儀器分析課件第7章分子發(fā)光分析法

第7章分子發(fā)光分析法molecularluminescenceanalysis1

2分子發(fā)光分析法包括熒光分析法、磷光分析法和化學發(fā)光分析法。這三種都是通過測量被激發(fā)的分子回到基態(tài)時所發(fā)射的光輻射來進行分析的，不同之處在于光譜產(chǎn)生的機制。分子受光子激發(fā)后，由第一電子激發(fā)單重態(tài)回到基態(tài)的任一振動能級伴隨的光輻射稱為分子熒光。激發(fā)態(tài)分子從第一激發(fā)三重態(tài)回到基態(tài)伴隨的光輻射稱為磷光。分子受化學能激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象稱為化學發(fā)光。7-1概述37-2分子熒光分析法及其基本原理分子熒光和磷光通?；?/p>

或

n形式的電子躍遷，因此都需要有不飽和官能團的存在。在光致激發(fā)和去激發(fā)光中，價電子可以處在不同的自旋狀態(tài)，常用電子自旋狀態(tài)的多重性描述。1.電子自旋狀態(tài)的多重性一、分子熒光和磷光的產(chǎn)生4概念：單重態(tài)（S）、基態(tài)（S0）、第一激發(fā)單重態(tài)（S1）、第二激發(fā)單重態(tài)（S2）、三重態(tài)（T）、第一激發(fā)三重態(tài)（T1）、第二激發(fā)三重態(tài)（T2）1.電子自旋狀態(tài)的多重性5熱能、電能、化學能或光能S0：基態(tài)S1、S2：第一（二）電子激發(fā)單重態(tài)T1、T2：第一（二）電子激發(fā)三重態(tài)υ：基態(tài)和激發(fā)態(tài)的振動能級電子自旋狀態(tài)的多重性62.無輻射躍遷當激發(fā)態(tài)分子返回基態(tài)時，如果不伴有發(fā)光現(xiàn)象，該過程稱為無輻射去激或無輻射躍遷，該過程包括振動弛豫（VR）、內轉換（IC）和系間竄躍（ISC）。7

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量；傳遞途徑輻射躍遷熒光磷光內轉換外轉換系間跨越振動弛豫無輻射躍遷

激發(fā)態(tài)停留時間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強度相對大；熒光：10-8～10-6s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；磷光：10-4～10s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；小結：分子熒光和磷光的產(chǎn)生8S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內轉換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉換l

2T2內轉換振動弛豫9熒光(磷光)：光致發(fā)光，照射光波長如何選擇？熒光(磷光)的激發(fā)光譜曲線激發(fā)光譜反映了激發(fā)波長與熒光強度之間的關系，為熒光分析選擇最佳激發(fā)波長提供依據(jù)。固定測量波長(選最大發(fā)射波長)，化合物發(fā)射的熒光(磷光)強度與照射光波長的關系曲線。簡而言之，固定發(fā)射波長，找激發(fā)波長。二、分子熒光分析的基本原理1.激發(fā)光譜和發(fā)射光譜10熒光(或磷光)發(fā)射光譜固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長),化合物發(fā)射的熒光(或磷光強度)與發(fā)射光波長關系曲線。11激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關系

（1）Stokes(斯托克斯)位移

激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，振動弛豫消耗了能量。

（2）熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如

2

,

1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光(如

2′)。

（3）

鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關系。12200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜13

小結：什么是分子熒光發(fā)射光譜與熒光激發(fā)光譜?(1)熒光激發(fā)光譜:固定熒光發(fā)射波長,掃描熒光激發(fā)波長,所得到的激發(fā)波長與熒光強度的一維光譜曲線。熒光發(fā)射光譜:固定熒光激發(fā)波長,掃描熒光發(fā)射波長,所得到的發(fā)射波長與熒光強度的一維光譜曲線。

(2)熒光發(fā)射光譜是供應能量使試樣增加能量后，針對發(fā)射的熒光所記錄的光譜,熒光激發(fā)光譜是以熒光為光源照射試樣后,針對試樣吸收能量所記錄的光譜。14思考題：簡述分子熒光光譜常與其吸收光譜呈鏡像對稱關系,而又不完全對稱,且熒光光譜的波長較長的理由。[答](1)物質的吸收光譜是物質吸收光能后,由基態(tài)躍遷至較高激發(fā)態(tài)的各個振動能級，產(chǎn)生吸收光譜的形狀是由激發(fā)態(tài)的能級分布決定的。(2)分子熒光光譜是由基態(tài)的振動能級分布決定的。兩者情況相似,但又不相同,再加上物質分子在激發(fā)態(tài)和基態(tài)受溶劑作用及環(huán)境的影響不同。15熒光量子產(chǎn)率（

）：是物質熒光特性的重要參數(shù)，它反映了熒光物質發(fā)射熒光的能力，其數(shù)值越大，說明物質的熒光能力越強。在產(chǎn)生熒光的過程中，涉及到許多輻射和無輻射躍遷過程，如熒光發(fā)射、內轉移，系間竄躍和外轉移等。很明顯，熒光的量子產(chǎn)率，與上述每一個過程的速率常數(shù)有關。如外轉換過程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射。2.熒光強度與溶液濃度之間的關系P12816熒光強度If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率

：

If

=

Ia

由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-

bc

)If=

I0(1-10-bc

)=

I0(1-e-2.3bc

)

濃度很低時，將括號項近似處理后：

If=2.3

I0

bc=Kc只有在極稀的溶液中，當

bc

<0.02時才成立，對于濃度較高的溶液，由于自猝滅和自吸收等原因，使熒光強度和熒光物質濃度不呈線性關系。17分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個條件：物質分子必須具有能吸收一定頻率紫外可見輻射的特征結構，分子必須具有吸光的結構吸光后被激發(fā)的分子還必須具有高的熒光量子產(chǎn)率，許多吸光物質不一定發(fā)熒光，就是由于他們的吸光分子的熒光量子產(chǎn)率不高，而是將其吸收的能量與溶劑分子或其他溶質分子的相互碰撞中消耗掉了，因此不能發(fā)生熒光。3.熒光的產(chǎn)生與分子結構的關系18（1）共軛效應

實驗證明，容易實現(xiàn)

激發(fā)的芳香族化合物容易發(fā)生熒光，能發(fā)生熒光的脂肪族和脂環(huán)族化合物極少（僅少數(shù)高度共軛體系化合物除外）。任何有利于提高

電子共軛程度的結構的改變都將提高熒光效率，并使熒光波長向長波方向移動。共軛效應使熒光增強的原因：主要是由于增大熒光物質的摩爾吸光系數(shù)，有利于產(chǎn)生更多的激發(fā)態(tài)分子，從而有利于熒光的發(fā)生。19(2)剛性平面結構

實驗發(fā)現(xiàn)，多數(shù)具有剛性平面結構的有機分子具有強烈的熒光。因為這種結構可以減少分子的振動，使分子與溶劑或其它溶質分子的相互作用減少，也就減少了碰撞去活的可能性。20（3）取代基效應

芳香族化合物苯環(huán)上的不同取代基對該化合物的熒光強度和熒光光譜有很大的影響。

a.給電子基團，如-OH、-OR、-CN、-NH2

、-NR2等，使熒光增強。因為產(chǎn)生了p-

共軛作用，增強了電子共軛程度，導致熒光增強，熒光波長紅移。b.吸電子基團，如-COOH、-NO、-CO、鹵素等，不能擴大電子共軛程度，反而使S1-T1系間跨越增強，導致熒光減弱，磷光增強。21c.重原子效應：引入質量相對較重的原子出現(xiàn)磷光增強和熒光減弱的現(xiàn)象。

d.

同電子體系相互作用較小的取代基，如-SO3H、-NH3+等，對分子發(fā)光只有很小影響。因此給一個發(fā)光分子引入磺酸基可以增加分子在水溶液中的溶解度。2223（4）躍遷類型

實驗證明，對于大多數(shù)熒光物質，首先經(jīng)歷

或n

激發(fā)，然后經(jīng)過振動弛豫或其他無輻射躍遷，再發(fā)生

或

n躍遷而得到熒光。在這兩種躍遷類型中，

躍遷常能發(fā)出較強的熒光（較大的量子產(chǎn)率）。這是由于

躍遷具有較大的摩爾吸光系數(shù)（一般比n

大100-1000倍），其次，

躍遷的壽命約為10-7-10-9s，比n

躍遷的壽命10-5-10-7s要短。此外，在

躍遷過程中，通過系間竄躍至三重態(tài)的速率常數(shù)也較?。⊿1

T1能級差較大），這也有利于熒光的發(fā)射?？傊?/p>

躍遷是產(chǎn)生熒光的主要躍遷類型。P129244.影響熒光強度的因素P130（1）溶劑的影響一般來說，許多共軛芳香烴化合物熒光強度隨溶劑極性的增加而增強，且熒光峰波長向長波方向移動。在含有重原子的溶劑如碘乙烷和四溴化碳中，與將這些成分引入熒光物中所產(chǎn)生的重原子效應相似，導致熒光減弱，磷光增強。若溶劑和熒光物質形成氫鍵或溶劑使熒光物質解離狀態(tài)改變，則熒光波長和熒光強度也會發(fā)生改變。25（2）溫度的影響

一般來說，大多數(shù)熒光物質的溶液隨著溫度降低，熒光效率和熒光強度將增加；反之，溫度升高熒光效率則下降。如熒光素的乙醇溶液在0oC以下每降低10oC，熒光效率增加3%，冷至-80oC時，熒光效率為100%。這是因為溫度降低時，溶液中分子的活動性減弱，溶液的黏度增大，溶質分子與溶劑分子間碰撞機會減少，降低了各種無輻射去活化概率，使熒光效率增加，熒光強度增強。26（3）溶液pH的影響

帶有酸性或堿性官能團的大多數(shù)芳香族化合物的熒光與溶液的pH有關。不同的pH值，化合物所處狀態(tài)不同，不同的化合物或化合物的分子與其離子在電子構型上有所不同，因此，它們的熒光強度和熒光光譜就有一定的差別。

對于金屬離子與有機試劑形成的發(fā)光鏊合物，一方面pH會影響鏊合物的形成，另一方面還會影響鏊合物的組成，因而影響它們的熒光性質。27（4）熒光的猝滅

熒光物質分子與溶劑分子或其它溶質分子的相互作用引起熒光強度降低的現(xiàn)象稱為熒光猝滅。能引起熒光強度降低的物質稱為猝滅劑。287-3熒光分析儀器

P131光源樣品池激發(fā)單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器、檢測器。特殊點：兩個單色器，光源與檢測器通常成直角。29（1）激發(fā)光源

在紫外-可見區(qū)范圍，通常的光源是氙燈和高壓汞燈，此外高功率連續(xù)可調染料激光光源就是一種新型熒光激發(fā)光源。（2）樣品池

熒光用的樣品池須用低熒光的材料制成，通常用石英，形狀以方形和長方形為宜。（3）單色器

光柵，激發(fā)單色器用于選擇激發(fā)波長；發(fā)射單色器，用于分離出熒光發(fā)射波長。（4）檢測器

由光電管和光電倍增管作檢測器，并與激發(fā)光成直角。307-4熒光分析法及其應用由于能產(chǎn)生熒光（磷光）的化合物占被分析物的數(shù)量相當有限的，并且許多化合物幾乎在同一波長產(chǎn)生光致發(fā)光，所以熒光（磷光）法很少用于定性分析。分子發(fā)光分析法是最靈敏的分析方法之一，其靈敏度在很多情況下比紫外-可見吸收光譜法要高的多，所以更適合低濃度的分析。317-4-1定量分析方法——工作曲線法（1）校準曲線法FCsFxCx（2）標準對照法（比較法）如果熒光物質的校準曲線通過零點，就可以選擇其線性范圍內某一濃度的標準溶液，用標準對照法測定。327-4-2應用1.無機化合物的分析

很多無機離子能與一些有機試劑形成熒光絡合物而被測定，這種試劑稱為熒光試劑，這種方法稱為直接熒光法。還有一些無機離子，它們不能形成熒光絡合物，但能使其他物質的熒光減弱，可利用熒光猝滅法測定。（1）直接熒光法：鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土（2）熒光猝滅法：氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳332.有機化合物的分析此外，藥物中的胺類、甾族類、抗生素、維生素、氨基酸、蛋白質和酶等大多具有熒光，可用熒光法測定。34357-5化學發(fā)光分析法（自學）化學發(fā)光是由化學反應提供的能量激發(fā)物質產(chǎn)生的光輻射。發(fā)生于生物體的化學發(fā)光，稱為生物發(fā)光。利用化學發(fā)光而建立起來的方法，稱為化學發(fā)光分析法。367-5-1化學發(fā)光分析法的基本原理1.化學發(fā)光分析法的基本原理化學發(fā)光是吸收化學反應過程產(chǎn)生的化學能，而使反應產(chǎn)物分子激發(fā)所發(fā)射的光。任何一個化學發(fā)光反應都應包括化學激發(fā)和發(fā)光兩個步驟?；瘜W發(fā)光反應效率

CL，又稱化學發(fā)光的總量子產(chǎn)率。它決定于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學激發(fā)效率

CE和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)射效率

EM。定義為：

CL=發(fā)射光子的分子數(shù)/參加反應的分子數(shù)=

CE

EMAP*P+hv激活發(fā)光37化學發(fā)光必須滿足如下條件：（1）化學反應必須提供足夠的激發(fā)能，激發(fā)能主要來源于反應焓。（2）要有有利的化學反應歷程，使化學反應的能量至少能被一種物質所接受并生成激發(fā)態(tài)。（3）要觀察到化學發(fā)光，激發(fā)態(tài)能釋放光子或能夠轉移它的能量給另一個分子，而使該分子激發(fā)，然后以輻射光子的形式回到基態(tài)。（4）由于化學激活的瞬時性，激活能必須由某一步驟單獨提供，否則，前一步反應所釋放出的能量將會因分子振動而被消耗掉。38

化學發(fā)光反應的發(fā)光強度IcL以單位時間內發(fā)射的光子數(shù)表示。它等于化學發(fā)光效率

CL與單位時間內起了反應的被測反應物A濃度的變化的乘積，即

ICL(t)=

CL

dcA/dt

式中ICL(t)表示t時刻的化學發(fā)光強度，

CL是與分析物有關的化學發(fā)光效率dcA/dt是分析物參加反應的速率。2.化學發(fā)光的強度397-5-2

化學發(fā)光的類型1.直接化學發(fā)光和間接化學發(fā)光直接發(fā)光是被測物作為反應物直接參加化學發(fā)光反應，生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子，此初始激發(fā)態(tài)能輻射光子。

A+B

C*+DC*

C+h

式中A或B是被測物，通過反應生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物C*，當C*躍遷回基態(tài)時，輻射光子40間接發(fā)光是被測物A或B，通過化學反應生成初始激發(fā)態(tài)產(chǎn)物C*，C*不直接發(fā)光，而是將其能量轉移給F，使F躍遷回基態(tài)，產(chǎn)生發(fā)光。

A+B

C*+DC*+F

F*+EF*

F+h

式中C*為能量給予體，而F為能量接受體。412.氣相化學發(fā)光

主要有O3、NO、S的化學發(fā)光反應，可用于監(jiān)測空氣中的O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2等。（1）臭氧的化學發(fā)光反應（2）氮氧化物的化學發(fā)光反應（3）利用氧原子的化學發(fā)光反應423.液相化學發(fā)光用于此類化學發(fā)光分析的發(fā)光物質有魯米諾、光澤堿、洛粉堿等。例如，利用發(fā)光物質魯米諾，可測定痕量的H2O2以及Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce等金屬離子437-5-3化學發(fā)光的測量儀器化學發(fā)光分析法的測量儀器主要包括樣品室、光檢測器、放大器和信號輸出裝置?；瘜W發(fā)光反應在樣品室中進行，樣品和試劑混合的方式有不連續(xù)取樣體系，加樣是間歇的。將試劑先加到光電倍增管前面的反應池內，然后用進樣器加入分析物。另一種方法是連續(xù)流動體系，反應試劑和分析物是定時在樣品池中匯合反應，且在載流推動下向前移動，被檢測的光信號只是整個發(fā)光動力學曲線的一部分，而以峰高進行定量測量。447-5-4化學發(fā)光分析法的特點及應用化學發(fā)光最顯著的特點是：靈敏度高，其檢出限可達10-15mol/L線性范圍寬，一般可達4-5個數(shù)量級操作簡單，易于實現(xiàn)自動化所用儀器設備簡單，不需要光源和單色器，無光散射及雜散光引起背景值的干擾應用：表7-6和表7-745補充：磷光分析法磷光和熒光都是光致發(fā)光，任何發(fā)射磷光的物質也都具有兩個特征光譜，即磷光激發(fā)光譜和磷光發(fā)射光譜。其定量分析的依據(jù)是在一定條件下磷光強度與磷光物質濃度成正