(高清版)GBT 40141-2021 榆韌皮部壞死植原體檢疫鑒定方法

ICSCCS65.020.01榆韌皮部壞死植原體檢疫鑒定方法國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會IGB/T40141—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由全國植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC271)提出并歸口。推廣服務(wù)中心。GB/T40141—2021榆韌皮部壞死植原體檢疫鑒定方法本文件描述了榆韌皮部壞死植原體的檢疫和鑒定方法。本文件適用于進出境榆樹苗木及接穗中榆韌皮部壞死植原體的檢疫和鑒定。本文件沒有規(guī)范性引用文件。3.1以耐熱DNA聚合酶和一對引物(與待測目標(biāo)核酸分子序列同源的DNA片段)通過高溫(DNA分子變性)和低溫(引物和目標(biāo)核酸分子復(fù)性并被耐熱DNA聚合酶延伸)交替循環(huán)擴增待測目標(biāo)核酸分3.2榆韌皮部壞死植原體的其他信息見附錄A。5方法原理該病害主要危害榆樹，依靠帶病苗木進行遠(yuǎn)距離傳播。其生物學(xué)特性和16S基因序列等分子生物學(xué)信息是該檢疫鑒定方法的依據(jù)。16SrDNA相對保守，通過植原體通用引物R16F2/R16R2即可擴增獲得植原體16SrDNA序列。6儀器設(shè)備和主要試劑—2GB/T40141—20216.2主要試劑7.2DNA提取7.3通用引物進行PCR擴增并測序利用植原體通用巢式引物R16mF1/R16mR1/R16F2/R16R2進行PCR擴增并測序，具體步驟應(yīng)符合附錄B。7.4虛擬RFLP指紋圖譜檢測利用iPhyclassifier在線分析軟件或DNA-FPCluster軟件對7.3測得的植原體16SrDNA序列進行虛擬RFLP指紋圖譜檢測，具體步驟應(yīng)符合附錄C。8結(jié)果判定表現(xiàn)癥狀與附錄A描述一致可初步判定懷疑感染榆韌皮部壞死植原體，但需通過7.3、7.4進一步檢測。在7.3檢測中，若PCR產(chǎn)物凝膠電泳出現(xiàn)1200bp左右條帶，可初步判定感染榆韌皮部壞死植原體，經(jīng)克隆測序及分析比對后，若與B.6中序列相似性大于97.5%,則可判定該樣品攜帶榆韌皮部壞死植原體。在7.4檢測中，將測得的植原體16SrDNA序列經(jīng)17種限制性內(nèi)切酶RFLP指紋圖分析，若RFLP9樣品及檢測結(jié)果保存樣品經(jīng)登記和經(jīng)手人簽字后妥善保存。對檢出榆韌皮部壞死植原體的樣品應(yīng)保存于-70℃冰箱員和審核人員簽字。PCR凝膠電泳檢測需有電泳結(jié)果照片，需保存DNA序列和RFLP圖譜。3(資料性)榆韌皮部壞死植原體其他信息A.1名稱與分類地位分類地位：細(xì)菌界(Bacteria),厚壁菌門(Firmicutes),柔膜菌綱(Mollicutes),非固醇菌原體目Phytoplasma),16SrV植原體組A.2寄主植物該病害只能為害榆屬的種類，主要包括美國本地的美國榆(Ulmusamericana),紅榆(U.rubra),U.alata,U.serotina和U.crassifolia,嫁接試驗表明該病害還能為害歐亞地區(qū)的UU.minor.U.laevis和A.3地理分布亞州)。A.4傳播介體A.5形態(tài)學(xué)特性植原體寄生于植物韌皮部的篩管內(nèi)，形態(tài)大小約500nm～1000nm,并能夠通過細(xì)菌濾器，不具有A.6為害情況受榆樹韌皮部壞死植原體為害的植物根部組織大量增生肥大，組織纖維化并出現(xiàn)大量的根部壞死。這是植株感病后出現(xiàn)的最初癥狀，但是這種癥狀在地上部分出現(xiàn)明顯的癥狀之前是很難觀測到的。韌4皮部壞死的外部癥狀是有很大差異的。在美國北部，病害引起的第一次落葉一般發(fā)生在7月中旬至9月中旬，落葉中有發(fā)黃的葉片，有頂部的和未成熟的葉片。一般來講，感病植株所有枝條都會立即顯癥。有時候癥狀只會在植株某幾個枝條上出現(xiàn)并擴散，而其他的枝條保持正常。但更多時候，枝條上的所有葉片都變成淡黃綠色到黃色。在生長季節(jié)的晚期，感病植株上的葉片呈現(xiàn)出一種比預(yù)期時間早的外觀。這種黃化以及外觀比起那些由于生長在巖石地區(qū)缺少肥料所引起的癥狀是完全不同的。顯出生長晚期癥狀的感病植株有可能在下個生長季節(jié)不能夠正常抽芽或者生長，最后導(dǎo)致死亡。A.7癥狀特征在早春，感病植株顯示出的外部癥狀主要是不能夠正常產(chǎn)生葉片，或者產(chǎn)生一些最后萎蔫變黃甚至脫落的小葉。春末的時候，那些正常生長出葉片的植株一般會迅速萎蔫死亡，褐色干枯的葉片有可能在這些已死的葉片上附著幾個星期。盛夏季節(jié)植株通常會枯萎，但是這種情況一年四季都有可能發(fā)生。落葉前，病株的樹干和根部韌皮部會形成黃褐色斑塊。在一些巨大的樹干上會形成一些垂直融合的巨大斑塊。病株的形成層和木質(zhì)部的表面也可能形成一些變色斑塊，但是這些斑塊一般不大于1mm。如果在莖干表皮能夠明顯看到大塊的黑色斑塊，說明植株同時被感染荷蘭榆樹病和榆樹韌皮部壞死病。暴露出來的病株韌皮部比健康植株更容易氧化褐變。紅榆(U.rubra)、美國榆(U.americana)、榔榆(U.parvifolia)感病癥狀見圖A.1～圖A.5。圖A.1感病紅榆(U.rubra)葉片變黃癥狀圖A.2感病美國榆(U.americana)整株黃化癥狀圖A.3感病美國榆(U.americana)葉片黃化癥狀6GB/T40141—2021圖A.4感病榔榆(U.parvifolia)叢枝癥狀圖A.5感病美國榆(U.americana)韌皮部壞死癥狀7(規(guī)范性)PCR擴增與測序分析B.1巢式引物序列植原體通用引物：R16mF1:5'-CATGCAAGTCGAACGGA-3'R16mR1:5'-CTTAACCCCAATCATCGA-R16F2:5'-ACGACTGCTGCTAAGACTGG-3'R16R2:5'-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3′B.2PCR反應(yīng)體系2×PCRmix混合液12.5μL,DNA模板2μL,雙蒸水11.5μL。取第一輪擴增產(chǎn)物1μL,稀釋10倍，取稀釋產(chǎn)物2μL為模板，進行第二輪擴增，反應(yīng)體系同上。B.3陰性對照、陽性對照和空白對照的設(shè)置陰性對照：以健康的榆樹葉片DNA為模板。陽性對照：采用感病榆樹葉片DNA為模板。空白對照：雙蒸水。B.4PCR的反應(yīng)參數(shù)第一對引物R16mF1/R16mR1:94℃預(yù)變性10min;94℃變性30s,52℃退火45s,72℃延伸1min,35個循環(huán)后于72℃保溫10min。第二對引物R16F2/R16R2:94℃預(yù)變性10min;94℃變性30s,52℃退火45s,72℃延伸1min,35個循環(huán)后于72℃保溫10min,4℃冰箱中保存。B.5瓊脂糖凝膠電泳制備2%的瓊脂糖凝膠，以DNA儀觀察并記錄結(jié)果。Marker作為分子量標(biāo)記，進行電泳分析，電泳結(jié)束后在凝膠成像B.6序列測定分析當(dāng)瓊脂糖凝膠電泳顯示在1200bp左右有條帶，對該條帶進行克隆測序，并與GenBank中的登錄號為FJ436792.1(CandidatusPhytoplasmaulmi16SribosomalRNAgene,partialsequence長度1248bp)進行序列比對。虛擬RFLP指紋圖譜分析利用iPhyclassifier在線分析軟件或DNA-FPCluster軟件將測得的植原體16SrDNA序列DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)選用Invitrogen25bpDNALadder,瓊脂糖凝膠濃度為3%,最小片段選為泳道2——AluI;泳道4——BfaI;泳道6——DraI;泳道7——EcoRI;泳道8——HaeⅢ;泳道9——HhaI;泳道10——HinfI;泳道12——HpaⅡ;泳道13—--KpnI;泳道16——RsaI;泳道18——TagI;圖C.1榆韌皮部壞死植原體虛擬RFLP指紋圖譜89GB/T40141—2021[1]Lee,I.-M.,Martini,M.,Marcone,C.,etal.Classificationofphytoplasmastrainsintheelmyellowsgroup(16SrV)andproposalof‘CandidatusPhytoplasmaulmi'forthephytoplasmaassociat-edwithelmyellows.InternationalJournalofSystematic&.EvolutionaryMicrobiology,2004,54(Pt2):337-347.[2]Zhao,Y.,Wei,W.,Lee,I.-M.,etal.Constructionofaninteractiveonlinephytoplasmaclassi-