熒光免疫標記技術(shù)

熒光免疫標記技術(shù)1熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024免疫標記（immunolabellingtechnic）

是指用一些易測定的、具有高度敏感性的標記物質(zhì)：熒光素、放射性核素、酶、膠體金、生物素、鐵蛋白及化學（或生物）發(fā)光劑等作為追蹤物，標記特異性的抗原、抗體分子進行的抗原、抗體反應。

通過這些標記物的增強放大效應來顯示反應系統(tǒng)中抗原、抗體的性質(zhì)與含量。并借助于熒光顯微鏡、射線測量儀、酶標檢測儀、電子顯微鏡和發(fā)光免疫測定儀等精密儀器對試驗結(jié)果直接鏡檢觀察或進行自動化測定。

可以在細胞、亞細胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上對抗原、抗體反應進行定性和定位研究；或應用各種液相和固相免疫分析方法對體液中的半抗原、抗原進行定性和定量測定。具有高度敏感性、特異性、快速性。2熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024

免疫標記技術(shù)主要分為：

免疫熒光技術(shù)：

放射免疫測定：自動化儀器價格昂貴、所用試劑半衰期

短、危及人體健康。敏感酶免疫技術(shù)：敏感、快速、簡便、應用范圍廣、不需特

殊設(shè)備3熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024免疫標記技術(shù)的應用

標記物與抗原、抗體的連接技術(shù)；標記后的抗原、抗體進行特異性檢測的實驗設(shè)計原理

以及相應的檢測儀器的使用方法。4熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024免疫熒光標記技術(shù)（immunofluorescencetechnique）將熒光素作為標記物與已知的特異性抗體以化學方法結(jié)合，形成熒光素-蛋白質(zhì)結(jié)合物（即熒光標記抗體），此結(jié)合物仍保留著抗體的活性，同時具有熒光素的示蹤作用。當它與相應的抗原特異結(jié)合后形成的復合物上就帶有一定量的熒光素，在熒光燈源紫外線或藍紫光激發(fā)下產(chǎn)生黃綠色熒光，通過在熒光顯微鏡下觀察或流式細胞儀分析可對相應抗原進行定性、定位或定量的檢測

5熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024免疫熒光標記技術(shù)始創(chuàng)于20世紀40年代初，1942年Coons等首次報道用異氰酸熒光素標記抗體，檢查小鼠組織切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。當時由于異氰酸熒光素標記物的性能較差，未能推廣使用。直至1958年Riggs等合成了性能較為優(yōu)良的異硫氰酸熒光黃（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）。Marshall等又對熒光抗體標記的方法進行了改進，從而使免疫熒光技術(shù)逐漸推廣應用。6熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024

免疫熒光技術(shù)是將抗原抗體反應的特異性和敏感性與顯微示蹤的精確性相結(jié)合。以熒光素作為標記物，與已知的抗體(或抗原)結(jié)合、但不影響其免疫學特性。然后將熒光素標記的抗體作為標準試劑，用于檢測和鑒定未知的抗原。在熒光顯微鏡下，可以直接觀察呈現(xiàn)特異熒光的抗原抗體復合物及其存在部位。

免疫熒光技術(shù)-基本原理7熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024

熒光：是指一個分子或原子吸收了給予的能量后，即刻引起發(fā)光；停止能量供給，發(fā)光亦瞬即停止。熒光素：是一種可吸收激發(fā)光的光便能產(chǎn)生熒光，并能作為染料使用的有機化合物，亦稱熒光色素。發(fā)生原理：基態(tài)激發(fā)態(tài)產(chǎn)生特點：激發(fā)---即刻產(chǎn)生停止激發(fā)---瞬間消失種類：光致熒光，化學熒光，X線熒光，陰極射線熒光熒光8熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024熒光壽命---熒光物質(zhì)被瞬時光脈沖激發(fā)后產(chǎn)生的熒光衰減到一定程度所用時間。熒光淬滅---熒光物質(zhì)的熒光輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后發(fā)生的減弱現(xiàn)象。淬滅劑---苯胺、硝基苯、酚等熒光（標記）物質(zhì)的保存熒光9熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024用于標記的抗體：高特異性和高親和力作為標記的熒光素應符合以下要求：應具有能迅速而穩(wěn)定地與蛋白質(zhì)分子形成共價健的化學基團，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍能保持較高的熒光效率。有強的熒光效應，即使標記后也不出現(xiàn)非特異染色熒光色澤,與背景組織的色澤對比鮮明。容易與自發(fā)熒光及其他熒光相區(qū)別（如雙重標記時）與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)。盡可能少褪色標記方法簡單、安全無毒。與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存有良好的水溶性，溶解后不與其它物質(zhì)發(fā)生化學反應，純凈，可用標準試劑檢驗。10熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024常用的熒光標記試劑:熒光素類

：標準熒光素及其衍生物異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）羥基熒光素（carboxyfluorescein,FAM）四氯熒光素（tetrachlorofluorescein,TET）羅丹明類（Rhodaminedye)標準熒光素的衍生物四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）11熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）外觀：為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子式：C21H11NO5S分子量為389.4純度：≥95%(HPLC)最大吸收光波長為490-495nm，最大發(fā)射光波長520-530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應用最廣泛的熒光素。主要優(yōu)點：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。12熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024

異硫氰酸熒光素(FITC)13熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）最大吸引光波長為550nm，最大發(fā)射光波長為620nm呈橙紅色熒光與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或?qū)Ρ热旧洚惲蚯杌膳c蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低14熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）橘紅色粉末不溶于水，易溶于酒精和丙酮性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存最大吸收光波長為570nm，最大發(fā)射光波長為595-600nm呈橘紅色熒光15熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024熒光FITC+RB200標記16熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024熒光物質(zhì)最大吸收光譜最大發(fā)射光譜應用異硫氰酸熒光素(FITC)490～495nm520～530nm（黃綠色）FAT、熒光偏振免疫測定四乙基羅丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標記FAT四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)550nm620nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標記FAT藻紅蛋白（PE）490-560nm595nm（紅色）雙標記FAT、流式細胞術(shù)7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（藍色）雙標記或多標記FATEu3+螯合物340nm613nm時間分辨熒光免疫測定常用的熒光物質(zhì)17熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024熒光素FITC標記抗體當FITC在堿性溶液中與抗體蛋白反應時，主要是蛋白質(zhì)上賴氨酸的r氨基與熒光素的硫碳胺鍵結(jié)合，形成FITC-蛋白質(zhì)結(jié)合物，即熒光抗體或熒光結(jié)合物。一個IgG分子中有86個賴氨酸殘基，一般最多能結(jié)合15～20個，一個IgG分子可結(jié)合2～8個分子的FITC，其反應式如下：

FITC-N=C=S+N-H2-蛋白質(zhì)→FITC-NS-C-N-H2-蛋白質(zhì)18熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024FITC標記方法：攪拌法：

適用于標記體積較大、蛋白質(zhì)含量較高的抗體溶液。優(yōu)點是標記時間短、熒光試劑用量少，但此法所受影響因素較多，若操作不當會引起較強的非特異性熒光染色出現(xiàn)。直接標記法間接標記法改良法透析法：適用于標記樣品量少、蛋白含量低的抗體溶液，此法標記抗體比較均勻，非特異性染色也比較少。19熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024熒光抗體的純化去除游離熒光素及其降解產(chǎn)物：透析或凝膠過濾去除熒光素未結(jié)合和結(jié)合過度的抗體：陰離子交換層析法去除交叉反應或非期望抗體：動物肝粉吸收或固相抗原吸收20熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024

【主要試劑與器材】1．器材（1）鐵立架、蝴蝶夾、層析柱、洗脫瓶、攪拌器、磁棒、

紫外分光光度計（2）燒杯、試管、滴管、吸管、洗耳球、pH試紙、黑紙2．試劑（1）抗體（2）異硫氰基熒光黃（FITC）（3）葡聚糖凝膠（SephadexG-25）（4）pH9.5，0.5M碳酸緩沖液（5）pH7.0，0.005M磷酸緩沖液21熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024取已知濃度的抗體蛋白溶液，用pH9.5，0.5M碳酸緩沖液稀釋至最終濃度為20mg/ml。置于包黑紙的小燒杯中，并放入磁棒。稱取適量FITC：按FITC(mg)/抗體蛋白(mg)的質(zhì)量比為1/100，并計算出需要FITC的量。即：FITC的量(mg)=待標記抗體蛋白總量(mg)×0.01。將稱好的FITC放在試管中，并用黑紙包好，然后取相當于稀釋后抗體蛋白溶液體積1/10的pH9.5，0.5M碳酸緩沖液溶解FITC。開啟攪拌器，將FITC溶液用滴管逐滴滴入含抗體蛋白溶液的燒杯內(nèi)，加完后用pH試紙測試，如pH低于9.5，則用碳酸緩沖液調(diào)整pH至9.5，加蓋攪拌1小時。用SephadexG-25裝層析柱，用pH7.0，0.005M磷酸緩沖液（PB）平衡洗脫。將上述標記液上SephadexG-25柱。用pH7.0，0.005MPB洗脫，流速控制為1ml/分鐘。用三支試管收集：待黃綠色熒光走至離下端2cm處時，用第一支試管開始收集；當黃綠色熒光出現(xiàn)在洗脫液時，用第二支試管收集全部黃綠色熒光溶液，待黃色熒光溶液在流出層析柱口時，換用第三支試管收集，直至流出液黃色消失，則停止收集。【操作方法】22熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024記錄收集管的OD495讀數(shù)與OD280讀數(shù)，

根據(jù)公式：

2.87×OD495F/P=——————————OD280－0.35×OD495

計算F/P值，并對該比值作一簡單分析?！窘Y(jié)果判斷】23熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024熒光抗體的鑒定（特異性和敏感性鑒定）效價抗體效價可以用瓊脂雙擴散法進行滴定，效價大于1:16者較為理想。熒光素與蛋白質(zhì)的結(jié)合比率熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合比率（f/p）的測定和計算f/p值越高，說明抗體分子上結(jié)合的熒光素越多，反之則越少。一般用于固定標本的熒光抗體以f/p＝1.5為宜，用于活細胞染色的以f/p＝2.4為宜。

24熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024抗體工作濃度抗體工作濃度的確定方法類似ELISA間接法中酶標抗體的滴定。將熒光抗體自1:4～1:256倍比稀釋，對切片標本作熒光抗體染色。以能清晰顯示特異熒光、且非特異染色弱的最高稀釋度為熒光抗體工作濃度。熒光抗體的保存應注意防止抗體失活和防止熒光猝滅。最好小量分裝，－20℃凍存，這樣就可放置3～4年。在4℃中一般也可存放1～2年?？杉尤?:5000~10000的柳硫汞或1:1000~5000的疊氮鈉，分裝，真空干燥更易長期保存。25熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024【影響標記的因素】溫度:

溫度低則所需標記時間長，溫度高則標記時間短。在0-4℃時標記體需攪拌6-12h,而在7-9℃時攪拌4h即可,

20-25℃1-2h，37℃30-45minpH值:

pH低時，標記較慢，pH值偏高（大于10），抗體易變性，pH值9.0-9.5最為適宜，在弱堿性條件下FITC易溶解，同時免疫球蛋白的羧基容易暴露，便于兩者結(jié)合。反應液中熒光試劑和免疫球蛋白的比例:抗體蛋白含量低，標記慢，以每毫升含20-25mg蛋白為宜。26熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024【注意事項】嚴格掌握整個反應體系中的抗體蛋白含量，可提高標記效率。裝柱及上樣操作參照實驗一。最后洗脫時應注意掌握洗脫速度及每管收集量。27熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024光源：高壓汞燈、氙燈、鹵素燈濾板：隔熱濾板、激光濾板（UG、BG）、吸收濾板（OG、GG）光路：透射光、落射光熒光顯微鏡28熒光免疫標記技術(shù)5/9/202429熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024自身抗體檢測抗核抗體(均質(zhì)型)抗核抗體(核膜型)抗核抗體(斑點型)熒光抗體技術(shù)的應用30熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024病原體檢測寄生蟲（猴胚腎細胞內(nèi)弓形蟲）細菌（藤黃微球菌)熒光抗體技術(shù)的應用31熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024免疫病理檢測腫瘤（人肝癌細胞）熒光抗體技術(shù)的應用32熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024細胞表面抗原和受體檢測將游離細胞作熒光抗體特異染色后，在特殊設(shè)計的儀器中通過噴嘴逐個流出，經(jīng)單色激光照射發(fā)出的熒光信號由熒光檢測計檢測，并自動處理各種數(shù)據(jù)。

特殊應用：流式細胞分析熒光免疫技術(shù)可用于淋巴細胞表面CD抗原、抗原受體、補體受體、Fc受體等的檢測以及淋巴細胞及其亞群的鑒定和計數(shù)。

熒光抗體技術(shù)的應用33熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024時間分辨熒光免疫測定：

蛋白質(zhì)、激素、藥物、腫瘤標記物、病原體抗原/抗體等熒光偏振免疫測定：

藥物、維生素、激素、常規(guī)生化項目等熒光酶免疫測定：

病毒抗體、細菌和毒素抗原、激素、腫瘤標志物等熒光免疫測定的應用34熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024間接免疫熒光檢測自身抗核抗體35熒光免疫標記技術(shù)5/9/202436熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024FALSSensorLaser前向角散射光（FSC）：反映細胞的大小熒光免疫顯微技術(shù)37熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024FALSSensor90LSSensorLaser側(cè)向角散射光（SSC）：反映細胞內(nèi)的顆粒多少

熒光免疫顯微技術(shù)38熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024雙色直接染色細胞熒光免疫顯微技術(shù)39熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024直方圖分析：對細胞的某一個單參數(shù)進行統(tǒng)計分析橫坐標為熒光或散射光強度縱坐標為細胞數(shù)熒光免疫顯微技術(shù)40熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024

熒光顯微鏡臺式機---FACSCalibur雙激光---488nm 635nm四熒光參數(shù)分選、濃縮系統(tǒng)41熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024大型機---FACSVantageSE

多激光多波長八熒光參數(shù)高速分選單細胞點對點分選42熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024

放射性同位素標記技術(shù)將被標記物分子中某個原子或幾個原子被放射性同位素取代形成同位素標記化合物，是將同位素分析的高靈敏度于與抗原-抗體反應的特異性相結(jié)合，以放射性同位素作為示蹤物的標記免疫測定方法特異性強、靈敏度高、重復性強、樣品及試劑用量少、測定方法易規(guī)范化和自動化43熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024可利用其衰變時放出的放射線進行測量，測量較靈敏而方便H3,C14,I131,I125H3,C14：不改變抗原的結(jié)構(gòu)及其免疫學活性，標記的抗體可長期使用，標記繁瑣，測定麻煩方法：氯胺T碘化法和Indogen包被法44熒光免疫標記技術(shù)5/9/2024酶標記技術(shù)通過共價鍵經(jīng)適當方法將酶聯(lián)結(jié)在抗體上，制成酶標抗體，再借酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，這些有色產(chǎn)物可用肉眼、光學顯微鏡和電子顯微鏡觀查，也可以用分光光度計測定，呈色反應顯示了酶的存在，從而證明了