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文檔簡介
關于雞胚成纖維細胞制備學習和掌握雞胚成纖維細胞的制備和培養(yǎng)方法;了解原代細胞培養(yǎng)的原理和方法。實驗目的第2頁,共15頁,星期六,2024年,5月CEF的培養(yǎng)是在一定條件下,在體外模擬體內(nèi)生理環(huán)境,使從體內(nèi)取出的成纖維組織細胞生存、生長和傳代,并維持原有組織細胞的結構和功能特性。雞胚成纖維細胞元代培養(yǎng)第3頁,共15頁,星期六,2024年,5月病毒能在易感的組織或單層細胞內(nèi)增殖,并可產(chǎn)生細胞病變,因此,細胞培養(yǎng)是病毒學研究的重要手段,是進行病毒性疫苗生產(chǎn)和病毒性疾病診斷必不可少的工具。原代細胞培養(yǎng)是體外制備細胞培養(yǎng)物的必經(jīng)過程,從供體體內(nèi)取出組織分散成單個細胞接種于培養(yǎng)液中為初次培養(yǎng),從初次培養(yǎng)到第一次傳代培養(yǎng)為原代培養(yǎng)。本實驗以雞胚成纖維細胞作為原代細胞,通過細胞培養(yǎng)實踐操作,認識和體會原代細胞的制備方法和影響細胞培養(yǎng)的主要因素,并掌握原代細胞培養(yǎng)的方法。實驗原理第4頁,共15頁,星期六,2024年,5月超凈工作臺,檢卵燈,滅菌的細胞培養(yǎng)瓶、眼科剪、眼科鑷、平皿、吸管、離心管等;9-11日齡雞胚;PBS,0.25%胰酶消化液,DMEM營養(yǎng)液,75%酒精棉。實驗所需器材、試劑第5頁,共15頁,星期六,2024年,5月(一)操作前的準備1、預熱培養(yǎng)液:把已經(jīng)配制好的生長液、Hanks液和胰蛋白酶液放入37℃水浴鍋內(nèi)預熱;2、用75%酒精棉擦拭雙手和紫外線照射過的超凈工作臺;3、正確擺放要使用的器械:保證足夠的操作空間,不僅便于操作而且可減少污染;4、點燃酒精燈.5、準備好將要使用的消毒后的培養(yǎng)瓶。6、取出預熱好的培養(yǎng)用液:取出已經(jīng)預熱好的培養(yǎng)用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內(nèi)。實驗步驟第6頁,共15頁,星期六,2024年,5月(二)雞胚成纖維細胞的制備1、雞胚的處理(1)蛋殼消毒取9-11日齡的雞胚,用檢卵燈選取血管清楚、活動正常的雞胚,置蛋架上,令氣室端向上,用碘酒棉消毒蛋殼氣室部位。(2)胚體采集以鑷子擊破卵殼氣室部位,并除去該部位卵殼。用無菌的眼科鑷子撕開蛋殼氣室膜并小心撥開絨毛尿囊膜和羊膜,用彎鑷子夾住雞胚頸部,移入滅菌的平皿內(nèi)。用剪刀剪去胚頭、四肢及內(nèi)臟,用PBS洗去體表血液,移入滅菌小燒杯中。實驗步驟第7頁,共15頁,星期六,2024年,5月(3)胚體勻漿用滅菌剪將胚體剪碎至1mm3小碎塊。加入PBS(淹住組織碎塊即可),輕搖,靜置1-2min,待組織塊下沉,吸去上層懸液。重復2-3次(以除去其中的紅細胞),至上懸液不混濁為止,移入滅菌的錐形瓶中,吸去PBS。實驗步驟第8頁,共15頁,星期六,2024年,5月2、分散細胞(1)胰酶消化將剪碎的組織塊放入錐形瓶中,加入適量的胰酶。包緊瓶口,37℃水域消化30min,每隔5min輕輕搖動1次。當組織塊變得蓬松透明時,吸棄消化液,用PBS洗兩遍,中止消化。如再繼續(xù)消化,可破壞細胞膜而不易貼壁生長,如果消化不夠,則細胞不易分散。實驗步驟第9頁,共15頁,星期六,2024年,5月(2)分散細胞將消化好的細胞懸液從水浴鍋中取出,棄去上層液體,加5mL含血清的DMEM生長液(DMEM營養(yǎng)液+5%犢牛血清+100IU/ml青鏈霉素,用7.5%NaHCO3溶液調(diào)pH7.2),以吸管反復吹吸數(shù)次,使細胞分散,此時可見生長液混濁,即為細胞懸液。靜置1min后,使未沖散的組織塊下沉。(3)過濾用4層脫脂紗布將吹打后的細胞過濾到平皿中,收集濾液。實驗步驟第10頁,共15頁,星期六,2024年,5月(三)分裝與培養(yǎng)1、細胞計數(shù)用細胞計數(shù)器計數(shù),根據(jù)計數(shù)結果,加入DMEM生長液,調(diào)整細胞濃度至50萬-60萬個/ml。實驗步驟第11頁,共15頁,星期六,2024年,5月2、分裝與培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中加入2mLDMEM生長液(如果是50mL的培養(yǎng)瓶,加4mL生長液),小心吸出過濾后的細胞懸液0.25mL至培養(yǎng)瓶中(如果是50mL的培養(yǎng)瓶,加0.5mL的細胞懸液),吹打均勻蓋好瓶塞。在瓶上注明組別、日期,置37℃溫箱中培養(yǎng)(4h后細胞即可貼壁,24-36h生長成單層細胞,此時可更換培養(yǎng)液,并接種病毒)。分裝后2-4h不可大幅度移動培養(yǎng)瓶,以免影響細胞的貼壁和生長。實驗步驟第12頁,共15頁,星期六,2024年,5月(四)細胞形態(tài)觀察檢查時注意培養(yǎng)液的顏色變化,變黃但不混濁表示有細胞生長,變紅表示細胞未生長或生長不佳。37℃培養(yǎng)24-48h后,于倒置顯微鏡下觀察,細胞可以長成單層,細胞透亮,呈纖維狀,細胞膜清晰。實驗步驟第13頁,共15頁,星期六,2024年,5月五、注意事項1、整個過程嚴格無菌操作2、培養(yǎng)液不要太多,應有足夠的空間保證細胞對氧的需要3、放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)時,將CO2濃度控制在5%。4、吸除消化液,向瓶內(nèi)注入PBS數(shù)毫升,輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶,把殘余消化液沖掉。注意沖洗細胞時,動作要輕,以免把已松動的細胞沖掉流失,如用胰蛋白酶液單獨消化,吸除胰酶液后,可不用PBS沖洗,直接加入培養(yǎng)液。5、細胞培養(yǎng)對玻璃器皿洗滌要求嚴格,徹底洗滌后用蒸餾水沖洗,再用雙蒸水沖
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