實(shí)驗(yàn)-重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)——重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞實(shí)驗(yàn)原理DNA分子轉(zhuǎn)化進(jìn)入受體菌的過(guò)程如下：吸附——完整的DNA分子吸附在受體菌的表面；轉(zhuǎn)入——雙鏈DNA分子解鏈，單鏈DNA進(jìn)入受體菌，另一條鏈降解；自穩(wěn)——外源質(zhì)粒DNA分子在細(xì)胞內(nèi)又復(fù)制成雙鏈環(huán)狀DNA；表達(dá)——供體基因隨同復(fù)制子同時(shí)復(fù)制，并被轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)譯。實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)用的載體DNA為質(zhì)粒pUC19，內(nèi)含氨芐青霉素（Amp）的抗性基因（Ampr基因），經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌能在含有Amp的平板上生長(zhǎng)，說(shuō)明轉(zhuǎn)化成功。pUC19質(zhì)粒還可導(dǎo)致受體菌產(chǎn)生α-互補(bǔ)現(xiàn)象，在含有IPTG和X-gal的平板上形成藍(lán)色菌落。外源基因的插入破壞α-互補(bǔ)作用，在同樣的平板上形成白色菌落。實(shí)驗(yàn)原理IPTG：Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷X-gal：5-Bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galactopyranoside；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理操作步驟取三個(gè)1.5mL離心管，各加入100

L大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。往1＃管中加入2

LpUC19質(zhì)粒；其余兩管各加入5

L連接物（上周所做），加入后反復(fù)吹吸幾次混勻，冰浴60min。離心管在42

C水浴放置100s后立刻冰浴2min。加入1mLLB培養(yǎng)基，混合后37

C水浴45min，期間每隔15min左右反復(fù)顛倒離心管幾次。12000rpm離心30s。吸去大部分上清，殘留100

L左右，再用槍頭反復(fù)吹吸，使之成為細(xì)胞懸液，涂布在平板上。平板37℃倒置培養(yǎng)12-16hr，挑選不產(chǎn)藍(lán)色色素的白色單菌落，初步確定為所需轉(zhuǎn)化子。操作步驟平板的準(zhǔn)備：熔化LB固體培養(yǎng)基，每100mL中添加100mg/mLAMP100

L、48mg/mLIPTG100

L、20mg/mLX-gal200

L。鋪制平板三塊。注意事項(xiàng)注意無(wú)菌操作，避免染菌。注意用火安全。Amp溶液解凍后會(huì)有沉淀，稍稍加熱使沉淀溶化才可使用。嚴(yán)格控制熱激活溫度和時(shí)間。思考題轉(zhuǎn)化后，