(高清版)GBT 8381.3-2023 飼料中林可胺類(lèi)藥物的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

GB/T8381.3—2023代替GB/T8381.3—2005飼料中林可胺類(lèi)藥物的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法2023-08-06發(fā)布國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件代替GB/T8381.3—2005《飼料中林可霉素的測(cè)定》,與GB/T8381.3—2005相比，除結(jié)構(gòu)調(diào)整和編輯性改動(dòng)外，主要技術(shù)變化如下：a)更改了適用范圍(見(jiàn)第1章，2005年版的第1章);b)更改了原理(見(jiàn)第4章，2005年版的第4章);c)更改了試劑或材料(見(jiàn)第5章，2005年版的第5章);d)更改了儀器設(shè)備(見(jiàn)第6章，2005年版的第6章);e)更改了試驗(yàn)步驟(見(jiàn)第8章，2005年版的第8章);f)更改了試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理(見(jiàn)第9章，2005年版的10.2)。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由全國(guó)飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC76)提出并歸口。本文件起草單位：浙江大學(xué)、浙江青蓮食品股份有限公司。本文件主要起草人：王鳳芹、汪以真、路則慶、馮杰、王騰浩、劉波靜、程遠(yuǎn)之、靳明亮、王新霞、本文件及其所代替文件的歷次版本發(fā)布情況為：——2005年首次發(fā)布為GB/T8381.3—2005;——本次為第一次修訂。1飼料中林可胺類(lèi)藥物的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法1范圍本文件描述了飼料中林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯和吡利霉素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。本文件適用于配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料和添加劑預(yù)混合飼料中林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯和吡利霉素的測(cè)定。本文件的檢出限為10μg/kg、定量限為40μg/kg。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4原理試樣中待測(cè)物用甲醇-磷酸鹽緩沖溶液提取，經(jīng)混合型強(qiáng)陽(yáng)離子交換固相萃取小柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，外標(biāo)法定量。5試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?.5鹽酸溶液：移取0.9mL鹽酸，用水稀釋至100mL,混勻。5.6磷酸鹽緩沖溶液(pH8.0):稱(chēng)取11.411g三水磷酸氫二鉀，加入430mL水溶解，用鹽酸溶液(5.5)調(diào)節(jié)pH至8.0±0.1,用水稀釋至500mL,混勻。5.7甲醇-磷酸鹽緩沖溶液：取800mL甲醇(5.3),加入200mL磷酸鹽緩沖溶液(5.6),混勻。5.8甲酸溶液I:取1mL甲酸(5.2),用水稀釋至100mL,混勻。25.9甲酸溶液Ⅱ:取1mL甲酸(5.2),用水稀釋至1000mL,混勻。5.10氨化甲醇溶液：取5mL氨水，用甲醇(5.3)稀釋至100mL,混勻。5.11甲醇溶液：取50mL甲醇(5.3),用水稀釋至100mL,混勻。5.12標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(500μg/mL):分別稱(chēng)取鹽酸林可霉素(CAS號(hào)：859-18-7,純度≥98%)、鹽酸克林霉素(CAS號(hào)：21462-39-5,純度≥98%)、克林霉素磷酸酯(CAS號(hào)：24729-96-2,純度≥98%)和鹽酸吡利霉素(CAS號(hào)：78822-40-9,純度≥98%)各適量(如所用標(biāo)準(zhǔn)品為相應(yīng)的鹽，則折算成有效成分)(精確至0.01mg),用甲醇(5.3)溶解并稀釋定容，混勻，制成質(zhì)量濃度均為500μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。于一18℃以下保存，有效期3個(gè)月。5.13混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(10μg/mL):準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(5.12)各1mL于50mL容量瓶中，用甲醇(5.3)稀釋并定容，混勻。于2℃~8℃保存，有效期7d。5.14混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(5.13)適量，用甲醇溶液(5.11)配制成質(zhì)量濃度分別為1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L和200μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。臨用5.15混合型強(qiáng)陽(yáng)離子交換固相萃取小柱：500mg/6mL,或性能相當(dāng)者。6儀器設(shè)備6.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源(ESI)。6.2分析天平：精度0.01g和0.01mg。6.3離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于8000r/min。6.4超聲波清洗儀。6.5固相萃取裝置。7樣品按GB/T20195制備試樣。取樣品至少200g,粉碎使其全部通過(guò)0.425mm孔徑的分析篩，充分混8試驗(yàn)步驟平行做兩份試驗(yàn)。稱(chēng)取2.5g(精確至0.01g)試樣于50mL離心管中，準(zhǔn)確加入25mL甲醇-磷酸鹽緩沖溶液(5.7),渦旋混勻，超聲提取15min,于8000r/min離心5min,取上清液于另一支50mL離心管中。重復(fù)提取一次，合并上清液，混勻。準(zhǔn)確移取2.5mL(V?)于10mL離心管中，加入2.5mL甲8.2凈化依次用6mL甲醇(5.3)、6mL水和6mL甲酸溶液I(5.8)活化固相萃取小柱，備用液(8.1)全部過(guò)柱，分別用6mL甲酸溶液I(5.8)、6mL水和6mL甲醇(5.3)淋洗，抽干。用3mL氨化甲醇溶液3(5.10)洗脫，收集洗脫液于50℃氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入2.5mL(V?)甲醇溶液(5.11),渦旋溶解，微孔濾膜8.3儀器參考條件8.3.1液相色譜參考條件液相色譜參考條件如下：a)色譜柱：C?色譜柱，柱長(zhǎng)50mm,內(nèi)徑2.1mm,粒徑1.7μm,或性能相當(dāng)者；b)流動(dòng)相：A——甲酸溶液Ⅱ(5.9),B——乙腈(5.4);c)梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1;表1梯度洗脫程序時(shí)間/minA/%B/%224.5228.3.2質(zhì)譜參考條件質(zhì)譜參考條件如下：a)電離方式：電噴霧電離，正離子模式(ESI+);b)檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);e)脫溶劑氣流速：1000L/h;f)霧化氣、干燥氣為高純氮?dú)?，碰撞氣為高純氬氣或其他合適氣體；g)監(jiān)測(cè)離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能量見(jiàn)表2。表2林可胺類(lèi)藥物的監(jiān)測(cè)離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能量參考值化合物母離子(m/z)子離子(m/z)錐孔電壓/V碰撞能量/eV林可霉素407.4359.5克林霉素425.4377.44GB/T8381.3—2023表2林可胺類(lèi)藥物的監(jiān)測(cè)離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能量參考值(續(xù))化合物母離子(m/z)子離子(m/z)錐孔電壓/V碰撞能量/eV克林霉素磷酸酯505.2457.4吡利霉素411.2363.3”定量離子。8.4測(cè)定8.4.1標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和試樣溶液測(cè)定在儀器的最佳條件下，分別取混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液(5.14)和試樣溶液上機(jī)測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)溶液的定量離子對(duì)色譜圖見(jiàn)附錄A。8.4.2定性在相同試驗(yàn)條件下，試樣溶液中待測(cè)物的保留時(shí)間應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)系列溶液(濃度相當(dāng))中待測(cè)物的保留時(shí)間一致，其相對(duì)偏差在±2.5%之內(nèi)。根據(jù)表2選擇的定性離子對(duì)，比較試樣譜圖中待測(cè)物監(jiān)測(cè)離子對(duì)的相對(duì)離子豐度與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中對(duì)應(yīng)的監(jiān)測(cè)離子對(duì)的相對(duì)離子豐度，若最大允許偏差不超過(guò)表3規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對(duì)應(yīng)的待測(cè)物。表3定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差相對(duì)離子豐度/%最大允許偏差/%8.4.3定量在儀器最佳工作條件下，混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液與試樣溶液交替進(jìn)樣，采用外標(biāo)法定量。以標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測(cè)組分的峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測(cè)組分的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.99。試樣溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線(xiàn)性范圍內(nèi)。當(dāng)試樣的上機(jī)濃度超過(guò)線(xiàn)性范圍時(shí)，需根據(jù)測(cè)定濃度稀釋后進(jìn)行重新測(cè)定。單點(diǎn)校準(zhǔn)定量時(shí)，試樣溶液中待測(cè)物的濃度與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度相差不超過(guò)30%。9試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理點(diǎn)校準(zhǔn)按式(2)計(jì)算：式中：p——從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得的試樣溶液待測(cè)物的質(zhì)量濃度，單位為微克每升(μg/L);5GB/T8381.3—2023V——試樣提取溶液的體積，單位為毫升(mL);V?——上機(jī)前最終定容體積，單位為毫升(mL);n——超出線(xiàn)性范圍后試樣溶液的稀釋倍數(shù)；V?——移取上清液的體積，單位為毫升(mL);m——試樣的質(zhì)量，單位為克(g)。 (2)式中：A——試樣溶液中待測(cè)物的色譜峰面積；p、——標(biāo)準(zhǔn)工作液中待測(cè)物的質(zhì)量濃度，單位為微克每升(μg/L);V——試樣提取溶液的體積，單位為毫升(mL);V?——上機(jī)前最終定容體積，單位為毫升(mL);n——超出線(xiàn)性范圍后試樣溶液的稀釋倍數(shù)；A、——標(biāo)準(zhǔn)工作液中待測(cè)物的色譜峰面積；V?——移取上清液的體積，單位為毫升(mL);測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。10