǎn)酶，解螺旋酶，SSB，DNA聚合酶Ⅲ，焦磷酸酶第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-細菌領(lǐng)頭鏈和隨從鏈的延長差異

前導(dǎo)鏈

滯后鏈前體dNTP:dATP,

dGTP,

dCTP,dTTPdNTP:dATP,dGTP,dCTP,dTTPNTP:ATP,GTP,CTP,UTP酶DNA旋轉(zhuǎn)酶，解螺旋酶，單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB），DNA聚合酶Ⅲ，焦磷酸酶DNA旋轉(zhuǎn)酶，解螺旋酶，單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB），DNA聚合酶Ⅲ，焦磷酸酶，引物酶，DNA聚合酶Ⅰ，DNA連接酶和NAD+復(fù)制延伸過程中的各種原料、酶或蛋白質(zhì)因子第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-)

復(fù)制體(replisome)

復(fù)制體：是在復(fù)制叉附近與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)因子，他們在復(fù)制叉上形成離散的復(fù)合物,彼此配合,進行高度精確的復(fù)制,這種結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制體(DNApolⅢ二聚體、引發(fā)體和DnaB等)復(fù)制體的基本活動包括：1）雙鏈的解開；2）RNA引物的合成；3）DNA鏈的延長；4）切除RNA引物，填補缺口，連接DNA片段；5）切除和修復(fù)錯配堿基。P421第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-3.E.coliDNA合成的終止現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有兩個終止區(qū)域

（terE,D,A

和terC,B,F），

位于相遇點的另一側(cè)100Kb

處。每一終止順序?qū)δ骋环较蛞苿拥膹?fù)制叉來說是特異的。終止需要Tus(36kD)，

Tus能識別ter保守順序，并阻止復(fù)制叉繼續(xù)前進。

ter-Tus復(fù)合物可能通過抑制螺旋酶來實行終止第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-E.coliDNA合成的終止

ThetwonewlysynthesizedcircularchromosomalDNAs

aretopologicallyinterlinked(catenated)andisfinally

separatedbytheactionofaTypeIIopoisomerases.

最后還有50-100bp通過修復(fù)方式填補拓撲異構(gòu)酶Ⅳ(termination)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題1.在DNA復(fù)制過程中，兩條新鏈的合成為何一條鏈?zhǔn)沁B續(xù)復(fù)制，另一條鏈?zhǔn)情g斷復(fù)制？并比較兩條新鏈合成過程的不同點。

天津醫(yī)科大學(xué)2006生物化學(xué)2.簡述參與DNA復(fù)制的酶及基本過程復(fù)旦大學(xué)2003年考研生物化學(xué)3.細胞DNA復(fù)制是半不連續(xù)的，這是因為：

A.DNA聚合酶只能從3→5合成DNA鏈B.模版雙鏈?zhǔn)欠雌叫械腃.DNA聚合酶只能一個一個地加接核苷酸殘基D.DNA酶法合成是個自發(fā)過程南開大學(xué)2006年生物化學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題4.

以下哪個過程不需要DNA連接酶?

(A)DNA復(fù)制(B)DNA修復(fù)(C)DNA重組

(D)制備重組DNA

(E)DNA修飾。5需要以RNA為引物的是:

(A)DNA復(fù)制(B)RNA轉(zhuǎn)錄

(C)轉(zhuǎn)錄

(D)蛋自質(zhì)合成(E)RNA復(fù)制

華東師范大學(xué)2006生物化學(xué)考研6.敘述DNA聚合酶I在大腸桿菌細胞DNA復(fù)制中的功能，并介紹這個酶在生物技術(shù)中的應(yīng)用。

南開大學(xué)2006年生物化學(xué)7.

原核生物DNA復(fù)制的過程

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)2011年生物化學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題8.

關(guān)于DNA復(fù)制的敘述哪一項論述是錯誤的?()

A．有DNA指導(dǎo)的RNA聚酶參加，B．有RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶參加，C.為半保留復(fù)制D.有DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶參加

山東大學(xué)2001生物化學(xué)9.在一個復(fù)制叉之中，以下哪一種蛋白質(zhì)的數(shù)量最多?()

（A）DNA聚合酶（B）引發(fā)酶（C）SSB

（D）DNA解鏈酶（E）DNA拓撲異構(gòu)酶

華東師范大學(xué)2007年第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

思考題10、打開DNA超螺旋的酶或蛋白質(zhì)是（）

A、DNA解螺旋酶B、單連結(jié)合蛋白C、DNA旋轉(zhuǎn)酶D、DNA聚合酶1E、DNA聚合酶2

蘇州大學(xué)2006年11、DNA連接酶在下列那一過程中不需要？

A、DNA復(fù)制B、制備重組DNA

C、DNA修復(fù)D、DNA斷裂

廈門大學(xué)2011年第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-12、山東大學(xué)2015

名詞解釋:滾環(huán)復(fù)制

判斷：1）.大腸桿菌DNA聚合酶I具5’-3’外切酶活性，也可以RNA為底物。2）.基因組DNA復(fù)制，先導(dǎo)鏈引物為DNA，后隨鏈引物為RNA。3）.因所有的DNA聚合酶都按5’-3’催化鏈延長，因此推測必定存在一種未發(fā)現(xiàn)的酶能按3’-5’催化復(fù)制叉上第二條鏈?zhǔn)怪娱L。思考題第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

思考題13、大腸桿菌DNA復(fù)制和體外酶促擴增DNA的比較。中國藥科大學(xué)20132.、為什么說DNA復(fù)制以5’-3’為模板的是半不連續(xù)復(fù)制，它如何完成復(fù)制過程。2015考研827生化回憶版_天津大學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-五

真核生物DNA復(fù)制P424

真核生物染色質(zhì)的基本單位：核小體，核小體DNA長度200bp左右，真核生物岡崎片段較短的長度200bp左右，相當(dāng)于一個核小體DNA長度多起點復(fù)制，酵母復(fù)制起點ARS第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-真核生物DNA復(fù)制與原核生物DNA復(fù)制的差異(1).真核生物復(fù)制慢：原核細胞DNA復(fù)制叉移動速度快，細菌復(fù)制叉移動速度為50000bp/min，哺乳動物DNA復(fù)制叉移動速度慢,約為1000~3000bp/min。(2).真核細胞含多個復(fù)制子，多個復(fù)制起點。人平均每個染色體上有1000個復(fù)制子，原核細胞DNA中多數(shù)只有一個復(fù)制子。(3).

真核細胞的復(fù)制子在每個細胞周期僅復(fù)制一次，原核細胞在快速生長時，在DNA復(fù)制起點可連續(xù)復(fù)制多次，(4).

引物和岡崎片段較短

(5).

連接酶需ATP

(6).

端粒的復(fù)制(7).

聚合酶和蛋白質(zhì)因子不同。真核細胞DNA與組蛋白結(jié)合成核小體，原核細胞DNA不存在核小體。P425第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-（1）.Semi-conservativereplication（2）.Semi-discontinuousrepliction（3）.DNAhelicase（4）.RNApriming(5).

校對（Proofreading）(6).

單鏈結(jié)合蛋白真核生物DNA復(fù)制與原核生物DNA復(fù)制的相同點2.原核生物與真核生物復(fù)制的差異2015年東北師范大學(xué)（851）生物化學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

真核生物的五種DNA聚合酶DNA-polⅢDNA-polⅠ類似原核生物DnaG,primase德爾塔伊普西龍在核酸酶切去引物后，補引物缺口合成引物：RNA+DNA主要的復(fù)制酶第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

真核生物的五種DNA聚合酶(1)DNA-pol

（核內(nèi)）:起始引發(fā)，有引物酶活性。

（DNA-polα+primase形成緊密的復(fù)合物）(2)DNA-pol

（核內(nèi)）:參與低保真度的復(fù)制。(3)DNA-pol

（德爾塔）（核內(nèi)）:延長子鏈的主要酶，有持續(xù)合成DNA鏈的活性又有校讀功能,和組織相容抗原

PCNA)相互作用。(4)DNA-pol

（伊普西龍）（核內(nèi)）:修復(fù)損傷DNA

和填補引物空隙的功能。(5)DNA-pol

（線粒體內(nèi)）:在線粒體DNA復(fù)制中起作用。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DNA復(fù)制的起始起始DNA德爾塔第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

真核生物DNA復(fù)制的過程1、DNAPol

形成引物（RNA+DNA）2、兩個DNAPol

（德爾塔）或一個DNAPol

與一個DNA-pol

（伊普西龍）在引物后延長DNA3、RNaseH1和FEN1(MF-1)蛋白切除岡崎片段RNA引物的4.

DNA聚合酶ε填補缺口，類似細菌-DNA-polⅠ5.

DNA連接酶進行連接反應(yīng)，需要ATP供能。DNA-pol

（德爾塔）（核內(nèi)）:延長子鏈的主要酶起作用。伊普西龍第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-真核生物引物的切除和補缺口FEN1又寫為MF-1

pol

(伊普西龍)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-真核和原核細胞的DNA復(fù)制比較

功能

E.coli

人復(fù)制酶PolⅢ的全酶Polδ進行性因子

夾子PCNA定位因子復(fù)合體RF-CSSB引物酶DnaGPolα-引發(fā)酶去除引物的酶

DNA聚合酶1

RNaseH1和MF-1后隨連修復(fù)酶DNA聚合酶1和DNA聚合酶εDNA連接酶DNA連接酶1解旋酶DnaBT抗原消除拓撲張力酶旋轉(zhuǎn)酶拓撲異構(gòu)酶單鏈結(jié)合蛋白SSBRP-A起始蛋白DnaAT抗原

注：MF-1又寫為FEN1P426第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-環(huán)狀DNA

大腸桿菌能否完整復(fù)制真核生物鏈狀染色體？線狀DNA:滯后鏈復(fù)制不完整5端

DNA復(fù)制的末端第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-端粒和端粒酶端粒是存在于真核細胞線狀染色體末端的一小段DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體。端粒由成百個6個核苷酸的重復(fù)序列所組成（人TTAGGG，四膜蟲為TTGGGG），富含G。端粒也被科學(xué)家稱作“生命時鐘”。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-端粒和端粒酶

人類端粒酶含三部分：（端粒酶RNA）、（端粒酶協(xié)同蛋白）、（端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶），除骨髓干細胞、胚胎原始干細胞等細胞外,大多數(shù)正常人體細胞失去端粒酶活性。惡性腫瘤細胞中,85%～90%端粒酶強陽性。端粒酶可作為腫瘤標(biāo)志和腫瘤治療靶點.原核生物沒有端粒酶端粒酶(telomerase):是一種反轉(zhuǎn)錄酶,修補端粒序列第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

由RNA（做模版）和蛋白質(zhì)（逆轉(zhuǎn)錄酶）構(gòu)成的一種核糖核蛋白復(fù)合體，維持端粒的長度。端粒酶第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-端粒的形成第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-六、

DNA復(fù)制的忠實性機制（補充）

DNA復(fù)制的差錯率只有10-8－10-101.

DNA聚合酶的選擇作用（根據(jù)堿基配對規(guī)律，但堿基有烯醇式和酮式兩種構(gòu)象）(104-105)2.DNA聚合酶本身具有校正功能(3'→5'外切酶活性)(102-103)

加入錯配堿基后合成速率下降，為校對修復(fù)留出時間：動力學(xué)校對3.

細胞內(nèi)有錯配修復(fù)等損傷修復(fù)系統(tǒng)4.

細胞維持dNTP的平衡水平；5.

RNA作為合成引物（起始合成時易出錯）；前導(dǎo)鏈和滯后鏈的忠實性程度往往不同DNA復(fù)制時，新鏈合成都遵循堿基配對原則！(102-103)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-1.哪些機制保證了DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性？為什么生物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的準(zhǔn)確性沒有DNA復(fù)制準(zhǔn)確性高？

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)2012年生物化學(xué)2、判斷：與原核生物不同，幾乎所有的真核細胞都發(fā)現(xiàn)有端聚酶。2013年中山大學(xué)3.端粒酶是：

A、限制性內(nèi)切酶

B、DNA聚合酶C、RNA聚合酶

D、肽酰基轉(zhuǎn)移酶

廈門大學(xué)2011年招思考題第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題南開大學(xué)20102011年中國海洋大學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-6.判斷：所有的岡崎片段都是從5'---3'方向合成，在3'端延長。

廈門大學(xué)2011年招7、下列與DNA解鏈無關(guān)的是？

A、單鏈DNA結(jié)合蛋白B、DNA解旋酶

C、DNA旋轉(zhuǎn)酶D、DNA酶

南師大2013思考題8、原核生物復(fù)制叉上有何活動和需要什么酶華中科技大學(xué)生化2014第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-8、山東大學(xué)2015

簡答：DNA復(fù)制方向5’-3’，若以3’dNTP為DNA復(fù)制原料，DNA復(fù)制方向可以是3’-5’。思考題5`活性5`端非活性3`端第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-5'3'復(fù)制方向的原因原因：(1).核苷酸均為5'核苷酸(2).錯誤堿基采取水解去除的方式（3）錯誤堿基去除后的主鏈可以直接進行下一輪反應(yīng)PPPOH5'3'第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-PPPOH5'3'思PPPO5'3'PPPOH5'3'思5→3

聚合酶3→5外切酶123錯誤后校對可以直接進行下一輪反應(yīng)5'3'復(fù)制方向的原因第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-PPPOH5'3'POH5'3'5`→3`聚合酶POH5'3'3→5外切酶PPPOH5'3'如果進行下一輪反應(yīng)，5'需要重新活化123錯誤后校對3'→5'復(fù)制方向？最初第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-第二節(jié)DNA的損傷和修復(fù)

DNA損傷(DNAdamage)：是指DNA結(jié)構(gòu)改變而引起的遺傳信息的改變。DNA的自發(fā)性損傷堿基錯配：堿基異構(gòu)、脫氨基和修飾物理因素引發(fā)的損傷紫外線電離輻射化學(xué)因素引發(fā)的損傷堿基烷基化、堿基脫落等堿基類似物P427第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

DNA的損傷修復(fù)修復(fù)形式

損傷特點

pol

修復(fù)特點直接修復(fù)

不打斷鏈，不切除錯配修復(fù)修復(fù)復(fù)制錯配堿基pol

Ⅲ切除可達1000nt堿基切除修復(fù)修復(fù)單個堿基損傷pol1先去除堿基，再切幾個nt核苷酸切除修復(fù)修復(fù)較大的損傷pol1如，切除13或29ntSOS反應(yīng)很大的損傷pol1

(Ⅳ/Ⅴ

)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-錯配修復(fù)(修復(fù)復(fù)制中錯配的錯誤)

1、定義：在含有錯配堿基對的分子中使正常的核苷酸序列恢復(fù)的修復(fù)方式。

2、參與錯配修復(fù)的酶與蛋白質(zhì)：

Dam甲基化酶;

MutH、MutL、MutS蛋白;解螺旋酶Ⅱ;外切酶Ⅰ、Ⅹ、Ⅶ；RecJ核酸酶;

SSB;DNA聚合酶Ⅲ;DNA連接酶；

（一）DNA錯配修復(fù)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DnaBDnaGDnaCHU

DNA錯配修復(fù)AC識別新生鏈中非m6A

的GATC序列DNA聚合酶Ⅲ;DNA連接酶；第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

大腸桿菌的錯配修復(fù)過程第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-大腸桿菌的錯配修復(fù)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-

新合成的子代鏈未甲基化

幾分鐘后，新合成的子代鏈甲基化

大腸桿菌的復(fù)制起始的調(diào)控？第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題2010年南開大學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-(二)

DNA的直接修復(fù)

DNA直接修復(fù):修復(fù)過程不要切除堿基或核苷酸1、光復(fù)活:可見光(最有效波長400nm)激活生物界廣泛分布(高等哺乳動物,如人類，除外)的光復(fù)活酶,該酶分解嘧啶二聚體.是一種高度專一的修復(fù)形式,只分解由于UV照射而形成的嘧啶二聚體.2

O6-甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶:將DNA上的被修飾的甲基(鳥嘌呤O6位上的甲基)移到蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基上。此時，轉(zhuǎn)甲基酶自身被甲基化而失活,防止G-T對形成。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-1、光復(fù)活

為什么細菌在紫外光照射后在可見光下比暗處更容易存活？川大生物化學(xué)2015年紫外線可以形成的胸腺嘧啶二聚體可見光可激活光復(fù)活酶第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-光復(fù)活酶的存在

光復(fù)活酶從單細胞生物到鳥類均有，高等哺乳動物沒有此酶，而采用切除修復(fù)UV照射而形成的嘧啶二聚體。

為什么細菌在紫外光照射后在可見光下比暗處更容易存活？第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-2

O6-甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶

Removesthemethylgroup.Themethylgroupistransferredtotheproteinitself,inactivatingtheprotein.第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-O6-甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-1、概念：在一系列酶的作用下，將DNA分子中受損傷部分切除，并以完整的那一條鏈為模板，合成出切去部分，DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)缺陷的修復(fù)：（1）核酸內(nèi)切酶識別DNA損傷部位，在其附近將其切開。（2）核酸外切酶切除損傷的DNA。（3）DNA聚合酶1修復(fù)。（4）DNA連接酶連接。2、類型：（三）、切除修復(fù)（核苷酸）切除修復(fù)（堿基）切除修復(fù)

單個堿基缺陷的修復(fù)，如被堿基修飾，如烷基化結(jié)構(gòu)較大變形第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-堿基切除修復(fù)AP位點(無嘌呤或無嘧啶位點）：DNA糖基化酶（糖苷鍵）可以切斷這種堿基N-糖苷鍵，將堿基除去，形成的脫堿基部位通常稱為"abasic"部位或AP位點。引發(fā)原因：DNA中U的出現(xiàn)，堿基的修飾，自發(fā)脫堿基等β-糖苷鍵AP位點的形成第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DNA中可能出現(xiàn)U胸腺嘧啶核苷酸