GB∕T 43776-2024 單細(xì)胞測序樣本采集與處理規(guī)范（正式版）

單細(xì)胞測序樣本采集與處理規(guī)范2024-03-15發(fā)布2024-03-15實施GB/T43776—2024 I 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4縮略語 25總體原則和要求 26樣本采集 26.1采集前的準(zhǔn)備 26.2采集 37樣本處理 7.1處理前的準(zhǔn)備 47.2處理 48質(zhì)量驗證 7附錄A(資料性)組織細(xì)胞酶解法 8附錄B(資料性)細(xì)胞群富集方法 附錄C(資料性)臺盼藍(lán)染色操作流程 C.2試劑耗材 C.3檢測步驟 參考文獻(xiàn) I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由全國生物樣本標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC559)提出并歸口。本文件起草單位：深圳華大生命科學(xué)研究院、上海芯超生物科技有限公司、復(fù)旦大學(xué)、中國計量科學(xué)研究院、廣東省中醫(yī)院(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院)、上海生物芯片有限公司、青島華大智造科技有限責(zé)任公司、上海國際人類表型組研究院、深圳大學(xué)、唐頤控股(深圳)有限公司、上海億康醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所)、上海水大技術(shù)轉(zhuǎn)移有限公司。1單細(xì)胞測序樣本采集與處理規(guī)范1范圍本文件規(guī)定了單細(xì)胞測序樣本采集與處理的基本要求及質(zhì)量驗證。本文件適用于人和動物血液與組織、植物組織、細(xì)胞系及其他特殊單細(xì)胞測序待檢樣本的采集與處理。本文件不適用于微生物樣本的采集與處理。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T35892實驗動物福利倫理審查指南GB/T38576人類血液樣本采集與處理GB/T38736人類生物樣本保藏倫理要求GB/T40352.1人類組織樣本采集與處理第1部分：手術(shù)切除組織動物生物樣本保藏要求(Biotechnology-Biobanking—Requirementsforanimalbiologicalmaterial)logy—Biobanking—Requirementsforthebiobankingofplantd3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。單細(xì)胞測序singlecellsequencing利用單細(xì)胞基因組擴增技術(shù)，通過高通量測序得到單個細(xì)胞中所有的基因組、轉(zhuǎn)錄組等序列的技由原代細(xì)胞或細(xì)胞群經(jīng)傳代培養(yǎng)而獲得的具有非均質(zhì)性特征的細(xì)胞群。密度梯度離心densitygradientcentrifugation用一定的介質(zhì)(如氯化銫、蔗糖和多聚蔗糖)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離的方法。2解離dissociation通過破壞掉細(xì)胞間隙中維系細(xì)胞關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)，使細(xì)胞分離開的過程。從稀有細(xì)胞或珍貴樣本中通過流式或磁珠分選等技術(shù)方法，提高目標(biāo)細(xì)胞群含量的操作過程。獲取所需要的生物樣本及其相關(guān)數(shù)據(jù)的過程。在細(xì)胞群體中除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片外，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比。4縮略語下列縮略語適用于本文件。PBMC:外周血單個核細(xì)胞(PeripheralBloodMononuclearCell)PBS:磷酸緩沖鹽溶液(PhosphateBufferedSaline)5總體原則和要求5.1樣本處理環(huán)境應(yīng)符合GB19489的要求。5.2人類生物樣本的采集與處理應(yīng)符合GB/T38736的要求，應(yīng)獲得倫理委員會審批，采集前應(yīng)在充分告知、尊重捐獻(xiàn)者權(quán)利的前提下簽署知情同意書，確保不會對捐獻(xiàn)者的健康和診斷治療產(chǎn)生不利的5.3動物生物樣本的采集與處理應(yīng)符合GB/T35892的要求，應(yīng)獲得倫理委員會審批。在采集前保定動物時，宜盡可能減少動物的不適及痛苦和應(yīng)激反應(yīng)。5.5應(yīng)對樣本采集與處理的各個過程進(jìn)行記錄，確保能夠?qū)μ幚磉^程進(jìn)行溯源。5.6應(yīng)對樣本采集和處理中可能出現(xiàn)的偏離情況形成文件化的程序，并予以執(zhí)行。5.7樣本的采集和處理應(yīng)由培訓(xùn)合格的工作人員進(jìn)行。5.8處理后的單細(xì)胞樣本應(yīng)進(jìn)行合理的保存，避免影響后續(xù)的單細(xì)胞測序。6樣本采集b)樣本的生物安全等級、傳染性及相應(yīng)的個體防護(hù)要求；c)樣本的物種和類型；d)采集時間；3e)采集場所；f)采集人員及其資質(zhì)；g)采集的例數(shù)，每例樣本采集的數(shù)量；i)可明確追溯到原始樣本的標(biāo)記方式；j)采集后的處理、存儲、運輸條件和包裝要求；k)樣本必要信息記錄表，如名稱、編號、來源、物種、類型、數(shù)量以及其他必要信息(例如樣本是否與腫瘤有關(guān)、樣本的傳染性等);1)樣本采集過程所用采集器材、耗材及廢棄物的安全處理方式等。6.2.1人和動物血液樣本采集人類血液樣本的采集應(yīng)符合GB/T38576的要求。動物血液樣本的采集應(yīng)符合ISO/TS20388:2021中5.2.3的要求。宜使用抗凝采血管作為采集容器。宜采用以下保存和運輸方案：——置于4℃保存和運輸，采血至血樣處理時間應(yīng)不超過6h;——置于4℃保存，2h內(nèi)制備成PBMC懸液，進(jìn)行程序性降溫后保存于液氮或一80℃,需要時再進(jìn)行復(fù)蘇。運輸時應(yīng)全程保持足量干冰，凍存的PBMC可用干冰運輸。6.2.2人和動物組織樣本采集人類組織手術(shù)切除樣本的采集應(yīng)符合GB/T40352.1的要求，人類組織活檢樣本的采集應(yīng)由有資質(zhì)的人員負(fù)責(zé)。動物組織樣本的采集應(yīng)符合ISO/TS20388:2021中5.2.4的要求。采集的組織類型可包括正常組織、腫瘤組織和癌旁組織等。應(yīng)根據(jù)采集方案準(zhǔn)確采集目標(biāo)組織部位，棄去與樣本無關(guān)的組織、血漬或污物。組織樣本采集后宜切割為小塊的組織塊進(jìn)行多管分裝，并根據(jù)運輸時間、單細(xì)胞測序分析類型等制定合適的保存和運輸方案，包括但不限于：——4℃保存，并在組織離體2h內(nèi)進(jìn)行樣本處理；——放入裝有預(yù)冷組織保存液的樣本管中，4℃保存和運輸，并在組織離體48h內(nèi)進(jìn)行樣本處理；——放入裝有預(yù)冷組織保存液的凍存管中，進(jìn)行程序性降溫后保存于液氮或一80℃,需要時再進(jìn)行復(fù)蘇；凍存的組織可用干冰運輸，運輸時應(yīng)全程保持足量干冰；——放入凍存管中直接進(jìn)行液氮速凍，液氮或一80℃保存；凍存的組織可用干冰運輸，運輸時應(yīng)全程保持足量干冰；——按照商業(yè)組織保存液的試劑說明書進(jìn)行保存和運輸。6.2.3植物組織樣本采集植物組織的采集應(yīng)符合ISO/TS23105:2021第5章的要求。宜選取生長狀態(tài)良好的活體植株，采集新鮮離體的植物組織后宜立即進(jìn)行樣本處理。6.2.4細(xì)胞系樣本采集宜選取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞系以確保細(xì)胞活性。4應(yīng)根據(jù)細(xì)胞系類型、運輸時間、單細(xì)胞測序分析類型等制定合適的保存和運輸方案，包括但不限于：——4℃保存和運輸，并在24h內(nèi)進(jìn)行樣本處理；——加入細(xì)胞凍存液，進(jìn)行程序性降溫后液氮或一80℃保存，需要時再進(jìn)行復(fù)蘇；凍存的細(xì)胞系可用干冰運輸，運輸時應(yīng)全程保持足量干冰；——按照商業(yè)細(xì)胞凍存液的試劑說明書進(jìn)行保存和運輸。針對其他特殊類型的樣本，如類器官、尿液、胸腹水、腦脊液等的采集，應(yīng)根據(jù)預(yù)期用途和后續(xù)具體的單細(xì)胞測序分析類型及方案等，選擇并驗證適宜的采集方案。注：采集方案優(yōu)先選擇來自國內(nèi)外行業(yè)公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)或指南，公認(rèn)/權(quán)威的教科書或已發(fā)表的相關(guān)文章中的程序。應(yīng)對樣本進(jìn)行編碼，打印不易脫落、標(biāo)注清晰的標(biāo)簽。仔細(xì)核對樣本信息，確認(rèn)無誤后將標(biāo)簽粘貼在樣本采集容器上。7樣本處理7.1處理前的準(zhǔn)備7.1.1應(yīng)形成文件化的樣本接收要求和偏離情況處置方案。接收要求應(yīng)包括但不限于樣本管完整性、運輸溫度有效性、標(biāo)記的可追溯性和可識別性(如樣本的有效性、結(jié)冰、凍融等情況)。7.1.2應(yīng)建立滿足預(yù)期要求的接收程序，根據(jù)接收程序要求對樣本的接收狀態(tài)進(jìn)行檢查并記錄。若樣本狀態(tài)不符合接收要求，應(yīng)按照偏離的文件要求執(zhí)行。7.1.3應(yīng)根據(jù)不同的樣本類型和預(yù)期目的，制定文件化的處理方案，形成詳細(xì)的作業(yè)指導(dǎo)書，明確各個步驟的具體要求。7.1.4應(yīng)明確樣本處理后所用處理器材、耗材及廢棄物的安全處理方式。7.2處理樣本處理應(yīng)建立符合研究目的的操作規(guī)程，并使用不含核酸酶的試劑和耗材。樣本處理操作應(yīng)減少對細(xì)胞的損傷，如減少吹吸次數(shù)、采用大口徑槍頭、輕柔緩慢地移液等。應(yīng)對樣本處理的各個過程及樣本的狀態(tài)進(jìn)行詳細(xì)記錄，記錄應(yīng)能夠還原處理過程。記錄的過程文件應(yīng)得到適當(dāng)?shù)谋４?。如在各處理過程遇到偏離情況，應(yīng)予以記錄，并通知所有相關(guān)方。7.2.2細(xì)胞群懸液制備.1.1應(yīng)根據(jù)不同樣本類型選取適合的解離方案，以確保樣本細(xì)胞完整性。.1.2解離方案包括但不限于： 機械法：通過切割、切塊、移液器吹打等方法機械剪切和破壞組織；5——酶解法：使用膠原酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、彈性蛋白酶等多種酶消化組織，解離蛋白鍵；——結(jié)合方案：機械法和酶解法依次或同時進(jìn)行，實現(xiàn)更廣泛的解離。.1.3應(yīng)選擇適宜的解離方案，組織細(xì)胞酶解法可參考附錄A或根據(jù)商業(yè)細(xì)胞提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。注：解離不充分或解離過度均會影響單細(xì)胞測序的質(zhì)量。.2人和動物血液樣本解離.2.1血液樣本處理前不應(yīng)劇烈搖晃，避免發(fā)生溶血。.2.2血液樣本應(yīng)采用離心法收集細(xì)胞，并使用緩沖液清洗得到懸浮液。.2.3若細(xì)胞沉淀中有紅細(xì)胞，應(yīng)立即裂可將其進(jìn)行程序性降溫后保存于液氮或一80℃,需要時再進(jìn)行復(fù)蘇，復(fù)蘇后應(yīng)進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)。.3.1新鮮離體2h內(nèi)、4℃保存的組織樣本，或離體48h內(nèi)使用組織保存液、4℃保存的組織樣本，可直接進(jìn)行解離；組織保存液中保存，并經(jīng)程序性降溫后保存于液氮或一80℃的組織樣本應(yīng)先復(fù)蘇再進(jìn)行解離；直接進(jìn)行液氮速凍的組織樣本應(yīng)分離細(xì)胞核進(jìn)行單細(xì)胞核測序。組織樣本應(yīng)通過機械法、酶解法或組合方案解離。應(yīng)根據(jù)不同組織的細(xì)胞外基質(zhì)選擇適宜的方案：——采用機械法。用物理切割或刀片切碎的方式使組織分開，分離過程宜在冰上操作。應(yīng)使用鋒利的解離器械，盡可能減少對細(xì)胞的機械損傷，切碎組織時應(yīng)避免組織干燥；——采用酶解法。酶解應(yīng)完全充分，應(yīng)根據(jù)組織類型等摸索合適的酶濃度，濃度過低起不到較好消化效果，濃度過高對細(xì)胞有毒性。不同組織所采用的特定酶和消化時間參照附錄A。當(dāng)細(xì)胞活率低時，應(yīng)適當(dāng)降低酶濃度或縮短解離時間；——采用組合方案。先切割分離，再酶解消化。.3.3若消化后的懸液中有紅細(xì)胞，應(yīng)立即裂解并去除。.3.4應(yīng)避免長時間操作產(chǎn)生細(xì)胞團(tuán)塊，細(xì)胞分離過程中可加入脫氧核糖核酸酶(DNase)等輔助酶，以減少細(xì)胞團(tuán)塊的產(chǎn)生。.4.1應(yīng)采用新鮮離體的植物組織。.4.2植物組織應(yīng)采用酶解法軟化或去除細(xì)胞壁。應(yīng)根據(jù)不同植物組織類型和細(xì)胞壁成分選擇最適孵育時間和酶解法。注：酶解法中常用的植物組織酶解液主要由纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等組成。.4.3應(yīng)使用細(xì)胞過濾器對消化后的懸液進(jìn)行過濾，得到原生質(zhì)體懸液。.4.4對于某些組織樣本(如含有次生細(xì)胞壁的成熟組織樣本),細(xì)胞壁消化困難，應(yīng)分離細(xì)胞核進(jìn)行單細(xì)胞核測序。.5.1新鮮細(xì)胞系或離體24h內(nèi)、4℃保存和運輸?shù)募?xì)胞系可直接解離；使用細(xì)胞保護(hù)液保護(hù)并經(jīng)程序性降溫后保存于液氮或一80℃的細(xì)胞系應(yīng)先復(fù)蘇再進(jìn)行解離。.5.2貼壁細(xì)胞系樣本應(yīng)先進(jìn)行消化和懸浮，得到細(xì)胞懸浮液。.5.3當(dāng)出現(xiàn)大量明顯的細(xì)胞團(tuán)塊或細(xì)胞殘骸時，應(yīng)進(jìn)行上下吹打，溫和混勻，并用合適孔徑的6細(xì)胞過濾器過濾細(xì)胞。不同類型的細(xì)胞系應(yīng)采用不同的離心條件獲得細(xì)胞。對于較小的細(xì)胞(如原代細(xì)胞),宜在室溫條件下，300rcf離心5min;對于較大的細(xì)胞(如永生細(xì)胞),宜在室溫條件下，150rcf離心注：離心速度過快或離心時間過長會損害細(xì)胞的完整性和活力。.6.1針對不易獲得完整單細(xì)胞的樣本，可考慮收集細(xì)胞核進(jìn)行單細(xì)胞核測序，如神經(jīng)元組織樣本或直接進(jìn)行液氮速凍的樣本等。.6.2針對其他特殊類型樣本的解離，如類器官、人類尿液、胸腹水、脊髓液等，應(yīng)根據(jù)預(yù)期用途和后續(xù)單細(xì)胞測序分析類型及具體方案等，選擇并驗證適宜的解離方案，如離心法、酶解法等。注：解離方案優(yōu)先選擇來自國內(nèi)外行業(yè)公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)或指南，公認(rèn)/權(quán)威的教科書，參考發(fā)表的相關(guān)文章等。.1對稀有細(xì)胞或珍貴樣本，應(yīng)富集特定的細(xì)胞群，或去除不需要的細(xì)胞群(包括死細(xì)胞)。.2應(yīng)針對各種特定的組織類型對不同的方法進(jìn)行優(yōu)化，包括但不限于離心、磁珠、流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)、微流體細(xì)胞分選等，各類方法說明參見附錄B。.1細(xì)胞制備完成后宜盡快進(jìn)行清洗和重懸，在30min內(nèi)完成，以保證細(xì)胞活性。.2細(xì)胞清洗和重懸前，應(yīng)根據(jù)細(xì)胞類型選擇適當(dāng)?shù)那逑创螖?shù)、清洗緩沖液成分、離心條件或濾器類型，以減少單細(xì)胞制備的污染成分。.3宜采用不含Ca2+和Mg2+的磷酸鹽緩沖液作為細(xì)胞清洗和重懸液。特定類型的細(xì)胞，如原.4清洗和重懸時，應(yīng)根據(jù)樣本的情況選取適當(dāng)體積的細(xì)胞懸液以減少細(xì)胞聚集和結(jié)塊。.1應(yīng)采用合適的細(xì)胞過濾器對細(xì)胞懸液進(jìn)行過濾，避免細(xì)胞殘骸或細(xì)胞團(tuán)塊影響測序。.2應(yīng)選擇合適的濾器孔徑，宜比樣本的最大細(xì)胞直徑稍大。.3應(yīng)選擇合適的細(xì)胞過濾器，以最大限度地減少樣本細(xì)胞數(shù)量的損失，特別是小體積懸浮液。細(xì)胞群懸液制備完成后，宜置于冰上保存，30min內(nèi)用于下一步驟。若冷凍保存，應(yīng)進(jìn)行分裝，避免多次凍融，并保存于液氮或一80℃。進(jìn)行下一步前應(yīng)重新評估細(xì)胞群懸液質(zhì)量。7.2.3單細(xì)胞分離應(yīng)根據(jù)研究目的、樣本類型、文庫構(gòu)建方式、測序方法和分析方案等，選擇合適的單細(xì)胞分離方法。常用的單細(xì)胞分離方法包括：——梯度稀釋法：梯度稀釋細(xì)胞懸液至每孔一個細(xì)胞；——口吸移液法：用玻璃毛細(xì)管分離單細(xì)胞；——自動顯微操作法：使用自動微量移液管分離單細(xì)胞；——激光顯微切割法：用激光從組織切片中分離單細(xì)胞；——流式細(xì)胞分選技術(shù)：使用電荷分離含有單細(xì)胞的微滴；7——微流控系統(tǒng)法：采用微流控芯片分離流動槽中單細(xì)胞；——微液滴平臺法：利用微液滴制備裝置將單細(xì)胞分離到微液滴中；——微孔法：通過芯片中的微孔捕獲單細(xì)胞；——組合法：多種方法結(jié)合。8質(zhì)量驗證8.1應(yīng)在完成細(xì)胞清洗和過濾后，通過細(xì)胞活率、細(xì)胞碎片或聚集情況、細(xì)胞濃度的檢測來確定細(xì)胞群懸液制備是否成功。8.2細(xì)胞存活率宜采用臺盼藍(lán)染色法，通過手動計數(shù)或自動細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行檢測。手動計數(shù)檢測細(xì)胞存活率參考附錄C;自動計數(shù)儀檢測細(xì)胞存活率根據(jù)儀器檢測說明書進(jìn)行。復(fù)蘇后的細(xì)胞活率宜不低于80%,細(xì)胞濃度宜為700個/μL～1200個/μL。特殊樣本應(yīng)根據(jù)實際樣本類型和狀態(tài)確定具體的質(zhì)量控制要求。8.3應(yīng)在顯微鏡下對細(xì)胞群懸液進(jìn)行目視檢查，以快速識別可能會使下游步驟變得復(fù)雜的碎片、細(xì)胞雙聯(lián)體和細(xì)胞聚集物。懸液背景應(yīng)干凈，無大量碎片及雜質(zhì)，粘連細(xì)胞的比例宜不超過10%。8.4可采用細(xì)胞計數(shù)設(shè)備(如血球計數(shù)器或自動細(xì)胞計數(shù)儀)對細(xì)胞群懸液進(jìn)行準(zhǔn)確的細(xì)胞計數(shù)。8.5可采用流式細(xì)胞術(shù)、自動細(xì)胞計數(shù)儀等同時評估多種指標(biāo)，包括細(xì)胞大小、活率和雙聯(lián)體或聚集物比例。此外，還可將抗體標(biāo)記作為分析的一部分，評估是否存在目標(biāo)細(xì)胞群及其比例是否適當(dāng)。注：流式細(xì)胞術(shù)指對懸液中的單細(xì)胞或其他生物粒子，通過檢測標(biāo)記的熒光信號，實現(xiàn)高速、逐一的細(xì)胞定量分析和分選的技術(shù)。8(資料性)組織細(xì)胞酶解法常用的組織細(xì)胞酶解法見表A.1。表A.1組織細(xì)胞酶解方法組織類型消化酶酶解溫度/℃酶解濃度肝臟膠原酶IV0.16mg/mL肺中性蛋白酶和彈性蛋白酶0.33U/mL和3U/mL皮膚胰蛋白酶脾臟消化道中性蛋白酶0.4mg/mL胰腺胰蛋白酶腎臟低嗜熱菌蛋白酶(LiberaseTL)視網(wǎng)膜木瓜蛋白酶9(資料性)細(xì)胞群富集方法常用的細(xì)胞群富集方法及其描述見表B.1。表B.1細(xì)胞群富集方法方法描述離心通過密度梯度離心，根據(jù)細(xì)胞大小、形狀或密度，富集目標(biāo)細(xì)胞群磁珠通過磁珠結(jié)合抗體的陽性/陰性篩選，富集目標(biāo)細(xì)胞群流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)通過熒光基團(tuán)/熒光素結(jié)合抗體的陽性/陰性篩選，富集目標(biāo)細(xì)胞群微流體細(xì)胞分選利用基于熒光基團(tuán)/熒光素結(jié)合抗體的陽性/陰性篩選的低壓微流體，富集目標(biāo)細(xì)胞群(資料性)臺盼藍(lán)染色操作流程C.1儀器顯微鏡。C.2試劑耗材0.4%臺盼藍(lán)染液、生理鹽水、玻片、蓋玻片、滴管、細(xì)胞計數(shù)板。C.3檢測步驟C.3.1對于懸浮細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，充分清洗后，用適當(dāng)緩沖液(如PBS)重懸制成單細(xì)胞懸液；對于貼壁細(xì)胞，先用胰酶消化細(xì)胞，再按照懸浮細(xì)胞的方法制備成單細(xì)胞懸液。C.3.2取0.5mL單細(xì)胞懸液，按照1:1比例與0.5mL濃度為0.4%的臺盼藍(lán)染色液充分混勻，室溫染色3min～10min。注2:若細(xì)胞密度比較高，可取0.2mL單細(xì)胞懸液，經(jīng)適當(dāng)緩沖液稀釋到0.5mL,再用0.5mL濃度為0.4%的臺盼C.3.3取少量上述染色細(xì)胞加入自動細(xì)胞計數(shù)儀，計算著色細(xì)胞(即損傷細(xì)胞和死細(xì)胞)和總細(xì)胞。C.3.4細(xì)胞數(shù)目的計算見式(C.1)和式(C.2)。