選擇液相色譜柱要考慮哪些因素 液相色譜常見(jiàn)問(wèn)題解決方法

第第頁(yè)選擇液相色譜柱要考慮哪些因素液相色譜常見(jiàn)問(wèn)題解決方法色譜柱是運(yùn)用于色譜儀系統(tǒng)中起著分別作用的儀器，是色譜儀分析系統(tǒng)的核心部件，色譜柱柱效的高處與低處影響著檢測(cè)速率的快慢以及檢測(cè)結(jié)果的精準(zhǔn)性。因此，為了提高色譜柱

色譜柱是運(yùn)用于色譜儀系統(tǒng)中起著分別作用的儀器，是色譜儀分析系統(tǒng)的核心部件，色譜柱柱效的高處與低處影響著檢測(cè)速率的快慢以及檢測(cè)結(jié)果的精準(zhǔn)性。因此，為了提高色譜柱的柱效，保證液相色譜儀分析檢測(cè)的靈敏性，了解液相色譜柱的選購(gòu)技巧尤為緊要。

選擇液相色譜柱時(shí)需要考慮的緊要因素包括：鍵合相、粒徑、孔徑、碳載量，下面來(lái)一一介紹：

1、鍵合相：

確定了正反相后基本就簡(jiǎn)單了，正相很簡(jiǎn)單，我們重點(diǎn)討論下反相，C18緊要分別非極性和弱極性物質(zhì)，由于是鍵合硅膠，所以C18也分好幾種有常規(guī)的如C18—A，耐純水的OLAppleC18—AQ、耐酸堿的OLAppleC18—EX等，假如發(fā)覺(jué)C18保留很弱，調(diào)整流動(dòng)相也不行，這個(gè)時(shí)候可以考慮C8甚至C4等。

2、粒徑：

色譜法努力探求的是高效、高辨別、高速等。目前來(lái)說(shuō)亞2um填料或者2UM核殼填料是很理想的模型，基本具備“三高”特征尤其是高速，線速度不在影響分別度，不過(guò)附帶的缺點(diǎn)就是高壓，要升級(jí)相應(yīng)的硬件，成本高昂，需要謹(jǐn)慎考慮。5um填料比較普遍，目前來(lái)說(shuō)完全可以勝任各種日常檢測(cè)，即使有特別要求，3um色譜填料基本上也能全覆蓋，不過(guò)該模型下線速度和分別度是成反比的。

3、孔徑：

目前很多60～300A都有，甚至更高或者更低的。開(kāi)孔的填料多了個(gè)仿佛分子篩功能，所以選擇孔徑確定要關(guān)注分子量，蛋白（分子量5000以上）一般都需要在160A以上，多肽（分子量上限在3000左右）在120A左右，一般快速柱孔徑都很小，可以縮短樣品路徑。所以國(guó)際上還有無(wú)孔硅膠柱子，也很適合蛋白分別，徹底解決蛋白分子量大和太粘稠堵住孔徑問(wèn)題。

4、碳載量：

快速柱碳載量很低，如A家等，省時(shí)間，省溶劑，但分析部分多而雜樣品如中藥等有點(diǎn)力不從心，這個(gè)時(shí)候可以考慮英國(guó)OLApple色譜柱，碳載量15～23%，碳載量數(shù)值就像河床的水草，越高代表越密集，保留樣品本領(lǐng)越強(qiáng)，越有可能分別開(kāi)難分別物質(zhì)。

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現(xiàn)代液相色譜中，分別效果好壞很大程度上取決于色譜填料的選擇中。但是色譜填料的選擇范圍很寬，要做合適的選擇，必需對(duì)此有確定的認(rèn)得和了解。

硅膠基質(zhì)填料:

1、正相色譜

正相色譜用的固定相通常為硅膠（Silica），以及其他具有極性官能團(tuán)，如胺基團(tuán)（ZH2,APS）和氰基團(tuán)（CN，CPS）的鍵合相填料。

由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其他團(tuán)的極性教強(qiáng)，因此，分別的次序是依據(jù)樣品中的各組份的極性大小，即極性強(qiáng)落的組份zui先被沖洗杰出譜柱。

正相色譜使用的流動(dòng)相極性相對(duì)比固定相低，如：正乙烷（Hexane）,氯（Chloroform）二氯甲烷（MethylenceChloride）等。

2、反相色譜

反相色譜填料常是以硅膠為基礎(chǔ)，表面鍵合有極性相對(duì)教弱的官能團(tuán)的鍵合相。

反相色譜所使用的流動(dòng)相極性教強(qiáng)，通常為水，緩沖液與甲醇，已腈等混合物。

樣品流杰出譜柱的次序是極性教強(qiáng)組合zui先被沖出，而極性弱的組份會(huì)在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。

常用的反相填料有C18（ODS）C8（MOS）。C4（B）C6H5（Phenyl）等。

聚合物填料：

聚合物調(diào)料多為聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙酸至等，其緊要優(yōu)點(diǎn)是在PG值為1—14均可使用。

相對(duì)與硅膠基質(zhì)的C18填料，這類填料具有更強(qiáng)的淑水性；大孔的聚合物填料對(duì)蛋白質(zhì)等樣品的分別特別有效。

現(xiàn)在的聚合物填料的缺點(diǎn)是相對(duì)硅膠基質(zhì)填料，色譜柱柱效教低。

其他無(wú)機(jī)填料

其它HPLC的無(wú)機(jī)填料色譜柱也已經(jīng)商品化。由于其特別的性質(zhì)，一般于特別的用途。如墨化碳也用于正漸漸成為反相色譜填料。這種填料的分別不同與硅膠基質(zhì)烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎(chǔ)，不再需其它的表面改性，該柱填料一般比烷基鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保留本領(lǐng)更強(qiáng)，石墨化碳可用于分別某些幾何導(dǎo)構(gòu)體，又由于HPLC流動(dòng)相中不會(huì)被溶解，這類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可用于HPLC，氧化鋁微粒剛性強(qiáng)，可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床，其優(yōu)點(diǎn)是可在PH高達(dá)12的流動(dòng)相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物作用也很強(qiáng)，應(yīng)用范圍受到確定的限制，所以未能廣泛應(yīng)用，新型氧化誥填料也可用于HPLC，商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化誥微球色譜柱，應(yīng)用PH范圍1～14，溫度可達(dá)到1000C。由于氧化誥填料幾年才開(kāi)始討論，加之前的試驗(yàn)難度，其緊要用途與優(yōu)勢(shì)尚在進(jìn)行中。

怎樣選擇填料粒度

目前，商品化的色譜料粒度從1um到超過(guò)30um均有銷售，而目前分析分別緊要用3,5和10um填料，填料的粒度緊要影響填充柱的兩個(gè)參數(shù)，即柱效和背壓。粒度越小，填充柱的柱效越高；小于3um的填料應(yīng)用，在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分別度，但不是*的因素。假如固定相選擇是真確，但是分別度不夠，那么選擇更小粒度的填料是很用有的，3um填料填充柱的柱數(shù)比相同條件下的5UM填料的柱效提高近30%；然而；3um的色相譜的背壓卻是5um的2倍。與此同時(shí)，柱效提高意味著在相同條件下可以選擇更短的色譜柱，以縮短分析時(shí)間，另外，可以接受低粘度的溶劑做流動(dòng)相或加添色譜柱的使用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。

如何保證良好的柱性能與柱壽命

認(rèn)證閱讀色譜柱使用說(shuō)明書(shū)

使用填充良好的色譜柱

盡量削減壓力波動(dòng)，避開(kāi)機(jī)械及熱沖擊

使用保護(hù)柱及在線過(guò)濾器

常常以強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱

充分過(guò)濾樣品及流動(dòng)相，盡量避開(kāi)雜質(zhì)微粒與保強(qiáng)留分成

用穩(wěn)定的固定相（C18zui穩(wěn)定）

在中等PH紙操作（6～8），用有機(jī)年成液溶

色譜柱使用溫度小于400C

硅膠基質(zhì)的的色譜柱，應(yīng)保持流動(dòng)相的PH值范圍在3.0～8.0

在水流動(dòng)相與緩沖濃液中加200ppm的疊氮鈉

流動(dòng)相中含有緩沖溶液，應(yīng)注意應(yīng)95∶5的水及有機(jī)溶劑過(guò)渡，有機(jī)溶劑不能低于5%

過(guò)夜或儲(chǔ)存時(shí)，沖洗掉鹽和緩沖液，用純有機(jī)溶劑流動(dòng)相保存（乙晴）

液相色譜儀進(jìn)樣器的選擇

早期使用隔膜和停流進(jìn)樣器，裝在色譜柱進(jìn)口處?，F(xiàn)在大都使用六通進(jìn)樣閥或自動(dòng)進(jìn)樣器。

進(jìn)樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)對(duì)色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。HPLC進(jìn)樣方式可分為：隔膜進(jìn)樣、停流進(jìn)樣、閥進(jìn)樣、自動(dòng)進(jìn)樣。

1.隔膜進(jìn)樣。

用微量注射器將樣品注進(jìn)專門設(shè)計(jì)的與色譜柱相連的進(jìn)樣頭內(nèi)，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎即是零，可以獲得較佳的柱效，且價(jià)格便宜，操縱便利。但不能在高壓下使用（如10MPa以上）；此外隔膜輕易吸附樣品產(chǎn)生記憶效應(yīng)，使進(jìn)樣重復(fù)性只能達(dá)到1～2%；加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規(guī)分析使用受到限制。

2.停流進(jìn)樣。

可避開(kāi)在高壓下進(jìn)樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動(dòng)時(shí)往往會(huì)顯現(xiàn)“鬼峰”；另一缺點(diǎn)是保存時(shí)間不準(zhǔn)。在以峰的始末信號(hào)掌控餾分收集的制備色譜中，效果較好。

3.閥進(jìn)樣。

一般HPLC