抗生素效價(jià)測(cè)定技術(shù)（藥品生物檢定課件）

抗生素效價(jià)測(cè)定技術(shù)：抗生素效價(jià)檢定概述：抗生素效價(jià)微生物檢定法知識(shí)點(diǎn)1：抗生素效價(jià)的概念及檢定用標(biāo)準(zhǔn)品一、抗生素效價(jià)定義抗菌活性是指抗菌藥物抑制或殺死病原微生物的能力?？股氐目咕钚酝ǔＳ眯r(jià)單位來(lái)表示，即抗菌效價(jià)指抗生素藥物的作用強(qiáng)度。在臨床應(yīng)用中，抗生素的效價(jià)可準(zhǔn)確地反映抗生素的醫(yī)療價(jià)值，以“單位（U/IU）”表示。硫酸鏈霉素798單位/毫克青霉素G鈉1670單位/毫克桿菌肽

74單位/毫克知識(shí)點(diǎn)1：抗生素效價(jià)的概念及檢定用標(biāo)準(zhǔn)品二、抗生素效價(jià)單位抗生素效價(jià)的標(biāo)示量，原則上應(yīng)按所含特定的抗菌活性部分的重量來(lái)計(jì)算。在應(yīng)用中，抗生素類藥物有效成分的表示方法，是按照各種抗生素的特點(diǎn)及使用經(jīng)驗(yàn)，采用符合客觀實(shí)際的效價(jià)單位表示。常用的抗生素效價(jià)單位有質(zhì)量單位、類似質(zhì)量單位、質(zhì)量折算單位、特定單位。知識(shí)點(diǎn)1：抗生素效價(jià)的概念及檢定用標(biāo)準(zhǔn)品抗生素效價(jià)單位的表示方法一、質(zhì)量單位質(zhì)量單位以抗生素中所含特定的抗菌活性部分（純游離堿或游離酸）的質(zhì)量1μg作為1單位，即1mg=1000單位。堿性抗生素以純堿的量作為有效部分的量；酸性抗生素以純酸的量作為有效部分的量。知識(shí)點(diǎn)1：抗生素效價(jià)的概念及檢定用標(biāo)準(zhǔn)品二、類似質(zhì)量單位

類似質(zhì)量單位以特定的純抗生素制品鹽的質(zhì)量1μg作為一個(gè)單位，即1mg＝1000單位，其中包括了無(wú)抗菌活性的酸根在內(nèi)。這種類似質(zhì)量單位，雖然并不合理，但在國(guó)際上已經(jīng)習(xí)慣沿用。知識(shí)點(diǎn)1：抗生素效價(jià)的概念及檢定用標(biāo)準(zhǔn)品三、質(zhì)量折算單位質(zhì)量折算單位是以特定的純抗生素制品的某一質(zhì)量為1單位而加以折算。

如：青霉素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品

第一批青霉素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，青霉素G鈉0.6微克為1單位，即1667單位/毫克。

第二批青霉素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，青霉素G鈉0.5988微克為1單位，即1670單位/毫克。知識(shí)點(diǎn)1：抗生素效價(jià)的概念及檢定用標(biāo)準(zhǔn)品四、特定單位特定單位是指對(duì)于不易得到純品，組成成分較復(fù)雜的抗生素，在開(kāi)始生產(chǎn)及臨床使用時(shí)，只能以一特定量的標(biāo)準(zhǔn)品（或?qū)φ掌罚┳鳛?單位。

如：桿菌肽國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品

第一批桿菌肽A國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品為55單位/毫克；

第二批桿菌肽A國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品為74單位/毫克。知識(shí)點(diǎn)1：抗生素效價(jià)的概念及檢定用標(biāo)準(zhǔn)品五、抗生素微生物檢定用標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品是指用于生物檢定、抗生素或生化藥品中含量或效價(jià)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按效價(jià)單位（或μg）計(jì)，以國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)定。標(biāo)準(zhǔn)品分為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品。知識(shí)點(diǎn)1：抗生素效價(jià)的概念及檢定用標(biāo)準(zhǔn)品六、供試品供試品是供檢定其效價(jià)的樣品，它的活性組分應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品基本相同。需用各品種項(xiàng)下規(guī)定的溶劑溶解，再按估計(jì)效價(jià)或標(biāo)示量稀釋至與標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)?shù)臐舛取?/p>

知識(shí)點(diǎn)3：濁度法

濁度法的測(cè)定原理

是分別加入抗生素標(biāo)準(zhǔn)品和供試品到已接種有試驗(yàn)菌的培養(yǎng)液中，因不同濃度的抗生素對(duì)試驗(yàn)菌的抑制作用不同，在一定時(shí)間內(nèi)，通過(guò)測(cè)量培養(yǎng)基內(nèi)試驗(yàn)菌濃度（濁度）變化就可確定供試品的效價(jià)。知識(shí)點(diǎn)3：濁度法通過(guò)監(jiān)測(cè)等量的試驗(yàn)菌菌液在不同濃度的抗生素液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，利用分光光度法測(cè)定含不同濃度的抗生素的液體培養(yǎng)基的濁度，從而衡量抗生素抑菌效力的方法。可用于抗生素藥物的含量（效價(jià)）測(cè)定。濁度法知識(shí)點(diǎn)3：濁度法

特點(diǎn)：

濁度法因在液體中進(jìn)行，所以不受擴(kuò)散因素的影響，不會(huì)像管碟法那樣易受如鋼圈的放置、向鋼圈內(nèi)滴液的速度、液面的高低、菌層厚薄等種種因素影響抗生素在瓊脂表面擴(kuò)散，而造成結(jié)果的差異或試驗(yàn)的失敗。同時(shí)本法誤差較小，管碟法的可信限率為5%，最大可達(dá)7%，而本法在1%—3%；而且可進(jìn)行自動(dòng)化測(cè)定，易實(shí)行規(guī)范化操作。知識(shí)點(diǎn)3：濁度法一、菌懸液的制備：如金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌懸液二、檢查用溶液的制備（一）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備（二）供試品溶液的制備三、含試驗(yàn)菌液體培養(yǎng)基的制備知識(shí)點(diǎn)3：濁度法四、檢定操作方法（一）線性試驗(yàn)

除另有規(guī)定外，取適宜的大小厚度均勻的已滅菌試管，在各試驗(yàn)管內(nèi)精密加入含試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基9.0ml，再分別精密加入各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0ml，立即混勻，按隨機(jī)區(qū)組分配將各管在規(guī)定條件下培養(yǎng)至適宜測(cè)量的濁度值（通常約為4小時(shí)）。知識(shí)點(diǎn)3：濁度法（三）空白試驗(yàn)

另取2支試管，各加入藥品稀釋劑1.0ml，再分別加入含試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基9.0ml。其中一支試管立即加入甲醛溶液0.5ml，混勻，作為空白對(duì)照。另一支試管同法培養(yǎng)，作為細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)照。知識(shí)點(diǎn)3：濁度法（四）吸光度的測(cè)量

在線測(cè)定各管的吸光度?；蛉〕?，立即加入%甲醛溶液(1_：3)0.5ml以終止微生物生長(zhǎng)，在530或580nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管的吸光度。（五）記錄與計(jì)算1．試驗(yàn)記錄要求應(yīng)包括抗生素的品種、劑型、標(biāo)示量、生產(chǎn)廠、批號(hào)、檢查目的、檢驗(yàn)依據(jù)、檢驗(yàn)日期、溫度、濕度、標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的稱量、稀釋步驟與核對(duì)人、抑菌圈測(cè)量結(jié)果。知識(shí)點(diǎn)3：濁度法2．標(biāo)準(zhǔn)曲線的計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品的各濃度對(duì)數(shù)值及相對(duì)應(yīng)的吸光度列成表。3．回歸系數(shù)的顯著性測(cè)驗(yàn)判斷回歸得到的方程是否成立，即x、y是否有直線關(guān)系，可采用t檢驗(yàn)。4．測(cè)定結(jié)果的計(jì)算及可信限率估計(jì)。5．實(shí)驗(yàn)計(jì)算所得效價(jià)低于估計(jì)效價(jià)的90%或高于估計(jì)效價(jià)的110%，則檢驗(yàn)結(jié)果僅作為初試，應(yīng)調(diào)整供試品估計(jì)效價(jià)，予以重試。

知識(shí)點(diǎn)3：濁度法6．原料藥效價(jià)測(cè)定一般需雙份樣品，平行實(shí)驗(yàn)以便核對(duì)。對(duì)不符合規(guī)定的樣品應(yīng)至少有2次符合規(guī)定的結(jié)果，才能發(fā)出報(bào)告。7．效價(jià)結(jié)果的有效數(shù)字按《中國(guó)藥典》的規(guī)定取舍小數(shù)位。知識(shí)點(diǎn)3：濁度法五、二劑量法或三劑量法除另有規(guī)定外，取大小一致的已滅菌的試管，在各品種項(xiàng)下規(guī)定的劑量反應(yīng)線性范圍內(nèi)選擇適宜的高、（中）、低濃度，分別精密加入各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液各1.0ml，二劑量的劑距為2：1或4：1，三劑量的劑距為1:0.8。比濁法劑量間的比例通常為1：1.25或更小。同標(biāo)準(zhǔn)曲線法操作，每一濃度組不少于4個(gè)試管，按隨機(jī)區(qū)組分配將各試管在規(guī)定條件下培養(yǎng)。照生物檢定統(tǒng)計(jì)法的規(guī)定進(jìn)行可靠性測(cè)驗(yàn)及效價(jià)計(jì)算。知識(shí)點(diǎn)3：濁度法六、供試品供試品是供檢定其效價(jià)的樣品，它的活性組分應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品基本相同。需用各品種項(xiàng)下規(guī)定的溶劑溶解，再按估計(jì)效價(jià)或標(biāo)示量稀釋至與標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)?shù)臐舛?。知識(shí)點(diǎn)：管碟法一、檢定原理管碟法，又稱杯碟法，是通過(guò)將不銹鋼小管（俗稱為牛津杯）放置在含敏感試驗(yàn)菌的瓊脂培養(yǎng)基上，將抗生素溶液注入小鋼管中，抗生素分子隨溶劑向培養(yǎng)基內(nèi)呈球面狀放射狀擴(kuò)散。同時(shí)將培養(yǎng)基置入適宜試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)箱內(nèi)，使試驗(yàn)菌開(kāi)始生長(zhǎng)。抗生素分子在瓊脂培養(yǎng)基中的濃度隨與小鋼管間距離的增大而降低，離小鋼管越遠(yuǎn)，培養(yǎng)基中的抗生素分子越少，相應(yīng)的抗生素濃度越低。當(dāng)抗生素分子擴(kuò)散達(dá)到一定時(shí)間，可在小鋼管周圍形成一個(gè)抑菌圈。知識(shí)點(diǎn)：管碟法知識(shí)點(diǎn)：管碟法知識(shí)點(diǎn)：管碟法從圖11-1和式(11-2)可以看出，抑菌圈的半徑大小與最小抑菌濃度c、瓊脂層厚度H、抗生素在瓊脂內(nèi)擴(kuò)散系數(shù)D、抗生素在小鋼管中的量M以及抗生素的擴(kuò)散時(shí)間T有關(guān)。這些因素的改變會(huì)影響抑菌圈的大小和清晰度。故在抗生素效價(jià)測(cè)定時(shí)，為消除各種因素的干擾，采用標(biāo)準(zhǔn)品和供試品在相同試驗(yàn)條件下進(jìn)行，測(cè)得相對(duì)效價(jià)的比率，再由已知標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)計(jì)算供試品效價(jià)。管碟法的優(yōu)點(diǎn)是樣品用量少、靈敏度高，但同時(shí)專屬性較差、操作煩瑣、影響因素多。知識(shí)點(diǎn)：管碟法知識(shí)鏈接

量反應(yīng)平行線原理抗生素微生物檢定法是基于量反應(yīng)平行線原理，即“在量反應(yīng)指標(biāo)中，當(dāng)抗生素濃度的對(duì)數(shù)劑量與反應(yīng)呈直線關(guān)系，且供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的作用性質(zhì)相同時(shí)，供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的兩條量反應(yīng)關(guān)系曲線相互平行”。

管碟法試驗(yàn)中，在一定劑量范圍內(nèi)，抗生素的對(duì)數(shù)劑量與其抑菌圈大小呈直線關(guān)系，抗生素標(biāo)準(zhǔn)品和供試品在產(chǎn)生的兩條量反應(yīng)直線平行，符合量反應(yīng)平行線原理。知識(shí)點(diǎn)：管碟法圖11-2抗生素量-反應(yīng)直線知識(shí)點(diǎn)：管碟法二、檢定方法（一）操作流程1.試驗(yàn)用菌液、緩沖液、培養(yǎng)基的配制2.標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液的3.雙碟的4.滴加藥液到小鋼管5.培養(yǎng)6.抑菌圈測(cè)量7.計(jì)算結(jié)果知識(shí)點(diǎn)：管碟法知識(shí)點(diǎn)：管碟法管碟法根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)不同，可分為：1.一劑量法(標(biāo)準(zhǔn)曲線法)常用于原料生產(chǎn)的過(guò)程監(jiān)控、中間體或半成品檢驗(yàn)

2.二劑量法(2.2法)是抗生素質(zhì)量檢驗(yàn)的常規(guī)方法3.三劑量法(3.3法)

主要用于標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)定

日常使用多采用二劑量法，對(duì)于有爭(zhēng)議結(jié)果，必須使用三劑量法測(cè)定的結(jié)果仲裁。知識(shí)點(diǎn)：管碟法（二）操作注意事項(xiàng)1.試驗(yàn)環(huán)境實(shí)驗(yàn)室應(yīng)防止抗生素及微生物的污染。2.儀器用具

玻璃容器應(yīng)清洗、滅菌；校正后方可使用。雙碟的規(guī)格應(yīng)符合藥典規(guī)定。3.試驗(yàn)菌應(yīng)具備如下特點(diǎn)：對(duì)抗生素成分敏感，對(duì)雜質(zhì)、降壓物質(zhì)及毒性物質(zhì)無(wú)作用或作用很低；靈敏、穩(wěn)定、抑菌圈邊緣清晰、測(cè)定誤差??；易于培養(yǎng)、保存，無(wú)致病性；與同品種國(guó)際通用藥典所用試驗(yàn)菌一致，以便效價(jià)單位的統(tǒng)一。知識(shí)點(diǎn)：管碟法4.操作次序上的誤差要求滴加迅速。在操作很多檢品時(shí)，以分批操作為好。5.抑菌圈的測(cè)量

測(cè)量抑菌圈是管碟法的重要環(huán)節(jié)，應(yīng)盡量避免主觀誤差的產(chǎn)生。技能點(diǎn)1：二劑量法操作規(guī)程四、二劑量法（一）效價(jià)計(jì)算公式

二劑量法是將抗生素的標(biāo)準(zhǔn)品、供試品各稀釋成高、低兩種劑量（4:1或2:1），在同一含試驗(yàn)菌的瓊脂培養(yǎng)基平板上進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)兩種劑量四種溶液所產(chǎn)生的抑菌圈大小，計(jì)算出供試品的效價(jià)。技能點(diǎn)1：二劑量法操作規(guī)程（一）效價(jià)計(jì)算公式

二劑量法供試品的效價(jià)計(jì)算：式中，T2為供試品高劑量；T1為供試品低劑量；S2為標(biāo)準(zhǔn)品高劑量；Sl為標(biāo)準(zhǔn)品低劑量；R為供試品和標(biāo)準(zhǔn)品等反應(yīng)劑量的比值；I為高、低劑量間濃度比的對(duì)數(shù)（常數(shù)）；Pr為供試品的測(cè)得效價(jià)；AT為供試品的標(biāo)示量。技能點(diǎn)1：二劑量法操作規(guī)程（二）操作方法1.檢驗(yàn)用溶液的制備（1）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：標(biāo)準(zhǔn)品的使用與保存，應(yīng)遵循標(biāo)準(zhǔn)品使用說(shuō)明書的規(guī)定。（2）供試品溶液的制備：精密稱取供試品，用各藥品項(xiàng)下規(guī)定的溶劑溶解后，制成濃度一般為lOOOU/ml的濃溶液，再根據(jù)要求用緩沖液稀釋至與標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)?shù)牡蔚米罱K高、低兩個(gè)濃度，作為供試品溶液。

技能點(diǎn)1：二劑量法操作規(guī)程

技能點(diǎn)1：二劑量法操作規(guī)程2.菌懸液的制備(1)枯草芽孢桿菌懸液：取枯草芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于盛有營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在35~37℃培養(yǎng)7日，用革蘭染色法涂片鏡檢，應(yīng)有芽孢85%以上。用滅菌水將芽孢洗下，在65℃加熱30分鐘，備用。

(2)短小芽孢桿菌懸液：取短小芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，照上述方法制備。

(3)金黃色葡萄球菌懸液：取金黃色葡萄球菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，在35~37℃培養(yǎng)20~22小時(shí)。臨用時(shí)，用滅菌水或0.9%滅菌氯化鈉溶液將菌苔洗下，備用。

技能點(diǎn)1：二劑量法操作規(guī)程2.菌懸液的制備

(4)藤黃微球菌懸液：取藤黃微球菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于盛有營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在26—27℃培養(yǎng)24小時(shí)，或采用適當(dāng)方法制備的菌斜面。用培養(yǎng)基Ⅲ或0.9%滅菌氯化鈉溶液將菌苔洗下，備用。

(5)大腸埃希菌[EscherichiacoliCMCC(B)44103]懸液：取大腸埃希菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，在35~37℃培養(yǎng)20~22小時(shí)。臨用時(shí)，用滅菌水將菌苔洗下，備用。

技能點(diǎn)1：二劑量法操作規(guī)程3.雙碟的制備

在半無(wú)菌室內(nèi)或超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，應(yīng)注意微生物及抗生素的污染，放雙碟的臺(tái)面應(yīng)用水平儀調(diào)水平。玻璃/塑料平皿(d=90mmh=16-17mm)

菌層5ml含菌培養(yǎng)基底層20ml滅菌培養(yǎng)基技能點(diǎn)1：二劑量法操作規(guī)程制備底層制備菌層技能點(diǎn)1：二劑量法操作規(guī)程4.放置鋼管5.滴碟、培養(yǎng)毛細(xì)滴管（或滴管）滴碟滴加順序：按標(biāo)準(zhǔn)品高劑量溶液→供試品高劑量溶液→標(biāo)準(zhǔn)品低劑量溶液→供試品低劑量溶液

（即SH→TH→SL→TL）

6.測(cè)量抑菌圈

雙碟透明度好，無(wú)破損和不透明現(xiàn)象；抑菌圈應(yīng)圓滿，無(wú)破圈或圈不完整現(xiàn)象，否則應(yīng)棄去該雙碟。技能點(diǎn)1：二劑量法操作規(guī)程技能點(diǎn)1：二劑量法操作規(guī)程技能點(diǎn)1：二劑量法操作規(guī)程

在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間

技能點(diǎn)1：二劑量法操作規(guī)程測(cè)量抑制圈

技能點(diǎn)1：二劑量法操作規(guī)程測(cè)量?jī)x器技能點(diǎn)1：二劑量法操作規(guī)程方法一方法二技能點(diǎn)1：二劑量法操作規(guī)程技能點(diǎn)1：二劑量法操作規(guī)程（三）記錄與計(jì)算1.記錄

試驗(yàn)記錄應(yīng)包括抗生素的品種、劑型、規(guī)格、標(biāo)示量、生產(chǎn)廠商、批號(hào)、檢驗(yàn)?zāi)康摹z驗(yàn)依據(jù)、檢驗(yàn)日期、溫度、濕度、標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的稱量、稀釋步驟與核對(duì)人、抑菌圈測(cè)量結(jié)果。技能點(diǎn)1：二劑量法操作規(guī)程2.計(jì)算式中,PT為供試品效價(jià)相當(dāng)于標(biāo)示值或估計(jì)效價(jià)的百分?jǐn)?shù);S2為標(biāo)準(zhǔn)品高濃度所致抑菌圈直徑(面積)總和;S1為標(biāo)準(zhǔn)品低濃度所致抑菌圈直徑(面積)總和;T2為供試品高濃度所致抑菌圈直徑(面積)總和;T1為供試品低濃度所致抑菌圈直徑(面積)總和;I為高、低