生物（人教版選修3）課件1.1DNA重組技術的基本工具

專題一基因工程1．1

DNA重組技術的基本工具1．認同基因工程的誕生和發(fā)展離不開理論研究和技術創(chuàng)新。2．簡述DNA重組技術所需三種基本工具的作用。3．簡述基因工程中載體需要具備的條件。一、基因工程的概念基因工程的別名

技術操作環(huán)境生物體外操作對象操作水平基本過程剪切→

→

→表達結果人類需要的新的

和________DNA重組基因DNA分子水平拼接導入生物類型生物產(chǎn)品1．從DNA結構及配對方式的角度分析，為什么不同生物的DNA能夠重組？提示：(1)基本結構相同。(2)空間結構相同。(3)堿基配對方式相同。二、DNA重組技術的基本工具1．限制性核酸內切酶(也稱“限制酶”)(1)來源：主要來自于

。(2)種類：約

種。(3)特點：具有專一性。表現(xiàn)在兩個方面：①識別雙鏈DNA的某種

序列。②切割特定核苷酸序列中的特定位點。(4)作用：斷裂

的兩個核苷酸之間的

。(5)結果：產(chǎn)生黏性末端或

。原核生物4000特定核苷酸特定部位磷酸二酯鍵平末端2．DNA連接酶——“分子縫合針”(2)作用：形成

。(3)結果：形成重組DNA分子。磷酸二酯鍵3．基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”(1)作用：攜帶

片段進入受體細胞。(2)種類：

、

的衍生物、動植物病毒等。(3)特點：①能夠在受體細胞中進行

或整合到

上，隨染色體DNA進行

。②有

限制酶切割位點，供外源DNA片段(基因)插入。③具有特殊的標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。外源基因質粒λ噬菌體自我復制染色體DNA一個至多個2．為什么在使用限制酶時，每種酶的切割位點最好只有一個？提示：若用于切割載體的限制酶有多個切割位點，則切割后質粒可能會丟失某些片段，若丟失的片段含有復制原點，則重組DNA分子進入受體后便不能進行自主復制。一、幾種工具酶的作用比較1．限制性核酸內切酶與DNA連接酶的比較(1)區(qū)別：作用應用限制性核酸內切酶使特定部位的磷酸二酯鍵斷裂用于提取目的基因和切割載體DNA連接酶在DNA片段之間重新形成磷酸二酯鍵用于基因表達載體的構建(2)兩者的關系可表示為：2．限制性核酸內切酶與解旋酶的比較(1)相同點：都是作用于DNA分子中的化學鍵。(2)不同點：作用部位不同，前者作用于磷酸二酯鍵，后者作用于氫鍵。3．DNA連接酶與DNA聚合酶的比較DNA連接酶DNA聚合酶相同點催化兩個脫氧核苷酸之間形成磷酸二酯鍵不同點模板不需要模板需要DNA的一條鏈為模板作用對象游離的DNA片段單個的脫氧核苷酸作用結果形成完整的DNA分子形成DNA的一條鏈用途基因工程DNA復制4.四種酶的作用部位圖解(1)作用于a(磷酸二酯鍵)的酶有：限制酶、DNA連接酶、DNA聚合酶。(2)作用于b(氫鍵)的酶有解旋酶。【特別提醒】(1)限制性核酸內切酶是一類酶而不是一種酶。(2)限制性核酸內切酶作用的化學鍵為磷酸二酯鍵，而不是氫鍵。(3)DNA連接酶無識別的特異性，凡兩個黏性末端(或平末端)能互補配對，DNA連接酶就能催化其“縫合”，重新形成DNA分子。(4)氫鍵的形成不需要DNA連接酶。

下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2中箭頭表示相關限制酶的酶切位點。請回答下列問題：限制酶BamHⅠHind

ⅢEcoRⅠSma

Ⅰ識別序列及切割位點↓

GGATCCCCTAGG

↑↓

AAGCTTTTCGAA

↑↓

GAATTCCTTAAG

↑↓CCCGGGGGGCCC↑(1)一個圖1所示的質粒分子經(jīng)SmaⅠ切割前后，分別含有______個游離的磷酸基團。(2)若對圖中質粒進行改造，插入的SmaⅠ酶切位點越多，質粒的熱穩(wěn)定性越______。(3)用圖中的質粒和外源DNA構建重組質粒，不能使用Sma

Ⅰ切割，原因是___________________________________。(4)與只使用EcoRI相比較，使用BamHⅠ和Hind

Ⅲ兩種限制酶同時處理質粒、外源DNA的優(yōu)點在于可以防止________________________________________________。(5)為了獲取重組質粒，將切割后的質粒與目的基因片段混合，并加入______酶。(6)現(xiàn)使用BamHⅠ和Hind

Ⅲ兩種限制酶同時處理質粒、外源DNA，并經(jīng)拼接獲得的重組質粒進行再次酶切，假設所用的酶均可將識別位點完全切開，請根據(jù)圖1、2中標示的酶切位點及表中所列的識別序列，對以下酶切結果作出判斷：①采用BamHⅠ和Hind

Ⅲ酶切，得到______種DNA片段。②采用EcoRⅠ和Hind

Ⅲ酶切，得到______種DNA片段。解析：(1)該質粒為環(huán)狀DNA，經(jīng)SmaⅠ切割前，不含有游離的磷酸基團，經(jīng)SmaⅠ切割后形成平末端，含有2個游離的磷酸基團。(2)SmaⅠ識別的是CCCGGG序列，在C與G之間切割，SmaⅠ酶切位點越多，也就是C－G堿基對越多，C與G之間的氫鍵(3個)比A與T之間的氫鍵(2個)數(shù)量多，其含量越多，質粒的熱穩(wěn)定性越高。(3)據(jù)圖1可知，SmaⅠ切割位點在抗生素抗性基因(標記基因)中，據(jù)圖2可知，SmaⅠ切割位點在目的基因中，因此使用SmaⅠ切割會破壞質粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因。(4)用同一種限制酶處理質粒和外源DNA，再用DNA連接酶連接時，往往會有三種連接形式：目的基因—質粒、目的基因—目的基因(環(huán)化)、質?！|粒(環(huán)化)，后兩種是我們不需要的，因而要進行篩選。用兩種限制酶處理質粒和外源DNA，因形成的末端不同可避免上述情況的發(fā)生。(5)連接質粒與目的基因的工具酶是DNA連接酶。(6)分析由BamHⅠ和Hind

Ⅲ兩種限制酶同時處理質粒、外源DNA，并經(jīng)拼接獲得的重組質粒，這兩種酶的識別序列仍然完整存在，如再用BamHⅠ和Hind

Ⅲ兩種限制酶進行酶切時，可再度被切開，形成2種DNA片段；而EcoRⅠ的識別序列在原質粒中存在并沒有破壞，同時切下的目的基因中還存在1個EcoRⅠ的識別序列，因此在重組質粒中存在2個EcoRⅠ的識別序列，如用EcoRⅠ和Hind

Ⅲ酶切，可得到3種DNA片段。答案：(1)0、2

(2)高(3)SmaⅠ會破壞質粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因(4)質粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化(5)DNA連接(6)①2

②3【歸納拓展】(1)限制酶切割形成黏性末端的幾種類型：①不同DNA分子用同一種限制酶切割形成的黏性末端都相同。②同一個DNA分子用不同的限制酶切割，產(chǎn)生的黏性末端一般不相同。③不同限制酶切割不同DNA分子形成相同黏性末端，如互補則可以相互重新配對。(2)切割質粒時，標記基因不能全部被破壞。1．下圖為DNA分子在不同酶的作用下所發(fā)生的變化，圖中依次表示限制性核酸內切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、解旋酶作用的正確順序是(

)A．①②③④

B．①②④③C．①④②③ D．①④③②解析：本題考查不同工具酶的作用及作用特點。圖示中①表示該酶切割DNA分子雙鏈產(chǎn)生黏性末端的過程，用到的酶是限制性核酸內切酶，②是黏性末端連接的過程，用到的酶是DNA連接酶，③是DNA分子解旋的過程，要用解旋酶，④是DNA復制時子鏈的形成過程，需要DNA聚合酶。答案：C二、基因工程中常用的載體——質粒1．種類(1)常用載體：質粒，它是一種裸露的、結構簡單、獨立于細菌擬核DNA之外，具有自我復制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。(2)其他載體：λ噬菌體的衍生物、動植物病毒等。3．作用(1)用它作為運輸工具，將目的基因送入受體細胞中去。(2)利用它在受體細胞內對目的基因進行大量復制?！咎貏e提醒】一般來說，天然載體往往不能滿足上述要求，因此要根據(jù)不同的目的和需要，對載體進行人工改造，現(xiàn)在所使用的質粒幾乎都是經(jīng)過改造的。

質粒是基因工程中最常用的載體，它存在于許多細菌體內。質粒上有標記基因如圖所示，通過標記基因可以推知外源基因(目的基因)是否轉入成功。外源基因插入的位置不同，細菌在培養(yǎng)基上的生長情況也不同，下表是外源基因插入位置(插入點有a、b、c)，請根據(jù)表中提供的細菌生長情況，推測①②③三種重組后細菌的外源基因插入點，正確的一組是A．①是c；②是b；③是aB．①是a和b；②是a；③是bC．①是a和b；②是b；③是aD．①是c；②是a；③是b細菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上的生長狀況細菌在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上的生長狀況①能生長能生長②能生長不能生長③不能生長能生長解析：對①細菌來說，能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長，也能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長，說明抗氨芐青霉素基因和抗四環(huán)素基因都沒有被破壞，插入點是c；對②細菌來說，能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長，說明其抗氨芐青霉素基因正常，不能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長，說明其抗四環(huán)素基因被破壞，插入點應為b；對③細菌來說，不能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長，說明其抗氨芐青霉素基因被插入而破壞，故插入點為a。答案：A【名師點睛】基因工程所用載體與細胞膜上載體的比較(1)化學本質不同：作為基因運輸工具的載體其化學本質是DNA或動植物病毒或λ噬菌體的衍生物，而細胞膜上的載體的化學本質是蛋白質。(2)作用不同：基因工程所用載體是將目的基因導入受體細胞中；細胞膜上的載體是離子或某些小分子進出細胞的運輸工具。2．作為基因的運輸工具——載體，必須具備的條件及理由是(

)A．能夠在宿主細胞中穩(wěn)定地保存下來并大量復制，以便提供大量的目的基因B．具有多個限制酶切點，以便于目的基因的表達C．具有某些標記基因，以便為目的基因的表達提供條件D．能夠在宿主細胞中復制并穩(wěn)定保存，以便于進行篩選解析：作為載體要攜帶目的基因進入受體細胞并使之表達；必須能夠在宿主細胞中穩(wěn)定地保存并大量復制，以便通過復制提供大量目的基因；同時要具有標記基因，是為了通過標記基因是否表達來判斷目的基因是否進入了受體細胞，便于篩選。載體要具有多個限制酶切點，為了便于與外源基因連接。答案：A一、尋根問底1．根據(jù)你所掌握的知識，你能推測這類酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？(教材P4)提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，以防止外來病原體的侵害。限制酶就是細菌的一種防御性工具，當外源DNA入侵時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA，使之失效，從而達到保護自身的目的。2．DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？(教材P6)提示：不是一回事。(1)DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有核酸片段的3′末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；