凍干顯微鏡研究進(jìn)展

摘

要：凍干過程的高真空度、超低溫條件使得凍干生產(chǎn)投資大、能耗高、凍干周期長(zhǎng)，這些問題有待進(jìn)一步的研究和解決。凍干顯微鏡作為一種實(shí)驗(yàn)室工具，可在微觀層面觀察研究?jī)龈僧a(chǎn)品在凍干過程中的結(jié)構(gòu)變化，并測(cè)定玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg′）、塌陷溫度（Tc）等關(guān)鍵參數(shù)，為凍干工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持，指導(dǎo)生產(chǎn)，并有效縮短摸索凍干曲線的周期，提高企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。近年來，科研工作者不斷對(duì)凍干顯微鏡的結(jié)構(gòu)和技術(shù)參數(shù)進(jìn)行改進(jìn)，使觀測(cè)到的凍干結(jié)構(gòu)和測(cè)定的塌陷溫度（Tc）更加接近凍干機(jī)實(shí)際生產(chǎn)過程，并取得了許多顯著成果?，F(xiàn)在闡述凍干技術(shù)基本概念和近幾年冷凍干燥技術(shù)研究新進(jìn)展的基礎(chǔ)上，介紹了凍干顯微鏡的基本原理和國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，并分析了凍干顯微鏡未來的研究方向，以期為縮短藥物和食品的凍干周期提供參考。關(guān)鍵詞：凍干技術(shù)；凍干顯微鏡；凍干曲線；塌陷溫度；光學(xué)相干斷層掃描

0

引言在20世紀(jì)后半葉，凍干技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)展成為一種能在低溫過程中保存生物藥品藥效的確切方法，并建立了與處方研發(fā)、工藝設(shè)計(jì)相關(guān)的基本概念。進(jìn)入21世紀(jì)，凍干技術(shù)仍在持續(xù)發(fā)展，應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。凍干技術(shù)，即先將產(chǎn)品凍結(jié)到預(yù)定溫度使所含水分變成固態(tài)的冰，然后在適當(dāng)?shù)臏囟群驼婵斩认?，使其升華為水蒸氣，再用有真空系統(tǒng)的冷凝器捕集水蒸氣，從而獲得干燥產(chǎn)品。在升華干燥過程中，當(dāng)溫度升高到某一數(shù)值時(shí)產(chǎn)品會(huì)失去剛性，從而變得有黏性，發(fā)生類似塌方的現(xiàn)象，使干燥產(chǎn)品失去疏松多孔的結(jié)構(gòu)，封閉了下層凍結(jié)產(chǎn)品中水蒸氣的逸出通路，阻礙了升華的繼續(xù)進(jìn)行。于是，升華速率變慢，從凍結(jié)產(chǎn)品中吸收升華的熱量也隨之減少，由擱板層供給的熱量將有多余，這樣便引起凍結(jié)產(chǎn)品的溫度上升，當(dāng)溫度升高到共熔點(diǎn)以上時(shí)，產(chǎn)品就會(huì)發(fā)生熔化或發(fā)泡現(xiàn)象，致使凍干失敗。發(fā)生塌陷時(shí)的溫度叫做該產(chǎn)品的塌陷溫度（CollapseTemperature，Tc）。Tc是凍干周期中一個(gè)關(guān)鍵的參數(shù)，在Tc以下進(jìn)行凍干對(duì)保證產(chǎn)品優(yōu)良的外形、低殘留水含量、長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性和復(fù)水性至關(guān)重要。以往常使用差示掃描量熱法（DSC）來測(cè)量最大冷凍濃縮溶液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg′）并以此評(píng)估Tc。而Tg′通常比Tc低1～3℃，也有報(bào)道低5～10℃的情況，尤其是當(dāng)產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量較高時(shí)。采用Tg′來評(píng)估Tc將導(dǎo)致升華階段的溫度低于實(shí)際要求的溫度，導(dǎo)致凍干時(shí)間延長(zhǎng)。凍干顯微鏡（Freeze-DryingMicroscopy，F(xiàn)DM）作為一種新設(shè)備用來監(jiān)測(cè)凍干過程中產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)變化，同時(shí)測(cè)定產(chǎn)品Tc和生產(chǎn)凍干曲線。首臺(tái)凍干顯微鏡研發(fā)于20世紀(jì)60年代中期，用電子顯微鏡在低溫真空下觀察軟乳劑凍干過程的結(jié)構(gòu)變化。隨著凍干技術(shù)和顯微鏡研究的不斷深入，凍干顯微鏡的設(shè)計(jì)亦日益完善。由傳統(tǒng)的光透射型顯微鏡（LF-FDM）的2D成像發(fā)展到單瓶?jī)龈蓹C(jī)-光學(xué)相干斷層掃描凍干顯微鏡（SVFD-OCT-FDM）的3D成像，后者更加符合實(shí)際凍干生產(chǎn)工藝。同時(shí)，對(duì)凍干臺(tái)不斷加以改進(jìn)，使顯微鏡溫度和真空度控制更加精確。凍干顯微鏡與現(xiàn)代計(jì)算機(jī)技術(shù)相結(jié)合，通過專門的軟件使得凍干顯微鏡實(shí)現(xiàn)了全鼠標(biāo)操作和遠(yuǎn)程控制。本文在闡述凍干技術(shù)一些基本概念和近幾年冷凍干燥技術(shù)研究新進(jìn)展的基礎(chǔ)上，介紹凍干顯微鏡的基本原理和國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，并分析凍干顯微鏡未來的研究方向，以期為縮短藥物和食品的凍干周期提供參考。

1

凍干技術(shù)1.1

凍干技術(shù)基本原理和特點(diǎn)凍干技術(shù)，是指將產(chǎn)品的水溶液或懸浮液在低溫下凍結(jié)成冰，然后在真空狀態(tài)下將其中的冰不經(jīng)過液體狀態(tài)而直接升華成氣態(tài)。該過程主要可分為：制品準(zhǔn)備、預(yù)凍、一次干燥（升華干燥）、二次干燥（解吸干燥）和密封保存五個(gè)步驟。凍干產(chǎn)品的體積幾乎不變，維持原來的結(jié)構(gòu)，不會(huì)發(fā)生濃縮現(xiàn)象，疏松多孔，呈海綿狀，加水后溶解迅速而完全，幾乎立即恢復(fù)原來的性狀。特別適用于熱敏性物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、微生物之類），使其不會(huì)發(fā)生變性或失去生物活力。因此，凍干技術(shù)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品行業(yè)。1.2

凍干技術(shù)在藥學(xué)中的新應(yīng)用過去凍干技術(shù)主要應(yīng)用于一些不穩(wěn)定的藥物，如抗生素和蛋白質(zhì)，如今凍干技術(shù)已應(yīng)用于生物標(biāo)準(zhǔn)品、難溶的新化合物實(shí)體（NCEs）、納米粒、疫苗和基因傳遞系統(tǒng)。近年來，將大量生物材料的生物標(biāo)準(zhǔn)品引入生物藥物領(lǐng)域，在小瓶中對(duì)它們進(jìn)行凍干，可保證其長(zhǎng)期穩(wěn)定性和可流通性。另外，由于NCEs具有難溶和生物利用度低等特點(diǎn)，通過將其凍干制備成非晶形固態(tài)分散體即可克服這些缺點(diǎn)。凍干技術(shù)最常見的應(yīng)用是用于生產(chǎn)只需經(jīng)過簡(jiǎn)單復(fù)水便可使用的凍干粉針劑。而利用固態(tài)時(shí)凍干產(chǎn)物的獨(dú)特性質(zhì)，還可將凍干技術(shù)應(yīng)用于其他方面。例如，凍干制備的速溶片有獨(dú)特的多孔性，確保在丹參中無需水即可快速溶解。另有報(bào)道，凍干片可作為潛在的經(jīng)頰黏膜藥物的傳遞系統(tǒng)。1.3

玻璃化轉(zhuǎn)變溫度之上的凍干為了研究最優(yōu)處方和凍干工藝，需要徹底理解凍干工藝各階段和固態(tài)的穩(wěn)定機(jī)制。根據(jù)普遍觀點(diǎn)，塌陷定義為在干燥過程中因冷凍濃縮的黏性流導(dǎo)致蛋糕結(jié)構(gòu)的喪失。塌陷將導(dǎo)致產(chǎn)品優(yōu)良結(jié)構(gòu)喪失，殘留水含量過高，復(fù)水時(shí)間延長(zhǎng)，并對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性產(chǎn)生消極影響。因此，理想的藥物凍干操作需要在升華干燥階段保持產(chǎn)品溫度低于玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg′或稍微低于塌陷溫度Tc，雖然在較高溫度下進(jìn)行干燥會(huì)增加干燥工藝成本，但是會(huì)使整個(gè)凍干工藝周期和能量消耗降低，而且塌陷未必會(huì)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生消極影響。例如，在高于Tg′下進(jìn)行升華干燥，對(duì)重組因子VIII和α-淀粉酶無不良影響。此外，對(duì)于一些蛋白質(zhì)發(fā)生塌陷，不但沒有不良影響，反且能增加其儲(chǔ)存穩(wěn)定性。盡管塌陷一般不會(huì)降低蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，但是為確保凍干藥品具有優(yōu)良的蛋糕結(jié)構(gòu)，則需要防止宏觀塌陷。可通過在處方中加入晶形膨脹劑，為塌陷的非晶相提供宏觀支撐，僅導(dǎo)致肉眼不可見的微塌。關(guān)于這點(diǎn)，非晶形組分與晶形膨脹劑的重量比就非常關(guān)鍵，因?yàn)楦吆康姆蔷谓M分可抑制膨脹劑結(jié)晶化，降低Tg′。高濃度蛋白處方由于其高度黏性的冷凍濃縮相導(dǎo)致Tg′與Tc相差明顯，可以在Tg′以上進(jìn)行凍干。一些產(chǎn)品隨著蛋白質(zhì)濃度的增加，塌陷溫度（Toc）與完全塌陷溫度（Tfc）的差異就越大，并可在一定溫度T（Tg′＜T＜Tc）下進(jìn)行凍干，其穩(wěn)定性或蛋糕結(jié)構(gòu)不受影響。由此可知，準(zhǔn)確測(cè)定Tc對(duì)凍干產(chǎn)品至關(guān)重要。1.4

凍干工藝的提高以往凍干工藝的優(yōu)化主要集中在升華和解析兩個(gè)干燥階段。然而，隨著對(duì)工藝?yán)斫獾纳钊耄芯空唛_始強(qiáng)調(diào)冷凍步驟的重要性。另外，為進(jìn)一步提高對(duì)凍干工藝的理解和控制，引入質(zhì)量源于設(shè)計(jì)理念（QbD）和過程分析技術(shù)（PAT），并研發(fā)了幾種過程監(jiān)控技術(shù)。1.4.1

冷凍步驟的重要性預(yù)凍會(huì)影響小瓶?jī)?nèi)與小瓶間的熱量均勻性、兩次干燥效果、產(chǎn)品的物理狀態(tài)、殘余水分以及復(fù)水時(shí)間。此外，有研究證明，冷凍過程會(huì)影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。然而，有一些研究結(jié)果卻與此是矛盾的，需要進(jìn)一步探討分析。有研究表明，冷凍過程的冰核作用的溫度與蛋白質(zhì)活性恢復(fù)呈反相關(guān)。所以，冷凍過程對(duì)冰核作用進(jìn)行直接控制就顯得非常重要。最近出現(xiàn)了幾種新的控制方法，包括電子冷凍、超聲控制冰核作用、冰霧技術(shù)以及降壓技術(shù)。其中，冰霧技術(shù)和降壓技術(shù)是最有希望用來進(jìn)行批量?jī)龈煽刂频?。另有研究發(fā)現(xiàn)，冷凍過程會(huì)對(duì)納米粒結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。目前，仍然缺乏對(duì)冷凍過程的全面研究。1.4.2

凍干工藝中的QbD和PAT進(jìn)入21世紀(jì)，F(xiàn)DA開始從質(zhì)量源于檢驗(yàn)（QbT）向質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）的理念轉(zhuǎn)變。FDA認(rèn)為，QbD是cGMP的基本組成部分，是科學(xué)的基于風(fēng)險(xiǎn)的全面主動(dòng)的藥物開發(fā)方法，從產(chǎn)品概念到工業(yè)化生產(chǎn)均需精心設(shè)計(jì)，是對(duì)產(chǎn)品屬性、生產(chǎn)工藝與產(chǎn)品性能之間關(guān)系的透徹理解。而對(duì)關(guān)鍵工序參數(shù)的測(cè)量和控制需要使用工藝分析技術(shù)（PAT）。隨著制藥監(jiān)管變化日益頻繁，QbD和PAT已成為凍干開發(fā)的關(guān)注重點(diǎn)。這就要求開發(fā)各種單瓶或批量冷凍技術(shù)，以監(jiān)測(cè)產(chǎn)品和工藝關(guān)鍵參數(shù)。傳統(tǒng)上使用熱電偶或熱電阻來測(cè)量小瓶?jī)?nèi)產(chǎn)物溫度，如今已研發(fā)出一種無線溫度傳感器，可在批量?jī)龈缮a(chǎn)中自動(dòng)加載。另外，還開發(fā)出光纖系統(tǒng)用于凍干工藝中的溫度監(jiān)測(cè)，通過將光纖整合到擱板表面，可進(jìn)行非侵入的自動(dòng)加載和監(jiān)測(cè)冷凍干燥過程。目前，判斷初始干燥終點(diǎn)比較理想的方法是壓力溫度測(cè)定（MTM），即使用電容壓力計(jì)和Pirani真空管測(cè)量相對(duì)壓力，Pirani真空管于1992年被首次報(bào)道。MTM的依據(jù)是電容壓力計(jì)測(cè)量的壓力增加值，作為一種非侵入的批處理法來預(yù)測(cè)產(chǎn)品升華界面的平均溫度。該方法也被用來測(cè)定傳熱和傳質(zhì)參數(shù)以及干燥層電阻。近期可調(diào)諧二極管激光吸收光譜（TDLAS）作為凍干中的PAT工具，可用于測(cè)定進(jìn)程內(nèi)的水蒸氣流量、初始干燥終點(diǎn)、非侵入的產(chǎn)品溫度、小瓶傳熱參數(shù)、工藝優(yōu)化、產(chǎn)品傳質(zhì)阻力以及二次干燥殘留水分?？傊?，隨著凍干工藝研究和規(guī)模的擴(kuò)大，TDLAS表現(xiàn)為一種有前途的在線監(jiān)測(cè)工具。另外，光譜學(xué)工具，例如近紅外光譜儀或拉曼光譜儀，也已開始用作凍干過程中的PAT工具，可監(jiān)測(cè)整個(gè)凍干過程中甘露醇的固體狀態(tài)、冰核作用的發(fā)生、冰升華的發(fā)生和結(jié)束。1.4.3

擴(kuò)大凍干規(guī)模擴(kuò)大凍干規(guī)模的一個(gè)主要原因是實(shí)驗(yàn)室規(guī)模與生產(chǎn)規(guī)模之間的冰核作用不同，還有擱板表面不均、凍干機(jī)負(fù)載差異、傳熱和傳質(zhì)性能以及凍干室壓力的差異等原因。將一些程序與實(shí)驗(yàn)測(cè)試、數(shù)值模擬相結(jié)合來描述凍干規(guī)模擴(kuò)大過程。利用流體動(dòng)力學(xué)建模來模擬多變的擱板分隔距離上的壓力、壓力梯度或流動(dòng)速度，說明滅菌管或連接管道內(nèi)的隔離閥對(duì)流速的影響，以確定不同傳熱元件在變壓時(shí)與瓶分離的作用，或預(yù)測(cè)冷凝器上3D不穩(wěn)定的冰聚集。而這些參數(shù)對(duì)于重新考慮凍干機(jī)硬件的設(shè)計(jì)具有重要價(jià)值。解決批處理不均勻性問題，可采用連續(xù)凍干工藝，因?yàn)樗呀?jīng)應(yīng)用在食品工業(yè)中，證明能有效提高工藝效率和產(chǎn)品質(zhì)量。但是，要想從傳統(tǒng)的批處理向連續(xù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)變，還要求進(jìn)一步轉(zhuǎn)變觀念。

2

國(guó)內(nèi)外對(duì)凍干顯微鏡的研究2.1

凍干顯微鏡基本原理凍干顯微鏡（FDM）的總體結(jié)構(gòu)由光學(xué)成像系統(tǒng)、凍干臺(tái)、加熱系統(tǒng)、制冷系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、控制系統(tǒng)組成。凍干顯微鏡的基本原理：首先對(duì)被觀察樣品進(jìn)行制樣，然后放置于凍干臺(tái)上，經(jīng)低溫冷凍后，再進(jìn)行升溫干燥，升華時(shí)的水蒸氣由真空泵抽入冷凝器中除去，由顯微鏡中的攝像機(jī)將觀測(cè)到的凍干圖像經(jīng)圖像傳感器傳輸給計(jì)算機(jī)，并在計(jì)算機(jī)上顯示和儲(chǔ)存，控制系統(tǒng)可根據(jù)物料的實(shí)時(shí)凍干曲線進(jìn)行溫度和壓力調(diào)整控制，從而生成凍干曲線?，F(xiàn)代FDM可直觀指示Tc，測(cè)定共晶溫度（Teu）、樣品表面形成潛能、退火對(duì)冰晶結(jié)構(gòu)與溶液結(jié)晶的影響、不同處方的相對(duì)干燥速度以及相同處方在不同溫度下的相對(duì)干燥速度。凍干顯微鏡優(yōu)點(diǎn)：（1）可精確控制冷凍、加熱過程中的溫度變化；（2）能夠用顯微鏡跟蹤升華界面，進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間觀察；（3）清晰觀察凍干過程中產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的變化，并確定Tc；（4）采集數(shù)據(jù)和圖像用于指導(dǎo)工業(yè)化凍干生產(chǎn)；（5）幫助改進(jìn)舊的處方，開發(fā)新的處方；（6）樣品所需量少。2.2

國(guó)外凍干顯微鏡的研究2.2.1

光透射型凍干顯微鏡首臺(tái)實(shí)驗(yàn)室凍干顯微鏡設(shè)計(jì)于20世紀(jì)60年代中期。1964年，AlanMacKenzie研發(fā)了一臺(tái)凍干顯微鏡，凍干室置于低溫容器內(nèi)并直接接觸，利用一臺(tái)水平放置的顯微鏡通過凍干室內(nèi)的觀察窗（厚1.5mm）來觀察冷凍和凍干過程。將樣品直接放置在凍干室的觀察窗上，維持樣品的溫度接近于容器的溫度，然后通過容器溫度估算樣品溫度。該方法的明顯缺點(diǎn)就是沒有直接測(cè)定樣品的溫度，估算值與實(shí)際樣品溫度相差較大。2.2.1.1

光透射型凍干顯微鏡的發(fā)展于1965年設(shè)計(jì)了可在真空蒸發(fā)器內(nèi)使用的熱電凍干單元（圖1），可避免使用液氮制冷劑帶來的操作不便。該單元僅由熱沉和熱電元件交替組合而成，可達(dá)到-60℃低溫。換熱器由銅塊（76cm×38cm×18.5cm）組成，水用作冷熱轉(zhuǎn)換介質(zhì)；水進(jìn)入擴(kuò)散泵冷卻系統(tǒng)，然后通過兩個(gè)管道流入底部板；CP-2-31-10組件焊接至該凍干臺(tái)的上面；中間熱沉焊接在兩個(gè)CP-2-31-10組件的頂部；一熱電偶安裝在凍干臺(tái)上面，監(jiān)測(cè)溫度。操作方法：樣品降溫至-60℃，然后升溫至低于冰點(diǎn)溫度，在冰完全升華后，再將溫度降至-60℃，以防止因遮蔽或包衣傳熱導(dǎo)致樣品變形。當(dāng)樣品溫度達(dá)到室溫后，恢復(fù)至大氣壓，然后直接轉(zhuǎn)移樣品，放置于電子顯微鏡下進(jìn)行觀察。由于該凍干臺(tái)只是將樣品在凍干前后放在電子顯微鏡下進(jìn)行觀察，因此并不能實(shí)時(shí)顯示凍干過程樣品結(jié)構(gòu)的變化。1972年，設(shè)計(jì)了一凍干臺(tái)（圖2），并與顯微鏡結(jié)合觀察凍干過程。與傳統(tǒng)的凍干臺(tái)相比，其明顯優(yōu)點(diǎn)就是徑向溫度梯度垂直于觀察者，這可使觀察到的冷凍前線從觀察區(qū)域四周開始并沿徑向方向向噴砂載玻片中心移動(dòng)。使用噴砂載玻片是因?yàn)槿芤涸谄渖厦嫒菀卒佌归_并形成厚度均勻的透明薄膜。在樣品上面不使用蓋玻片，使用銅板作為冷卻媒介，將噴砂載玻片放置于銅板的凹處，處于制冷板的上面；制冷板的一端通入冷卻劑（如干冰-丙酮或液氮）；加熱線圈系在制冷板上來調(diào)節(jié)溫度；制冷板在真空室的上面，制冷板中的孔作為連接真空室與樣品表面的端口；使用樹脂玻璃板來密封制冷板頂部和真空室底部，同時(shí)可使光線穿透樣品和噴砂載玻片。為防止觀察窗表面發(fā)生冷凝，干燥的氮?dú)鈴膬龈膳_(tái)上面緩慢流過；在噴砂載玻片預(yù)定的位置放置一微觀熱電偶監(jiān)測(cè)樣品溫度；橡膠密封墊密封樹脂玻璃與制冷板之間的熱電偶。由于該凍干臺(tái)存在溫度梯度，所以熱電偶測(cè)得的是其所在區(qū)域的平均溫度。該凍干臺(tái)包含變溫、變壓、調(diào)節(jié)冷凍速度所需的所有元件。通過顯微鏡可視化地觀察樣品實(shí)際凍干過程，采用真實(shí)的延時(shí)攝影技術(shù)記錄在偏振片上。通過該凍干臺(tái)還可研究?jī)龈蛇^程中的3D傳熱過程。但是，該方法的明顯缺點(diǎn)就是溫度梯度的存在使測(cè)定的樣品溫度不確定。

1983年使用類似的方法構(gòu)建了一個(gè)凍干臺(tái)，不同之處在于液氮流經(jīng)鋁模塊的內(nèi)管道，樣品就放在鋁模塊的上面，通過手工調(diào)節(jié)液氮流速來控制溫度。1973年設(shè)計(jì)了一個(gè)凍干臺(tái)。在該設(shè)計(jì)中，凍干臺(tái)采用具有內(nèi)部管道的鋁模塊來進(jìn)行熱轉(zhuǎn)換流體的循環(huán)。甲醇用作熱轉(zhuǎn)換流體，利用離心泵通過一根浸在干冰/丙酮中的銅盤管進(jìn)行循環(huán)，通過開/關(guān)泵或調(diào)節(jié)泵的轉(zhuǎn)速來控制溫度。還設(shè)計(jì)了另一代凍干臺(tái)，液氮作為熱轉(zhuǎn)換流體，使預(yù)凍極限溫度更低，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。液氮流經(jīng)顯微鏡載玻片下方，并通過調(diào)節(jié)液氮的流速來控制溫度。1989年設(shè)計(jì)了一個(gè)溫度梯度凍干臺(tái)，銅模塊鉆孔用于氮?dú)庋h(huán)以提供熱沉來冷凍樣品。在銅塊上用環(huán)氧樹脂粘合含有電阻加熱器的一個(gè)特殊的線路板，通過安裝在其表面的熱電偶形成一個(gè)控制溫度的熱沉。含有薄而透明的金包衣載玻片放置在線路板的表面，此金包衣作為補(bǔ)償性的加熱器。樣品放在載玻片上，并伸出至溫度控制表面的邊緣使透射光通過。1993年研發(fā)了一個(gè)顯微鏡凍干臺(tái)，其系統(tǒng)組成如圖3所示。熱電（Peltier）加熱器在高溫側(cè)將循環(huán)流體用作熱沉，可獲得-47℃的低溫。該系統(tǒng)主要的優(yōu)點(diǎn)是凍干臺(tái)溫度是閉環(huán)控制的，在溫度設(shè)定點(diǎn)可快速做出反應(yīng)，通過使用帶字符發(fā)生器的圖像記錄系統(tǒng)提高記錄實(shí)驗(yàn)的能力，并可顯示樣品的密度和溫度。該凍干臺(tái)是目前廣泛使用的FDCS凍干臺(tái)的雛形。該凍干室是圓柱形的，采用通過鎳電鍍拋光的固體黃銅加工而成。凍干室底部橫向鉆有4個(gè)孔，用于冷卻水循環(huán)，并作為熱電冷卻器高溫側(cè)的熱沉。凍干室割去1/16"用于安裝O形真空密封件，在凍干室壁上的一個(gè)孔安裝壓合接頭，用于連接真空泵。通過安裝在兩個(gè)凍干臺(tái)里的鉍/碲化物型熱電模塊來冷卻樣品。第一個(gè)凍干臺(tái)是由4個(gè)1"正方形模塊組成一個(gè)正方形，由亮鎳電鍍銅片構(gòu)成中間金屬板，并安裝在這些模塊的頂部，該中間金屬板作為安裝在其頂部?jī)蓚€(gè)額外模塊的一個(gè)熱沉。在該兩個(gè)額外模塊電鍍上0.030"厚鎳，銅板安裝在其頂部。該銅板支撐樣品，同時(shí)作為樣品的熱沉。在中間和頂部板鉆有直徑為1/4"的孔，而這些板與外殼底部都有一同心孔使透射光穿過樣品。凍干臺(tái)蓋板中心也鉆有1/4"的孔，并蓋住凍干室以提供真空密封。蓋板和凍干室底部的孔是用玻璃蓋玻片和環(huán)氧樹脂膠密封。一個(gè)T型熱電偶安裝在閉環(huán)溫度控制板下面。溫度控制器采用時(shí)間比例技術(shù)，為熱電偶提供一個(gè)有變化的寬度脈沖電流，溫度控制精度為±0.1℃。另一個(gè)熱電偶用來監(jiān)測(cè)頂部板上的表面溫度，并盡可能接近樣品。數(shù)字溫度計(jì)顯示溫度，并傳送到字符發(fā)生器用于視頻顯示。頂部板獲得的最低表面溫度為-47℃，這就要求容器維持在0.5℃左右，冷卻水在凍干臺(tái)底部循環(huán)。干冰捕水器位于真空泵（單臺(tái)旋轉(zhuǎn)）與凍干臺(tái)之間，防止真空泵的油蒸汽擴(kuò)散至凍干臺(tái)中，并捕集從樣品中升華出來的一部分水蒸氣。用McLeod計(jì)來監(jiān)測(cè)凍干室內(nèi)的壓力，獲得的最低真空度為3.33Pa左右。凍干臺(tái)放置在偏振光顯微鏡（OlymusBH-2）的載物臺(tái)上。凍干臺(tái)要求物鏡的最小工作距離大約為5mm，可以使用4×或10×的物鏡，用35mm照相機(jī)或攝像機(jī)（JavelinChromachipⅡ-RGB）觀察。溫度監(jiān)測(cè)的熱電偶與數(shù)字溫度計(jì)（Model2190A）連接，數(shù)字溫度計(jì)與字符產(chǎn)生器（Model5000）連接，使樣品溫度顯示在視頻監(jiān)測(cè)器（ModelCUM-13）上。視頻盒式記錄器通過與系統(tǒng)相連來存檔視頻顯微數(shù)據(jù)。操作方法：取10μL溶液（10%W/V）滴至一石英蓋玻片上（McCroneAcceoriesandComponent），將蓋玻片放至載物臺(tái)頂部表面的透光孔上；再將另一蓋玻片放至樣品上面，該蓋玻片不是用作顯微鏡蓋玻片，而是用來維持樣品結(jié)構(gòu)，使凍干臺(tái)表面與樣品之間的垂直溫度梯度最小化（使用石英蓋玻片而不使用玻璃是因?yàn)槭⒕哂懈玫臒醾鲗?dǎo)性）；熱電偶固定在頂部板表面，盡可能接近樣品；在大約3min內(nèi)，樣品從室溫降至-45℃，然后加熱至低于化合物共晶點(diǎn)約5℃；隨后以大約1℃/min的速度加熱樣品，通過手動(dòng)逐步調(diào)節(jié)溫度設(shè)定點(diǎn)直到出現(xiàn)共晶融化。通常需要連續(xù)通入一股氮?dú)獯┻^凍干臺(tái)的頂部觀察窗以防止發(fā)生冷凝現(xiàn)象。數(shù)據(jù)記錄在視頻磁盤里，可用于隨后的分析。設(shè)計(jì)的凍干機(jī)的最大缺點(diǎn)是極限低溫為-50℃，對(duì)于一些共晶點(diǎn)更低的樣品就不適用了。為達(dá)到更低的冷凍溫度，則需要一種低溫流體在凍干臺(tái)內(nèi)循環(huán)，控制器也需要重新設(shè)計(jì)。2008年設(shè)計(jì)了一臺(tái)低溫凍干顯微鏡，由德國(guó)卡爾蔡司公司生產(chǎn)的配有λ盤的A1顯微鏡、頻譜分析儀、英國(guó)公司生產(chǎn)的帶有液氮冷卻系統(tǒng)和可編程生物溫度控制器的FDCS196凍干臺(tái)組成。采用分辨率為1.3M的數(shù)字?jǐn)z像系統(tǒng)每隔1s采集一次圖像，并用LinkSys32軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算分析。在開始實(shí)驗(yàn)之前，將溫度傳感器（精確度：0.1K）放置在銀冷卻媒介的模塊下面，使用KCl、NaCl和MgCl2三種物質(zhì)的共晶熔化溫度來進(jìn)行校準(zhǔn)。操作方法：（1）打開凍干臺(tái)蓋和側(cè)門；（2）取2μL樣品溶液滴在玻璃載玻片（直徑20mm）上，然后將其放置在銀模塊上；（3）取5μL硅樹脂涂在銀模塊與載玻片之間，以提高熱接觸性；（4）將另一蓋玻片（直徑10mm）放置在樣品液滴的上面，中間放置一定制的中間隔離件，以維持樣品層厚度恒定；（5）打開計(jì)算機(jī)、顯微鏡光源、液氮泵，在5℃達(dá)到平衡相后維持1min，然后以10℃/min降低至-40℃冷凍階段，在此溫度維持10min，以確保樣品達(dá)到熱力學(xué)平衡；（6）達(dá)到熱力學(xué)平衡后8min，對(duì)凍干臺(tái)進(jìn)行全力抽真空，除非樣品升華速度有文獻(xiàn)控制要求，用皮拉尼真空計(jì)控制整個(gè)凍干過程的真空度；（7）以1℃/min梯度進(jìn)行加熱，不至于發(fā)生塌陷。2.2.1.2

商業(yè)化生產(chǎn)凍干顯微鏡目前，世界上商業(yè)化生產(chǎn)凍干顯微鏡的公司主要有英國(guó)的BiopharmaTechnologyLtd.（BTL）和LinkamScientificInstrumentsLtd.。BTL生產(chǎn)的凍干顯微鏡有Lyostat2/3/4。Lyostat2凍干顯微鏡（圖4）主要由液氮罐、液氮泵、真空泵、凍干臺(tái)、溫度控制器、復(fù)合式顯微鏡、攝像機(jī)和個(gè)人電腦組成。操作方法：（1）制樣：卸下凍干臺(tái)，打開蓋子和側(cè)門，取2μL樣品溶液滴在玻璃載玻片（直徑16mm）上，然后將其放置在銀冷卻媒介的模塊上，注意取一定量的硅樹脂涂在銀模塊與石英載玻片之間，以提高熱接觸性，將另一石英蓋玻片（直徑13mm）放置在樣品液滴的上面，中間放置一定制的中間金屬隔離件，以維持樣品層厚度恒定；（2）冷凍：打開計(jì)算機(jī)、顯微鏡光源、液氮泵，通入液氮使樣品溫度冷凍至設(shè)定溫度，根據(jù)處方需要進(jìn)行退火操作，當(dāng)觀察到完全凍結(jié)后，進(jìn)入干燥階段；（3）升華干燥：打開真空泵，抽真空，同時(shí)進(jìn)行升溫，顯微鏡中可觀察到升華界面（水線），通過觀察分析升華界面凍干結(jié)構(gòu)可測(cè)定Tc，并通過升溫、降溫循環(huán)進(jìn)一步確認(rèn)Tc，升華干燥結(jié)束后，進(jìn)入下一步干燥；（4）解析干燥：進(jìn)一步加熱升溫，直到整個(gè)干燥結(jié)束。Lypstat3凍干顯微鏡（圖5）系統(tǒng)特點(diǎn)：（1）光學(xué)系統(tǒng)：定制的顯微鏡，配置高性能數(shù)字火線攝像機(jī)，比標(biāo)準(zhǔn)復(fù)合式顯微鏡像素更高，物鏡和攝像機(jī)可傾斜，更方便取/裝樣；（2）凍干臺(tái)：溫度范圍為-196～+125℃，加熱/冷卻速度可達(dá)130℃/min，利用傳熱性更高的銀作為加熱/冷卻模塊；（3）溫度控制系統(tǒng)：通過調(diào)節(jié)加熱元件的熱量輸入量與銀模塊內(nèi)液氮量之間的平衡來控制樣品的溫度，通過Pt100電阻器（精確度：0.01℃）監(jiān)測(cè)樣品溫度，即使壓力降至0.1～0.03MPa也能控制精度達(dá)0.1℃；（4）可供選擇的電動(dòng)真空控制系統(tǒng)：軟件控制的電動(dòng)閥控制凍干臺(tái)壓力，可深入研究壓力對(duì)樣品塌陷的影響，壓力是隨溫度變化而非時(shí)間，數(shù)據(jù)可保存用于隨后的分析，室壓?jiǎn)挝挥蠺orr、mTorr、mbar和Pa；（5）控制系統(tǒng)：專用數(shù)字圖像采集軟件，可顯示實(shí)時(shí)溫度和壓力信息，可控制加熱速度，限制并維持在溫度曲線內(nèi)高達(dá)100個(gè)坡度，圖像采集與程序升溫?cái)?shù)據(jù)采集結(jié)合，用于近距離觀察。Lyostat4凍干顯微鏡（圖6）系統(tǒng)特點(diǎn)：（1）光學(xué)系統(tǒng)：使用帶一個(gè)高效、定制、使用壽命超過60000h電子組件的LED燈作為光源，可提供約10000h免維修照明，帶分析器的偏振光鏡頭，鏡頭比復(fù)合式顯微鏡更少，但是圖像卻更清晰，配有一臺(tái)高性能Qicam數(shù)字火線攝像機(jī)；（2）凍干臺(tái)：溫度范圍為-196～+350℃，使用高純度銀作為加熱/冷卻模塊；（3）溫度控制系統(tǒng)：使用雙級(jí)泵來加速冷卻，Pt100監(jiān)測(cè)和控制溫度；（4）可供選擇的電動(dòng)閥真空控制系統(tǒng)：配有OerlikonLeyboldD2.5E旋片式真空泵，抽速為3.2m2/h，PfeifferPirani真空計(jì)監(jiān)測(cè)凍干室壓力，范圍為大氣壓到0.01Pa，在凍干室一端口處直接測(cè)量室內(nèi)的真空度，極限真空為0.1Pa，可深入研究壓力對(duì)樣品塌陷的影響，壓力是隨溫度變化而非時(shí)間，并且可保存用于隨后的分析，室壓?jiǎn)挝挥蠺orr、mTorr、mbar和Pa；（5）控制系統(tǒng)：通過RS232串行連接PC對(duì)程序升溫器進(jìn)行全面控制，在線生成保存凍干曲線，并可以表格形式導(dǎo)出，21CFR11兼容軟件可做備用。LinkamScientificInstrumentsLtd.主要設(shè)計(jì)和生成低溫臺(tái)、電子產(chǎn)品與相應(yīng)軟件，它們可以與顯微鏡、光譜分析儀、衍射儀結(jié)合起來用于分析和表征樣品。FDCS196凍干顯微鏡主要由FDCS196凍干臺(tái)（圖7）、T95系統(tǒng)控制器、光學(xué)顯微鏡、攝像機(jī)、PC和Linksys32系統(tǒng)與圖像采集軟件等組成。各組件的特征：（1）該凍干臺(tái)溫度范圍為-196～+125℃，超低溫共晶體通過FDCS系統(tǒng)進(jìn)行研究，而非帕爾貼控制系統(tǒng)。采用Pirani真空計(jì)直接監(jiān)測(cè)凍干室壓力，并顯示室內(nèi)壓力是分布均勻的，使用XY控制器來跟蹤樣品中干燥界面的移動(dòng)。（2）T95系統(tǒng)控制器不僅能夠精確地控制溫度，還可以精確運(yùn)轉(zhuǎn)步進(jìn)電機(jī)，顯示來自高分辨率的力傳感器、濕度傳感器、壓力傳感器以及現(xiàn)場(chǎng)視頻的數(shù)據(jù)。通過Linksys32軟件或一個(gè)符合人機(jī)工程學(xué)的觸摸屏“LinkPad”來訪問該操作系統(tǒng)，用戶可快速獲取試驗(yàn)參數(shù)。對(duì)于溫度曲線的每個(gè)坡度都補(bǔ)充一些其他控制，包括真空度、拉伸速度和強(qiáng)度。通過兩條可編程漏極開路輸出控制外部設(shè)備，另一可編程輸出為該T95系統(tǒng)提供接受觸發(fā)信號(hào)的可能。在T95系統(tǒng)控制器范圍內(nèi)有3種模型：1）T95LinkPad：具有LCD觸摸屏數(shù)據(jù)輸入獨(dú)立控制器以及對(duì)Linksys32軟件進(jìn)行控制的RS232接口；2）T95LinkSys：PC界面控制器要求Linksys32軟件控制Linkam系統(tǒng)；3）PE95：一個(gè)獨(dú)立控制器，通過LCD觸摸屏數(shù)據(jù)輸入對(duì)帕爾貼效應(yīng)階段進(jìn)行控制。T95系統(tǒng)控制器特點(diǎn)：為RS232串行口添加USB，使其連通性更好；增加一個(gè)可選視頻文本覆蓋板，可將實(shí)時(shí)溫度控制數(shù)據(jù)放置在30幀/s的模擬視頻信號(hào)上，無需PC；采用Linksys32X-DVPC控制軟件保存所有數(shù)字圖像采集數(shù)據(jù)。（3）光學(xué)顯微鏡：轉(zhuǎn)換器和濾光片上沒有插槽，一個(gè)偏振器和分析器以及長(zhǎng)工作距離聚光器中的一個(gè)插槽用做相環(huán)。用100W鹵素?zé)襞萏峁┩干涔?，通過聚集在物鏡工作距離上的發(fā)光二極管頸部反射光。成像站可以將XY平臺(tái)放置在顯微鏡上，然后對(duì)溫度進(jìn)行隨意控制設(shè)置。（4）攝像機(jī)：采用PixelinkPLA662CMOS攝像機(jī)，能與Linksys32DV兼容，并直接安裝在物鏡上面，這樣就沒有光穿過二次透鏡和反射鏡。（5）Linksys32系統(tǒng)控制與圖像采集軟件：可顯示在線溫度、有效的曲線坡度信息，包括已安裝的不同傳感器的反饋。通過該軟件可全面控制加熱速度、時(shí)間控制和圖像采集，在溫度曲線范圍內(nèi)高達(dá)100個(gè)坡度。該軟件可識(shí)別出哪個(gè)凍干臺(tái)已經(jīng)連接上了，可自動(dòng)限制其溫度控制參數(shù)，并打開相關(guān)的操作窗，例如XY馬達(dá)控制和真空度控制。該軟件提供的是“主動(dòng)X”控制，它既可以作為溫度控制器單獨(dú)使用，也可以將它導(dǎo)入第三方軟件，例如虛擬儀器或者圖像分析包。該系統(tǒng)可通過Linksys32DV進(jìn)行升級(jí)，Linksys32DV可與大部分Q成像的數(shù)字?jǐn)z像機(jī)兼容。2.2.2

光學(xué)相干斷層掃描型凍干顯微鏡目前，通常使用透射光凍干顯微鏡（LF-FDM）和/或差示掃描量熱儀（DSC）來測(cè)定凍干產(chǎn)品的Tc。LF-FDM通過采用一個(gè)低溫、高真空度的凍干臺(tái)，在兩蓋玻片之間滴加少量溶液（1～2μL）進(jìn)行預(yù)凍，然后進(jìn)行抽真空，升高溫度，一般升溫速度為1℃/min，直至出現(xiàn)升華。隨著溫度的升高，黏性流引起凍干固體結(jié)構(gòu)變化，這有可能導(dǎo)致塌陷。一些研究證據(jù)表明，小瓶中產(chǎn)品的Tc與薄膜之間的Tc是有差別的，因?yàn)閮烧呔哂胁煌谋俗饔煤腿苜|(zhì)結(jié)晶化趨勢(shì)，而不同的冰核作用導(dǎo)致干燥層不同的電阻和干燥速度。另外，Tc是動(dòng)力學(xué)參數(shù)，它取決于產(chǎn)品的黏性流。所以，如果干燥發(fā)生在明顯黏性流之前，即使溫度高于最大冷凍濃縮溶液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg′），該蛋糕結(jié)構(gòu)也不會(huì)發(fā)生塌陷。LF-FDM的薄膜凍干過程不能代表這些動(dòng)力學(xué)過程，因?yàn)楸∧?nèi)的塌陷通常發(fā)生在一定溫度范圍內(nèi)，而小瓶?jī)?nèi)產(chǎn)品在該溫度范圍并沒有發(fā)生明顯塌陷。理論和實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，小瓶?jī)?nèi)的凍干與LF-FDM中2D樣品的凍干明顯不同，小瓶?jī)?nèi)樣品實(shí)際Tc可能比傳統(tǒng)LF-FDM測(cè)定的Tc要高。DSC主要用于測(cè)定最大冷凍濃縮溶液的Tg′，也可測(cè)定Tc。通常Tg′比Tc低1～3℃，然而也有低于5～10℃的報(bào)道，尤其是蛋白質(zhì)濃度高的處方。為更加準(zhǔn)確地測(cè)定西林瓶中凍干樣品的Tc，MirceaMujat等人于2011年將光學(xué)相干斷層掃描技術(shù)（OCT）運(yùn)用到凍干技術(shù)中，設(shè)計(jì)和制造了一臺(tái)光學(xué)相干斷層掃描凍干顯微鏡（OCT-FDM），同時(shí)設(shè)計(jì)和制造了單瓶?jī)龈蓹C(jī)（SVFD），并將兩者結(jié)合形成一臺(tái)單瓶?jī)龈蓹C(jī)-光學(xué)相干斷層掃描凍干顯微鏡（SVFD-OCT-FDM）。它可以觀察凍干過程中一個(gè)西林瓶?jī)?nèi)樣品結(jié)構(gòu)的變化，同時(shí)可準(zhǔn)確測(cè)定其Tc，克服LF-FDM和DSC不能測(cè)定西林瓶?jī)?nèi)樣品Tc的缺點(diǎn)。另外，光學(xué)相干斷層掃描3D成像能力和體積微米級(jí)分辨率不僅能顯著提升測(cè)定樣品Tc和結(jié)構(gòu)變化的能力，而且還可研究冰核作用和預(yù)凍階段。2.2.2.1

光學(xué)相干斷層掃描技術(shù)基本原理光學(xué)相干斷層掃描（OpticalCoherenceTomography，OCT）是一種能對(duì)生物組織淺表微結(jié)構(gòu)進(jìn)行斷層成像的新技術(shù)，具有實(shí)時(shí)、非侵入、無損傷等特點(diǎn)，于1991年首次演示。隨后，OCT逐漸應(yīng)用于生物醫(yī)藥和材料科學(xué)，改變了淺表上皮組織成像技術(shù)，一直是國(guó)際光學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。其基本原理：OCT系統(tǒng)的核心是邁克爾遜干涉儀，在此基礎(chǔ)添加相關(guān)增強(qiáng)效果器件。例如，可利用光纖作為傳輸介質(zhì)，用自聚焦透鏡代替普通光學(xué)透鏡成像等。低相干光源發(fā)出的光耦合進(jìn)入邁克爾遜干涉儀，通過一個(gè)光纖耦合器使光分別進(jìn)入干涉儀的兩個(gè)壁，光經(jīng)過一個(gè)共焦系統(tǒng)再經(jīng)散射介質(zhì)的背向散射后沿原路返回，在光纖耦合器與參考光壁返回來的參考光發(fā)生干涉。由于采用的是低相干光，相干長(zhǎng)度很短，所以只有從散射介質(zhì)中很薄一層中反射回來的光才會(huì)和參考光發(fā)生干涉。通過光電探測(cè)器探測(cè)干涉信號(hào)，經(jīng)過信號(hào)處理后進(jìn)入電腦分析得到生物組織內(nèi)部的像。光學(xué)相干斷層掃描使用的光源包括超輻射發(fā)光二極管與超短脈沖激光。根據(jù)光源性質(zhì)的不同，這種掃描方式甚至可以達(dá)到亞微米級(jí)的分辨率，這時(shí)需要光源的頻譜非常寬，波長(zhǎng)的變化范圍在100nm左右。目前，主要有兩種OCT，即時(shí)域OCT（TDOCT）和傅里葉域OCT（FDOCT）。在TDOCT中，單獨(dú)測(cè)定3D掃描內(nèi)每個(gè)像素，在3個(gè)笛卡爾方向上依次掃描獲取掃描量。在FDOCT中，沿軸向剖面的所有像素是通過傅里葉轉(zhuǎn)換分解的干擾信號(hào)同時(shí)測(cè)定的，用頻域OCT或掃頻源OCT來記錄這些分解的干擾信號(hào)。FDOCT是目前一種比較先進(jìn)的光學(xué)相干斷層掃描技術(shù)，這種掃描方式的信噪比（SNR）較高，獲得信號(hào)的速度也更快。但是，F(xiàn)DOCT有一定的應(yīng)用限制，在一些情況下只能使用TDOCT。由于FDOCT在橫向分辨率和深度敏感性方面有限，而這對(duì)凍干過程的監(jiān)測(cè)非常關(guān)鍵，MirceaMujat等人設(shè)計(jì)的OCT-FDM就選擇TDOCT。2.2.2.2

單瓶?jī)龈蓹C(jī)-光學(xué)相干斷層掃描凍干顯微鏡MirceaMujat等人于2011年設(shè)計(jì)和構(gòu)建了一臺(tái)單瓶?jī)龈蓹C(jī)-光學(xué)相干斷層掃描凍干顯微鏡（SVFD-OCT-FDM），如圖8所示，這是凍干顯微鏡革命性的變化。因?yàn)樗芯康膶?duì)象不再是放在玻璃或石英玻片之間進(jìn)行凍干觀察的溶液樣品，而是直接放在西林瓶或其他小藥瓶中的樣品，這樣就非常接近實(shí)際凍干生產(chǎn)過程，但與放大工業(yè)生產(chǎn)的傳熱、傳質(zhì)差異仍需要進(jìn)一步研究。該單瓶?jī)龈蓹C(jī)的凍干室有一層通過熱電冷卻器（TEC）冷卻的擱板，上面放置有單個(gè)5mL的小瓶。在-8℃用再循環(huán)冷卻裝置通過流動(dòng)乙二醇溶液從TEC背面（加熱）交換熱量。采用一T型熱電偶來測(cè)量擱板的溫度，該熱電偶通過凍干室一管道內(nèi)的接口進(jìn)入凍干室，在該接口處采用另兩個(gè)熱電偶來測(cè)定樣品的溫度，使用冰水懸浮液作為標(biāo)準(zhǔn)來校準(zhǔn)這些熱電偶。通過管道內(nèi)的接口將一Pirani（皮拉尼）真空計(jì)和一電容壓力計(jì)連接起來測(cè)定壓力。該系統(tǒng)的冷凝器由液氮冷阱組成，采用一真空泵將凍干室的非冷凝氣體（空氣）抽走，以獲得0.267Pa的極限低壓。寫入自定義控制軟件以獲取對(duì)SVFD進(jìn)行可編程溫度控制，并使擱板溫度控制與OCT圖像記錄同步，該軟件也記錄凍干機(jī)擱板溫度和小瓶?jī)?nèi)樣品溫度。由于認(rèn)為壓力控制對(duì)當(dāng)前運(yùn)行方式不重要，此處的樣品與擱板（在小瓶底部與擱板之間采用熱油脂）之間有幾乎完美的熱力學(xué)接觸，對(duì)于SVFD用不到壓力控制。在凍干過程中，壓力范圍為0.267～2.67Pa。凍干室一側(cè)配有一玻璃窗以便光接入用于OCT測(cè)量。SVFD-OCT-FDM的操作步驟如下：（1）將傳熱油脂鋪展在裝有溶液凍干小瓶的底部；（2）將小瓶放置在擱板上，再將熱電偶插入小瓶底部，并確保有一根熱電偶接觸到小瓶正中央的底部；（3）通過確定小瓶邊緣位置使OCT成像系統(tǒng)在一直線上；（4）在-45℃下冷凍溶液；（5）在-45℃冷凍45min后，通過啟動(dòng)真空泵對(duì)系統(tǒng)抽真空；（6）采用液氮將冷凝器室填滿；（7）在凍干室內(nèi)壓力達(dá)到2.67Pa后，關(guān)閉蝴蝶閥與真空泵，整個(gè)凍干過程保持真空，真空泵抽出的水蒸氣通過位于閥上游液氮冷卻的冷阱進(jìn)行捕集；（8）逐步升高溫度，開始初始干燥，并收集OCT數(shù)據(jù)；（9）升華干燥結(jié)束后，進(jìn)行解析干燥直至凍干結(jié)束。2.3

國(guó)內(nèi)凍干顯微鏡的研究近年來，真空冷凍干燥技術(shù)在我國(guó)推廣非常迅速，冷凍真空干燥設(shè)備也相對(duì)趨于完善，在食品、醫(yī)藥和生物制品等許多領(lǐng)域得到成功應(yīng)用。然而，對(duì)冷凍技術(shù)基礎(chǔ)理論的研究顯得相對(duì)滯后和薄弱，相關(guān)專業(yè)技術(shù)人才也不多。尤其是我國(guó)在凍干基礎(chǔ)理論研究方面不足，與國(guó)外的差距仍然很大，