HYT 151-2013 海洋微藻中溶血毒素的檢測(cè) 血細(xì)胞法

海洋微藻中溶血毒素的檢測(cè)血細(xì)胞法Detectionofhemolytictoxinsinmarinemicroalgae—Erythrocytelysis2013-04-25發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家海洋局南海環(huán)境監(jiān)測(cè)中心提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)海洋標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC283)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：國(guó)家海洋局南海環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、暨南大學(xué)。1海洋微藻中溶血毒素的檢測(cè)血細(xì)胞法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用血細(xì)胞法檢測(cè)海洋微藻中溶血毒素活性的方法及技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于自然海水中海洋微藻細(xì)胞中溶血毒素的檢測(cè)，也適用于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的海洋微藻細(xì)胞中溶血毒素的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB17378.3—2007海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第3部分：樣品采集、貯存與運(yùn)輸HY/T069—2005赤潮監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)程3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。海水中粒徑大于2μm的浮游植物。一類(lèi)主要由微藻產(chǎn)生能夠?qū)е聶C(jī)體紅細(xì)胞及其他真核細(xì)胞裂解的糖脂類(lèi)物質(zhì)，其主要作用于敏感細(xì)胞的細(xì)胞膜脂質(zhì)部分。溶血毒素溶解血細(xì)胞的效力。用來(lái)表述溶血毒素活性的量綱。1個(gè)溶血單位相當(dāng)于在1mL反應(yīng)系統(tǒng)中(含檸檬酸緩沖液0.15mL、0.5%的兔血紅細(xì)胞0.80mL和溶血毒素粗提液0.05mL),在37℃水浴30min使紅細(xì)胞溶解50%時(shí)所需溶血毒素的量，相當(dāng)于(1.30±0.39)μg洋地黃皂苷。血細(xì)胞法erythrocytelysis針對(duì)溶血毒素破壞、溶解血細(xì)胞的特性建立的一種檢測(cè)方法，該方法以溶血單位為量綱來(lái)定量溶血毒素的溶血活性。微藻細(xì)胞濃度達(dá)到或超過(guò)HY/T069—2005規(guī)定的基準(zhǔn)濃度的海水樣品。2微藻細(xì)胞濃度未達(dá)到HY/T069—2005規(guī)定的基準(zhǔn)濃度的海水樣品。4原理利用氯仿、甲醇和水體積比為13:7:5的提取液萃取微藻細(xì)胞中的溶血毒素，經(jīng)減壓蒸餾濃縮后，再以甲醇溶液溶解殘留物，得溶血毒素粗提物；用粗提物溶解血細(xì)胞，同時(shí)配置洋地黃皂苷標(biāo)準(zhǔn)系列溶液繪制工作曲線，結(jié)合粗提物的溶血情況計(jì)算溶血毒素的活性。5試劑和材料除非另作說(shuō)明，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純，水是蒸餾水或者等效純水。5.1氯仿(CHCl?)。5.3檸檬酸(C?H?O?·H?O)。5.4洋地黃皂苷(C??H??Oz,99%)。5.5氯化鈉(NaCl)。5.6檸檬酸鈉(C?H?Na?O?·2H?O)。5.7葡萄糖(C?H??O?)。5.8曲拉通X-100(C??H?O?)。5.9醫(yī)用肝素鈉注射液[(C?H??NS?Nag)2o,5000IU/mL]。5.10提取液：氯仿、甲醇和水體積比為13:7:5。5.11檸檬酸溶液(2mol/L):稱(chēng)取檸檬酸(C?H?O?·H?O)42.0g,置于200mL燒杯中，用水溶解后5.12洋地黃皂苷母液(10μg/mL):稱(chēng)取洋地黃皂苷1.0mg,置于200mL燒杯中加水?dāng)嚢柚寥芙?必5.13檸檬酸緩沖液：稱(chēng)取0.8532g氯化鈉(NaCl),2.1680g檸檬酸鈉(C?H?Na?O?·2H?O),4.5180g葡萄糖(C?H??O?),置于500mL燒杯中，用水溶解，用檸檬酸溶液(5.11)調(diào)pH值至7.0,移入250mL5.14兔血紅細(xì)胞溶液(0.5%,體積比):取健康新西蘭兔新鮮血液10mL,加入微量醫(yī)用肝素鈉注射液，以1200r/min的轉(zhuǎn)速離心10min,棄上清液，加入檸檬酸緩沖液(5.13),輕輕搖勻后再次同條件離心，去上清液，反復(fù)三遍，直到上清液無(wú)色，根據(jù)離心后血細(xì)胞體積，用檸檬酸緩沖液(5.13)配成0.5%6儀器設(shè)備6.1分光光度計(jì)：需有540nm的吸收波段。6.3超聲波細(xì)胞粉碎儀：配直徑為2mm的變幅桿，超聲功率可達(dá)200W。6.4天平：感量0.1g。6.5分析天平：感量0.1mg。6.6光學(xué)顯微鏡：配有可放大倍數(shù)為40倍、100倍的物鏡和目鏡。36.14過(guò)濾器：濾頭直徑60mm,配250mL濾杯，1000mL濾瓶。樣品宜立即在3000r/min的轉(zhuǎn)速下離心10min,或用孔徑為0.45μm的纖維素酯微孔濾膜過(guò)濾音箱內(nèi)，超聲功率調(diào)為200W,超聲時(shí)間為5s,間隔時(shí)間為6s,工作時(shí)間為20min,取微量破碎液在顯8分析步驟8.1.1將八支10mL離心管洗凈，后用水潤(rùn)洗三遍后，放置于烘箱內(nèi)80℃干燥20min,取出冷卻照(全溶血)。分別取搖勻后的0.5%兔血紅細(xì)胞溶液(5.14)1.60mL,依次加入上述離心管中。8.1.2所有離心管置于37℃水浴鍋內(nèi)，30min后取出，以800r/min的轉(zhuǎn)速離心10min,取上清液，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)540nm處檢測(cè)吸光度值A(chǔ);,陰性對(duì)照吸光度值為A。,陽(yáng)性對(duì)照吸光度值為A.。4式中：P;——工作曲線溶血百分?jǐn)?shù)；A;——洋地黃皂苷母液作用于血細(xì)胞后的吸光值；A?——陰性對(duì)照的吸光值；A.——陽(yáng)性對(duì)照的吸光值。8.2樣品測(cè)定8.2.1空白對(duì)照測(cè)定：取10mL離心管，置于冰上，加入0.10mL甲醇、0.30mL檸檬酸緩沖液(5.13)和1.60mL0.5%的兔血紅細(xì)胞溶液(5.14,吸取前應(yīng)搖勻),置于37℃水浴鍋內(nèi)，反應(yīng)30min后取出，立即以800r/min的轉(zhuǎn)速離心10min,取上清液，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)540nm處檢測(cè)其吸光度值A(chǔ)to,Aw為空白對(duì)照1的吸光值。取10mL離心管，置于冰上，加入0.10mL毒素粗提物和1.90mL檸檬酸緩沖液(5.13),置于37℃水浴鍋內(nèi)，反應(yīng)30min后取出，立即以800r/min的轉(zhuǎn)速離心10min,取上清液，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)540nm處檢測(cè)其吸光度值A(chǔ),w,A,w為空白對(duì)照2的吸光值。8.2.2樣品測(cè)定：取10mL離心管，置于冰上，加入0.10mL毒素粗提物、0.30mL檸檬酸緩沖液(5.13)和1.60mL0.5%的兔血紅細(xì)胞溶液(5.14,吸取前應(yīng)搖勻),置于37℃水浴鍋內(nèi)，反應(yīng)30min后取出，立即以800r/min的轉(zhuǎn)速離心10min,取上清液，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)540nm處檢測(cè)其吸光度值A(chǔ)。,A。為測(cè)試樣品的吸光值。8.2.3當(dāng)樣品溶血后的吸光值大于或等于陽(yáng)性對(duì)照(全溶血)的吸光值時(shí)，毒素粗提物樣品用甲醇稀釋后按照8.2.1測(cè)試。8.3數(shù)據(jù)記錄將測(cè)得的相應(yīng)數(shù)據(jù)記入表A.2中。9結(jié)果計(jì)算按照式(2)計(jì)算樣品溶血百分?jǐn)?shù)(Pa)。 (2)P?！獦悠啡苎俜?jǐn)?shù)；A。——測(cè)試樣品的吸光值；Aw——為空白對(duì)照1的吸光值；Aw——為空白對(duì)照2的吸光值。由工作曲線查得P。相當(dāng)于洋地黃皂苷的量m,按照式(3)計(jì)算溶血活性(HA)。 (3)m——工作曲線中洋地黃皂苷的量，單位為微克(μg);ED??——當(dāng)P;為50%時(shí)的洋地黃皂苷的量，單位為微克(μg);5V——濃縮前樣品的體積，單位為升(L);10精密度與準(zhǔn)確度當(dāng)樣品中溶血毒素的溶血活性為230HU/L時(shí)，6家實(shí)驗(yàn)室對(duì)同一批樣品進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.77%,再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為22.4%。6(規(guī)范性附錄)檢測(cè)過(guò)程中所用記錄表的格式表A.1所示為檢測(cè)工作曲線的數(shù)據(jù)記錄表。表A.2所示為樣品檢測(cè)記錄表。表A.1海洋微藻中溶血毒素的檢測(cè)工作曲線數(shù)據(jù)記錄(血細(xì)胞法)吸光值編號(hào)曲拉通X-10001234567洋地黃皂苷母液濃度/(pg/mL)表A.2海洋微藻中溶血毒素的檢測(cè)樣品檢測(cè)記錄(血細(xì)胞法)樣品溶血百分?jǐn)?shù)(Pa)[1]彭喜春.球形棕囊藻溶血毒素及其生物合成機(jī)制的研究[D].廣州：華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，2005:10-60.[2]商文.球形棕囊藻對(duì)幾種海洋生物的毒性效應(yīng)研究[D].廣州：暨南大學(xué)，2006:14-22.[3]宋秀凱.魚(yú)腥藻溶血素分泌的理化條件及溶血作用研究[D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2005:[4]周成旭，傅永靜，嚴(yán)小軍.4種典型有害赤潮原因種的溶血特性研究[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào).2007,2(1):78-82.[5]何家菀，陳明惠，何振容.小定鞭藻毒素的分離與鑒定[J].水生生物學(xué)報(bào).1996,20(1):41-48.[6]何家菀，施之新，張銀華，等.一種棕囊藻的形態(tài)特征與毒素分析[J].海洋與湖沼.1999,30[7]崔偉民，楊維東，劉潔生，等.米氏凱倫藻溶血毒素的溶血反應(yīng)特征[J].2009,17(3):237-24.[8]TatumNeely,LisaCampbell.AmodifiedassaytomongKareniaclonesisolatedfromtheGulfofMexico[J].HarmfulAlgae.2006,5:592-598.[9]M.KarindeBoer,MonikaR.Tyl,MengFibrocapsajaponica(Raphid