種子室內(nèi)檢驗(yàn)-品種純度的電泳測(cè)定理論基礎(chǔ)

不連續(xù)緩沖系統(tǒng)的電泳分離原理一、不連續(xù)緩沖系統(tǒng)的特點(diǎn)不連續(xù)緩沖系統(tǒng)的凝膠不同。在不連續(xù)緩沖系統(tǒng)中，樣品加在孔徑大的濃縮膠上，而濃縮膠則聚合在小孔徑的分離膠之上。一、不連續(xù)緩沖系統(tǒng)的特點(diǎn)樣品直接加在濃縮膠形成的小槽中一、不連續(xù)緩沖系統(tǒng)的特點(diǎn)不連續(xù)緩沖系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)是凝膠上可加體積相當(dāng)大的蛋白質(zhì)稀溶液，仍然可以使樣品的各組分得到良好的分離。

蛋白質(zhì)樣品在小孔徑的分離膠中分離之前，先經(jīng)過(guò)大孔徑濃縮膠的遷移作用而被濃縮至一極狹窄的區(qū)帶。我國(guó)當(dāng)前應(yīng)用的玉米種子鹽溶蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，就是利用4.65%濃縮膠，PH3.2；9.3%分離膠，PH5.6的不連續(xù)緩沖系統(tǒng)。二、不連續(xù)緩沖系統(tǒng)的電泳分離原理電泳分離樣品濃縮效應(yīng)樣品分子篩效應(yīng)電荷效應(yīng)二、不連續(xù)緩沖系統(tǒng)的電泳分離原理——樣品的濃縮效應(yīng)濃縮膠為大孔徑膠，樣品在其中濃縮，并按其遷移率遞減的順序逐漸在其與分離膠的界面上積聚成薄層。分離膠為小孔徑膠，樣品在其中進(jìn)行電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)分離。

蛋白質(zhì)分子在大孔徑膠中受到的阻力小，移動(dòng)速度快。進(jìn)入小孔徑凝膠時(shí)的阻力大，速度就減慢了。

由于凝膠層的不連續(xù)性，因此在大孔徑與小孔徑凝膠的界面處就使蛋白質(zhì)樣品高度濃縮，堆積成層，形成一狹小的高濃度的蛋白質(zhì)區(qū)帶。二、不連續(xù)緩沖系統(tǒng)的電泳分離原理——樣品的濃縮效應(yīng)不連續(xù)系統(tǒng)濃縮效應(yīng)示意圖二、不連續(xù)緩沖系統(tǒng)的電泳分離原理——分子篩效應(yīng)

樣品通過(guò)一定孔徑的凝膠時(shí)，小分子走在前面，大分子走在后面。二、不連續(xù)緩沖系統(tǒng)的電泳分離原理——電荷效應(yīng)

由于每種蛋白質(zhì)分子所載有效電荷不同，因而遷移率不同。

承載有效電荷多的，泳動(dòng)的快，反之，則慢。電泳法測(cè)定品種純度的程序電泳法測(cè)定品種純度的程序藥品的配制樣品提取液凝膠溶液電極緩沖液樣品的提取凝膠的制備加樣和電泳染色和譜帶分析染色液一、藥液的配制染色液提取液電極液凝膠液一、樣品的提取

不同電泳方法提取液和提取的程序不同，應(yīng)按具體方法配制提取液和操作。1、清蛋白

能溶于水。包括大多數(shù)酶蛋白。通?？捎猛っ鸽娪痉椒ㄨb定。

2、球蛋白

難溶于水，能溶于稀鹽溶液；玉米鹽溶蛋白電泳鑒定方法就是對(duì)球蛋白進(jìn)行鑒定。

3、醇溶蛋白

不溶于水，但能溶于70～80％的乙醇。小麥和大麥種子醇溶蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳。

4、谷蛋白

不溶于水、醇，可溶于稀酸、稀堿中。二、樣品的提取二、樣品的提取三、凝膠的制備1、連續(xù)電泳只有分離膠（小麥、大麥PAGE電泳）；2、不連續(xù)電泳有分離膠和濃縮膠（玉米鹽溶蛋白電泳鑒定方法）。三、凝膠的制備樣品梳取出后，將槽內(nèi)殘余的溶液用針管吸出。四、加樣和電泳加樣量應(yīng)根據(jù)提取液中蛋白質(zhì)的含量確定，一般10～30μl。四、加樣和電泳1、電泳時(shí)一般采用穩(wěn)壓（農(nóng)業(yè)部玉米鹽溶蛋白電泳鑒定方法：穩(wěn)壓500V）。一般以凝膠板在電泳時(shí)不過(guò)熱為準(zhǔn)。2、電泳時(shí)為了指示電泳的過(guò)程，可加入指示劑，根據(jù)指示劑移動(dòng)的速度確定電泳時(shí)間。

（1）對(duì)陽(yáng)離子電泳系統(tǒng)（pH＜pI時(shí)，酸性電泳）：可用甲基綠作指示劑。點(diǎn)樣端接正極，另一端接負(fù)極。即上端接正極，下端接負(fù)極。

（2）對(duì)陰離子電泳系統(tǒng)（pH＞pI時(shí)；堿性電泳）：用溴酚藍(lán)作指示劑。點(diǎn)樣端接負(fù)極，另一端接正極。即上端接負(fù)極，下端接正極。五、染色

蛋白質(zhì)目前用得較多的染色液是10％三氯乙酸（可以10～12％）、0.05～0.1％考馬斯亮藍(lán)R—250，該染色液染色后一般不需要脫色。六、譜帶分析1、根據(jù)蛋白譜帶的組成及帶型的一致性，區(qū)分本品種和異品種。2、

雜種F1表現(xiàn)為雙親共顯性：即在父母本中所具有的蛋白質(zhì)譜帶，在F1代種子內(nèi)同時(shí)出現(xiàn)，沒(méi)有新的譜帶產(chǎn)生。3、

根據(jù)互補(bǔ)帶的有無(wú)區(qū)分自交粒和雜交粒。在互補(bǔ)帶存在的條件下：

（1）如果同時(shí)出現(xiàn)了父母本所沒(méi)有的譜帶，可判為親本不純。

（2）如果互補(bǔ)帶的二條有其中一條缺失，則為自交粒。

（3）如果整個(gè)帶型與本品種有很大差異，則為雜粒。

電泳法測(cè)定品種純度的原理一、蛋白質(zhì)電泳及其分類(lèi)

蛋白質(zhì)在高于或低于其等電點(diǎn)的溶液中為帶電的顆粒，在電場(chǎng)中能向正極或負(fù)極移動(dòng)。這種通過(guò)蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù),稱(chēng)為電泳

。電泳的種類(lèi)繁多。電泳按支持介質(zhì)可分為薄膜電泳、凝膠電泳（淀粉凝膠電泳、瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳）。二、電泳法測(cè)定品種純度的遺傳基礎(chǔ)1、目前品種純度鑒定主要以蛋白質(zhì)為電泳對(duì)象

不同品種的遺傳基礎(chǔ)DNA不同，其轉(zhuǎn)錄、翻譯而成的蛋白質(zhì)也不同。因此，分析蛋白質(zhì)的差異從本質(zhì)上說(shuō)是分析遺傳的差異，即品種的差異。

電泳法鑒定種子純度主要利用電泳技術(shù)對(duì)品種的蛋白質(zhì)的組分進(jìn)行分析，找出品種間差異的生化指標(biāo)，以此區(qū)分不同的品種，測(cè)定品種純度。二、電泳法測(cè)定品種純度的遺傳基礎(chǔ)2、蛋白質(zhì)由數(shù)條氨基酸長(zhǎng)鏈構(gòu)成，而氨基酸為兩性電解質(zhì)

pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸的兼性離子陽(yáng)離子陰離子三、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)的原理作為電泳支持物的聚丙烯酰胺凝膠是丙烯酰胺通過(guò)交聯(lián)劑（N，N-亞甲基雙丙烯酰胺）在催化劑作用下聚合而成的高分子膠狀聚合物（三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠）。

聚丙稀酰胺凝膠電泳（簡(jiǎn)稱(chēng)PAGE）因其凝膠透明度高、彈性好、無(wú)吸附性、濃度易控制，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的電泳分離。三、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)的原理1、分子篩效應(yīng)

由于蛋白質(zhì)分子的大小、形狀不同，在電場(chǎng)作用下通過(guò)一定孔徑的凝膠時(shí)，受到的阻力大小不同，小分子較易通過(guò)，大分子較難通過(guò)，從而在電泳凝膠上被分開(kāi)，即所謂的分子篩效應(yīng)。

凝膠就如同一張多孔的“篩子”，這些“篩子”起著分子篩的作用，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的電泳，性質(zhì)相同的蛋白質(zhì)就運(yùn)動(dòng)在一起，性質(zhì)不同的蛋白質(zhì)就得到了分離。三、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)的原理2、電荷效應(yīng)

蛋白質(zhì)帶的電荷多少不同，受電場(chǎng)的作用力不同，帶電荷多的分子受到的作用力大，移動(dòng)較快；反之較慢。溶液的PH與蛋白質(zhì)的PI相差越大，蛋白質(zhì)帶電荷越多。經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的電泳，性質(zhì)相同的蛋白質(zhì)就運(yùn)動(dòng)在一起，性質(zhì)不同的蛋白質(zhì)就得到了分離。三、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)的原理

不同分子大小和不同電荷蛋白質(zhì)混合溶液放在凝膠的頂部，貫穿凝膠這一個(gè)電場(chǎng)，蛋白質(zhì)就會(huì)因帶電荷而開(kāi)始移動(dòng)，在電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)作用下樣品提取液蛋白質(zhì)就被分離成一些不連續(xù)的譜帶。

經(jīng)過(guò)這樣的電泳分離后，蛋白質(zhì)譜帶就停留在凝膠板上，肉眼是看不見(jiàn)的，通過(guò)染色劑染色，可顯示出蛋白質(zhì)譜帶。不同品種電泳分離后所形成的譜帶也不同，與對(duì)照（標(biāo)準(zhǔn)）品種比較后可判斷出其他品種的種子數(shù)量，以達(dá)到鑒定品種純度的目的。三、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)的原理

蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，在不同pH條件下所帶電荷多少不同。對(duì)某一蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，總有一個(gè)pH，帶正電荷與負(fù)電荷多少一樣，這個(gè)pH叫等電點(diǎn)（pI）。當(dāng)pH＝pI（等電點(diǎn)）：電荷不移動(dòng)。pH＞pI：堿性條件下，蛋白質(zhì)將帶負(fù)電荷。pH＜pI：酸性條件下，蛋白質(zhì)將帶正電荷。

不同的蛋白質(zhì)由于氨基酸的組成不同，其等電點(diǎn)pI也不同。

蛋白質(zhì)在一定pH下，不同的蛋白質(zhì)所帶電荷不同。在電場(chǎng)中受到的作用力大小有差異。電泳使用儀器一、電泳儀電泳儀是控制電泳系統(tǒng)電流電壓的設(shè)備，使用電泳儀應(yīng)注意：1、電泳儀屬高壓輸出設(shè)備，通電后人體不要同時(shí)接觸兩端電極，以免觸電。2、電泳時(shí)并聯(lián)電泳槽的個(gè)數(shù)應(yīng)視儀器電流負(fù)荷而定，切勿過(guò)載而損壞儀器。3、電泳儀不要空載開(kāi)機(jī)，以免損壞儀器。4、不要在通電時(shí)接通或斷開(kāi)負(fù)載，以免產(chǎn)生火花，損傷接線(xiàn)柱或觸電。5、使用中發(fā)現(xiàn)異?，F(xiàn)象，應(yīng)立即切斷電源，進(jìn)行檢修。

二、電泳槽電泳槽是裝配電泳支持物，放置電極緩沖液和控制電泳溫度的裝置。

種子鑒定使用較多的是夾芯式垂直板電泳槽，它具有凝膠用量少、靈敏度高、便于比較等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于品種的電泳鑒定。三、離心機(jī)離心機(jī)是用于電泳樣品提取液離心澄清的儀器。

一般農(nóng)作物品種電泳鑒定要求轉(zhuǎn)速為每分鐘1~16000轉(zhuǎn)的離心機(jī)。

核酸電泳則要求冷凍高速離心機(jī)。四、電子天平在配制電泳試劑時(shí)，必須稱(chēng)量準(zhǔn)確。一般應(yīng)配備精確度萬(wàn)分之一的電子天平。五、磁力攪拌器在配制電泳試劑時(shí)，用于攪拌試劑。六、微量進(jìn)樣器在電泳加樣時(shí)，需用微量進(jìn)樣器。七、觀片燈用于鑒定譜帶八、其他儀器冰箱玻璃板架玻璃板八、其他儀器離心管架和離心管樣品梳單粒種子粉碎器電泳圖譜的分類(lèi)和鑒別一、電泳譜帶的分類(lèi)1、根據(jù)譜帶特征、血緣關(guān)系將電泳譜帶分為兩類(lèi)（1）公共帶指同種同屬的不同品種，由于其起源進(jìn)化的歷史和生態(tài)條件相同，具有數(shù)目不等的相同的譜帶。（2）特征譜帶指不同品種之間所存在的穩(wěn)定的可明確鑒別，可靠區(qū)分的遺傳的譜帶。一、電泳譜帶的分類(lèi)2、按雜交種的譜帶的特征將電泳譜帶分為四類(lèi)（1）互補(bǔ)型譜帶指雜交種具有來(lái)自母本譜帶和父本譜帶的一種譜帶類(lèi)型。（2）雜種型譜帶指雜交種具有母本和父本所沒(méi)有的，只有雜種才能具有的新產(chǎn)生的譜帶。（3）偏母型譜帶

指雜交種具有與母本基本相同的譜帶。（4）偏父型譜帶指雜交種具有與父本基本相同的譜帶。

一、電泳譜帶的分類(lèi)鑒定不同雜交種的蛋白質(zhì)電泳圖譜一、電泳譜帶的分類(lèi)3、按電泳遷移的快慢將電泳譜帶分為三類(lèi)（1）快帶指分子較小、形態(tài)光滑、帶電荷較多、在電場(chǎng)中泳動(dòng)最快、跑在前面的譜帶。（2）慢帶指分子較大、形狀不規(guī)則、帶電荷較少、在電場(chǎng)中泳動(dòng)最慢、留在前面的譜帶。

（3）中帶指在電泳電場(chǎng)中泳動(dòng)時(shí)，介于快帶與慢帶中間，泳動(dòng)速度中等的譜帶。

二、電泳圖譜的分區(qū)

為了電泳圖譜觀察鑒定的方便，國(guó)內(nèi)外通常將電泳圖譜進(jìn)行分區(qū)。

在分區(qū)時(shí)，可根據(jù)圖譜中譜帶分布和變化差異以及分界情況，進(jìn)行區(qū)分。

區(qū)號(hào)通常可用希臘文字母或數(shù)字表示。電泳圖譜的分區(qū)三、電泳圖譜的鑒定1、譜帶數(shù)目

不同品種的譜帶數(shù)目可能不同。電泳圖譜的分區(qū)三、電泳圖譜的鑒定2、