【生物】基因工程的基本操作程序-2023-2024學(xué)年高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

基因工程的基本操作程序

新課導(dǎo)入1997年，我國政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個，減少農(nóng)藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會經(jīng)濟效益450億元。你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲的機制是什么嗎？培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？轉(zhuǎn)基因抗蟲棉與普通棉花?基因工程的步驟蘇云金桿菌與載體拼接

普通棉花（無抗蟲特性）棉花細(xì)胞抗蟲棉提取表達(dá)Bt基因?qū)隑t基因重組DNA分子【培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡要過程】1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的

檢測與鑒定

基因工程的一般操作程序主要包括四個步驟：目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測與鑒定。（核心步驟）基因工程的基本操作原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子編碼區(qū)終止子啟動子：RNA聚合酶結(jié)合位點，轉(zhuǎn)錄起始的信號，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA終止子：終止RNA的合成非編碼區(qū)功能：不能編碼蛋白質(zhì)，調(diào)控遺傳信息的表達(dá)編碼區(qū)：編碼蛋白質(zhì)的合成與RNA聚合酶結(jié)合位點AGGUCACGUCGRNA聚合酶RNA聚合酶RNA聚合酶AGGTCACGTCGTCCAGTGCAGC二、真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)內(nèi)含子外顯子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游間隔的、不連續(xù)的外顯子：內(nèi)含子：數(shù)量關(guān)系：外顯子=內(nèi)含子+1能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，但卻不能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游初級RNA成熟mRNA蛋白質(zhì)內(nèi)含子外顯子一.目的基因的篩選與獲?。ㄒ唬⒛康幕?.概念:在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物的基因。2.作用:根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。3.實例:與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。資料：蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)殺死棉鈴蟲。

當(dāng)Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡?！鞠嚓P(guān)信息】P77①Bt抗蟲蛋白的抗蟲原理？②抗蟲棉中的Bt抗蟲蛋白會不會對人畜產(chǎn)生危害？Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也沒有特異性受體，因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產(chǎn)生上述影響培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉用到的目的基因Bt抗蟲蛋白基因簡稱

Bt基因1.實例：Bt

抗蟲蛋白基因（Bt基因）的篩選過程用蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑廣泛用于防治棉花蟲害也對Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物——Bt抗蟲蛋白有了較為深入的了解。蘇云金桿菌的殺蟲作用與Bt基因有關(guān)不僅掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因一.目的基因的篩選與獲取（二）、篩選合適的目的基因從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選?！铮ㄈ├肞CR獲取和擴增目的基因PCR由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎。

如果說，沃森和克里克發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，標(biāo)志著分子生物學(xué)時代的開啟，那么PCR技術(shù)則標(biāo)志著分子生物學(xué)的騰飛。PCR技術(shù)的出現(xiàn)，徹底變革了生物化學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、以及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)等等。目的基因的篩選與獲取一.1.PCR的含義：PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫。它是一項根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。2.PCR的原理：DNA半保留復(fù)制PCR擴增儀★

（三）、利用PCR獲取和擴增目的基因目的基因的篩選與獲取一.DNA聚合酶只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵，需要模板AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶方向：只能從5′－端→3′－端延伸（1）解旋DNA半保留復(fù)制（2）合成子鏈（3）重新螺旋條件:③能量親代DNA的兩條鏈4種游離的脫氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶等由細(xì)胞代謝提供的ATP等①模板②原料④酶

體內(nèi)DNA復(fù)制參與的組分在DNA復(fù)制中的作用PCR中參與的組分打開DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常為小的單鏈RNA）無需解旋酶，用高溫代替DNA母鏈4種脫氧核苷酸耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）人工合成的2種引物（通常為小的單鏈DNA）反應(yīng)還需要其它條件，如能量、緩沖液、溫度控制等PCR和DNA的體內(nèi)復(fù)制是否完全相同？引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈23’5’引物13’5’引物2引物3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈2用于PCR的引物長度通常為20~30個核苷酸。引物結(jié)合在模板鏈的3′端作用：使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸過程95℃1.變性：加熱至90～95℃，雙鏈DNA間的氫鍵斷裂，解旋為單鏈。變性復(fù)性延伸

（三）目的基因的獲取—利用PCR獲取和擴增目的基因使用耐高溫的Taq酶保證高溫條件下仍具有活性。模板DNA5’5’3’3’一.目的基因的篩選與獲取50℃引物1引物2DNA引物2.復(fù)性：冷卻至50℃左右時，兩條引物與單鏈DNA結(jié)合（三）、目的基因的獲取—利用PCR獲取和擴增目的基因5’3’5’3’引物結(jié)合在模板DNA鏈的3′端過程變性復(fù)性延伸

引物1引物272℃Taq酶Taq酶3.延伸：加熱至70～75℃，以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈。三、目的基因的獲?。ㄈ?、目的基因的獲取—利用PCR獲取和擴增目的基因5’3’5’3’3’5’5’3’過程變性復(fù)性延伸

一.目的基因的篩選與獲取第二次循環(huán)95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq變性復(fù)性延伸延伸變性復(fù)性925075℃3`5`5`3`Taq聚合酶引物1引物2原料模板DNA目的基因（四）PCR技術(shù)擴增目的基因（實際）

925075℃變性3`5`5`3`925075℃退火(復(fù)性）925075℃延伸925075℃變性變性925075℃退火(復(fù)性）925075℃延伸925075℃變性925075℃退火(復(fù)性）925075℃延伸【三點提醒】①在PCR過程中實際加入的為dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。②引物既可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈。細(xì)胞內(nèi)的DNA進(jìn)行復(fù)制時，也需要引物，一般為RNA片段；PCR引物一般為DNA片段。③真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2＋。脫氧核苷三磷酸①目的基因：②啟動子：③終止子：④標(biāo)記基因：控制特定性狀或表達(dá)特定產(chǎn)物。位于基因的首端,是RNA聚合酶結(jié)合位點，基因轉(zhuǎn)錄的開始。位于基因的末端，終止轉(zhuǎn)錄。檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞，篩選含有目的基因的受體細(xì)胞。⑤復(fù)制原點：DNA聚合酶結(jié)合位點。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（一）、基因表達(dá)載體的目的（1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程載體（質(zhì)粒）DNA分子（含目的基因）限制酶處理帶有黏性末端或平末端的切口帶有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種使用一種限制酶進(jìn)行切割，是否只會得到目的基因與載體結(jié)合的這一種重組DNA？問題探討載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接反向連接11’22’122’1’22’1’1應(yīng)用中往往選擇2種不同的限制酶同時對目的基因和質(zhì)粒切割，減少自連情況出現(xiàn)三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化：方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞法（Ca2+處理法）目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)1.花粉管通道法①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；②在植物授粉后一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通過花粉管通道進(jìn)入胚囊。（一）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞適用生物：雙子葉植物構(gòu)建表達(dá)載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒表現(xiàn)出新性狀的植株導(dǎo)入植物細(xì)胞植物細(xì)胞將目的基因插入染色體DNA中目的基因Ti質(zhì)粒T-DNA含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞T-DNA攜帶目的基因插入植物細(xì)胞染色體DNA中表達(dá)新性狀植物組織培養(yǎng)2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上；

第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞染色體的DNA上。兩次導(dǎo)入：第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌；第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。

三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞操作程序：（二）將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞--顯微注射法構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純利用顯微注射法將基因表達(dá)載體注入動物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植（移植到同期發(fā)情的母畜子宮內(nèi)）獲得具有新性狀的動物①體積大，易操作；②全能性高，易培養(yǎng)成完整個體。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（補充）（常用大腸桿菌）優(yōu)點：繁殖周期短體積小易于培養(yǎng)操作多為單細(xì)胞遺傳物質(zhì)相對較少（三）將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞----Ca2+處理法使用Ca2+處理：增加細(xì)胞壁的通透性，可使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)（感受態(tài)細(xì)胞）。Ca2+感受態(tài)細(xì)胞吸收三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（補充）實例：利用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌生產(chǎn)藥物過程：Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子四、目的基因的檢測與鑒定類型檢測內(nèi)容方法分子水平檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因PCR擴增DNA分子雜交技術(shù)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNAPCR擴增分子雜交技術(shù)目的基因是否翻譯形成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術(shù)個體水平鑒定抗蟲或抗病的接種實驗抗性以及抗性程度抗性檢測；基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能活性比較

功能活性。1.DNA分子雜交基因探針待測DNA基因探針：常用目的基因的單鏈DNA片斷制成，帶有某種（如放射性）標(biāo)記。

能與目的DNA的一條鏈或與RNA發(fā)生堿基互補配對。

（一）分子水平的檢測2.分子雜交RNA的PCR3.檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法：抗原-抗體雜交技術(shù)蘇云金芽孢桿菌提取Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)抗體標(biāo)記抗體提取蛋白抗原抗體雜交電泳分離轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）害蟲死亡病毒（菌）接種實驗未染病鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比較功能、活性正?？瓜x鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等（二）個體水平檢測：抗性以及抗性程度【探究?實踐】DNA片段的擴增及電泳鑒定（84-85）（一）實驗原理1.PCR在體外進(jìn)行DNA片段的擴增原理PCR利用了_______________________和_____________________的原理。DNA的熱變性原理DNA半保留復(fù)制2.DNA片段電泳鑒定的原理DNA分子具有_____________，在一定的_____下，這些基團(tuán)可以帶上_________________，在_____的作用下，這些_____________會向著__________________的電極移動，這個過程就是________。可解離的基團(tuán)pH正電荷或負(fù)電荷帶電分子電泳與它所帶電荷相反電場

在凝膠中DNA分子的遷移速率與________________、___________________和_________等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過_____，可以在波長為________的___________下被檢測出來。凝膠的濃度染色300nm紫外燈DNA分子的大小構(gòu)象（二）材料用具1.試劑（1）4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴增緩沖液、無菌水。（2）電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等。（3）PCR反應(yīng)體系的配方10倍濃縮的擴增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μL2.用具①PCR儀

（自動控溫，實現(xiàn)DNA的擴增）②微量離心管

（實際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場所）③微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）（注意：加不同樣品時，需要更換槍頭）（三）實驗步驟1.DNA片段擴增的具體過程移液用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分。離心待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部（提高反應(yīng)速率）。反應(yīng)參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min預(yù)變性：使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結(jié)合?？筛鶕?jù)目的片段長度適當(dāng)調(diào)整延伸時間。2.PCR擴增產(chǎn)物電泳鑒定的具體過程制備凝膠①融化②倒模③凝固用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%～1.2%.加熱至瓊脂糖熔化，稍冷卻后,加入適量的核酸染料混勻。將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞撸?/p>