新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范 第12部分：藥物體外抗病毒效果測定

DB32/T3762.12-2021I新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范第12部分：藥物體外抗病毒效果測定范圍本文件規(guī)定了新型冠狀病毒藥物體外抗病毒效果測定環(huán)境與設(shè)施、設(shè)備與耗材、試劑與材料、技術(shù)要求、操作步驟和清場與消毒。本文件適用于新型冠狀病毒藥物體外抗病毒效果測定。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）適用于本文件。DB32/T3762.3新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范第3部分：核酸熒光PCR檢測程序新型冠狀病毒實驗室生物安全指南中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會醫(yī)療機(jī)構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。細(xì)胞病變效應(yīng)cytopathiceffect，CPE病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)大量增殖，導(dǎo)致細(xì)胞病變甚至死亡的現(xiàn)象。大多數(shù)病毒感染敏感細(xì)胞培養(yǎng)都能引起其顯微鏡下表現(xiàn)的改變，如細(xì)胞聚集成團(tuán)腫大圓縮脫落及細(xì)胞融合成為多核細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)包涵體，乃至細(xì)胞裂解等。感染復(fù)數(shù)multiplicityofinfection，MOI感染時病毒和細(xì)胞數(shù)量的比值。半最大效應(yīng)濃度half-maximaleffectiveconcentration，EC50能引起50%最大效應(yīng)的藥物濃度。半數(shù)細(xì)胞毒性濃度Half-cytotoxicconcentration，CC50對半數(shù)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用的藥物濃度。最大無毒濃度maximalatoxicconcentration，TC0不引起細(xì)胞毒性的最大藥物濃度選擇指數(shù)selectivityindex，SI為判斷藥物效果的安全范圍，SI=CC50/EC50，選擇指數(shù)越大，藥物的安全范圍越大。環(huán)境與設(shè)施實驗室資質(zhì)及級別要求應(yīng)符合《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南》的要求，病毒培養(yǎng)包括病毒的分離、培養(yǎng)、滴定等實驗操作應(yīng)當(dāng)在生物安全三級實驗室（BSL-3）的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。使用病毒培養(yǎng)物提取核酸，裂解劑或滅活劑的加入必須在與病毒培養(yǎng)等同級別的實驗室和防護(hù)條件下進(jìn)行，裂解劑或滅活劑加入后可比照未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的防護(hù)等級進(jìn)行操作。實驗室開展相關(guān)活動前，應(yīng)當(dāng)報經(jīng)國家衛(wèi)生健康委批準(zhǔn)，取得開展相應(yīng)活動的資質(zhì)。病毒核酸熒光PCR檢測程序可參照DB32/T3762.3進(jìn)行。操作人員資質(zhì)及防護(hù)要求實驗操作人員應(yīng)經(jīng)過生物安全培訓(xùn)，操作活病毒人員應(yīng)取得BSL-3實驗室進(jìn)入資質(zhì)和相關(guān)實驗活動上崗證。操作人員在健康狀態(tài)良好的情況下經(jīng)實驗室主任批準(zhǔn)后方可開展活動，應(yīng)根據(jù)《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南》要求，按照BSL-3個人防護(hù)的要求進(jìn)行防護(hù)。設(shè)備與耗材設(shè)備生物安全柜、倒置顯微鏡、渦旋振蕩器、水浴或金屬浴、冰箱、CO2培養(yǎng)箱、離心機(jī)、核酸提取儀、熒光定量PCR儀、微量移液器等。耗材N95及以上防護(hù)口罩、醫(yī)用無紡布帽、護(hù)目鏡、醫(yī)用防護(hù)服、一次性PE手套、一次性手術(shù)衣、乳膠手套、防水靴套、帶濾芯Tip頭、一次性平皿、EP管、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、96孔PCR反應(yīng)板等。試劑與材料試劑Hanks溶液（每毫升含青霉素、鏈霉素各2000單位）DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）。DMEM維持液（含2%胎牛血清）。消化液（0.25%胰酶和0.025%EDTA-Na2混合液）。核酸提取試劑盒。新型冠狀病毒熒光PCR檢測試劑盒。材料新型冠狀病毒培養(yǎng)物。待檢藥物和陽性對照藥物（瑞德西韋）。非洲綠猴腎傳代細(xì)胞（VERO-E6）。技術(shù)要求病毒滴度質(zhì)控：確定實驗室質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的新型冠狀病毒毒株滴度，應(yīng)至少有三次獨立的滴度水平測定結(jié)果。效果指標(biāo)選擇：藥物體外抗病毒效果可通過觀察病毒致CPE、細(xì)胞活性染色、病毒噬斑減少試驗、病毒抗原測定、病毒核酸測定等方法來判斷，本文件通過病毒核酸測定來評價藥物體外抗病毒效果。毒性測定方法：藥物對細(xì)胞的毒性測定可根據(jù)藥物特點選用細(xì)胞病變觀察或細(xì)胞活性染色（中性紅、MTT或CCK-8等染色后測OD值）的方法進(jìn)行。預(yù)處理要求：如果待測藥物是中藥煎劑，必須進(jìn)行無菌過濾以去處藥液沉渣，以免影響結(jié)果觀察。操作步驟藥物對細(xì)胞的毒性測定將實驗所需細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板中置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至單層，覆蓋度80%左右，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液。待檢藥物稀釋：將待檢藥物用細(xì)胞培養(yǎng)液做倍比稀釋，使其稀釋度分別為原液（選定濃度）、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128，1:256，1:512，每完成一個一稀釋度必須更換吸頭，每個稀釋度溶液需要反復(fù)吹打混勻。分別取200μl不同稀釋倍數(shù)的待檢藥物及相同條件稀釋的藥物溶劑（如DMSO）滴加于細(xì)胞培養(yǎng)孔中，每一稀釋度接種4孔，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。結(jié)果觀察：顯微鏡下逐日觀察并記錄CPE結(jié)果，直至藥物對細(xì)胞的毒性不再繼續(xù)進(jìn)展時判定結(jié)果，計算待檢藥物的最大無毒濃度（TC0）和半數(shù)細(xì)胞毒性濃度（CC50）。藥物抗病毒效果測定將實驗所需細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板中置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至單層，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液。待檢藥物稀釋：將待檢藥物選用最大無毒濃度，用DMEM維持液做倍比稀釋，使其稀釋度分別為原液（最大無毒濃度）、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128，每完成一個一稀釋度必須更換吸頭，每個稀釋度溶液需要反復(fù)吹打混勻。陽性對照藥物稀釋：將陽性對照藥物（瑞德西韋）從10μM原始濃度開始，按照和待檢藥物相同的稀釋方法進(jìn)行倍比稀釋。分別取50μl不同稀釋倍數(shù)的待檢藥物或陽性對照藥物滴加于細(xì)胞培養(yǎng)孔中，每一稀釋度接種3孔，同時設(shè)立病毒對照（不加藥物）和細(xì)胞對照（不加藥物、不加病毒），置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h。將藥物預(yù)處理后的細(xì)胞、病毒、藥物、試劑和耗材一次性帶入BSL-3核心區(qū)。在待檢藥物組、陽性對照藥物組和病毒對照組的細(xì)胞孔中加入新型冠狀病毒（2μl/孔，0.02MOI），置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)吸附1h。棄培養(yǎng)上清，以Hanks液洗滌細(xì)胞2次后加入含有對應(yīng)不同濃度藥物的DMEM維持液，病毒對照組和細(xì)胞對照組加不含藥物的DMEM維持液，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。病毒滅活與核酸提取：培養(yǎng)結(jié)束后，在倒置顯微鏡下觀察CPE，并記錄結(jié)果；將培養(yǎng)上清加入核酸提取試劑的裂解液中，混勻后按照核酸提取試劑盒和核酸提取儀操作說明進(jìn)行核酸提取。核酸檢測：參照DB32/T3762.3進(jìn)行。結(jié)果計算：根據(jù)核酸檢測獲得的CT值，計算不同藥物濃度下病毒被藥物抑制的百分比（%），計算公式為（1-2-△CT）×100％（其中△CT=待檢藥物組CT值-病毒對照組CT值）。以病毒被抑制的百分比為縱坐標(biāo)，藥物濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，進(jìn)行Logistic曲線擬合（四參數(shù)），計算待檢藥物和陽性對照藥物的EC50值，進(jìn)一步計算待檢藥物的選擇指數(shù)SI（CC50/EC50）。質(zhì)控要求及結(jié)果分析：正常細(xì)胞對照孔應(yīng)該有完整的細(xì)胞單層，病毒對照孔應(yīng)出現(xiàn)CPE變化，原始濃度的陽性對照藥物能夠阻止CPE的產(chǎn)生。通過比較待檢藥物和陽性對照藥物的EC50值，結(jié)合待檢藥物的SI值，評估其體外抗病毒效果。清場與消毒操作結(jié)束后，及時清理生物安全柜內(nèi)的物品，用75％乙醇擦拭外表面后，移出生物安全柜。將實驗過程產(chǎn)生的所有污染材料經(jīng)121℃，30min高壓消毒滅菌處