《基于mRNA-LNP技術(shù)的（細(xì)胞）免疫治療產(chǎn)品開(kāi)發(fā)指南》征求意見(jiàn)稿

1T/FDSAXXXX—202X基于mRNA-LNP技術(shù)的（細(xì)胞）免疫治療產(chǎn)品開(kāi)發(fā)指南本文件適用于基于mRNA-LNP技術(shù)的（細(xì)胞）免疫治療產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的全流程和相關(guān)質(zhì)量管理，包括mRNA-LNP制備及質(zhì)量控制、工程化免疫細(xì)胞制備及質(zhì)量控制、功能驗(yàn)證，以及物料管理、生產(chǎn)環(huán)境、生產(chǎn)設(shè)備、人員管理等須遵循的基本要求和原則，旨在幫助研究機(jī)構(gòu)更好地利用mRNA-LNP技術(shù)開(kāi)發(fā)細(xì)胞免疫治療產(chǎn)品。本文件適用于科研機(jī)構(gòu)、生產(chǎn)企業(yè)基于mRNA-LNP技術(shù)開(kāi)發(fā)CAR-T或CAR-NK細(xì)胞等免疫治療產(chǎn)品的全過(guò)程。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成對(duì)本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T29022粒度分析動(dòng)態(tài)光散射法GB/T42398細(xì)胞培養(yǎng)潔凈室設(shè)計(jì)技術(shù)規(guī)范GB50457醫(yī)藥工業(yè)潔凈廠房設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)JGJ91科研建筑設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)ISO17867粒度分析-小角度X射線散射[Particlesizeanalysis—SmallangleX-rayscattering（SAXS）]中華人民共和國(guó)藥典（簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）國(guó)家藥包材標(biāo)準(zhǔn)免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）細(xì)胞制品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則體外基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）基因修飾細(xì)胞治療產(chǎn)品非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）體細(xì)胞臨床研究工作指引（試行）藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范脂質(zhì)體藥物非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究指導(dǎo)原則新藥用輔料非臨床安全性評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則藥物刺激性、過(guò)敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則藥品包裝材料與藥物相容性試驗(yàn)指導(dǎo)原則醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)開(kāi)展研究者發(fā)起的臨床研究管理辦法藥物臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范中華人民共和國(guó)人類(lèi)遺傳資源管理?xiàng)l例化學(xué)藥品與彈性體密封件相容性研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）化學(xué)藥品注射劑與塑料包裝材料相容性研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）化學(xué)藥品注射劑與藥用玻璃包裝容器相容性研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）化學(xué)藥品注射劑生產(chǎn)所用的塑料組件系統(tǒng)相容性研究技術(shù)指南（試行）國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）E6（GoodClinicalPractice）2T/FDSAXXXX—202X來(lái)源于人或動(dòng)物細(xì)胞系的生物技術(shù)產(chǎn)品的病毒安全性評(píng)價(jià)（ViralSafetyEvaluationofBiotechnologyProductsDerivedfromCellLinesofHumanorAnimalOrigin）美國(guó)藥典（TheUnitedStatesPharmacopoeia）3術(shù)語(yǔ)和定義3.1信使核糖核酸（mRNA）MessengerRNAmRNA是由DNA的一條鏈作為模板轉(zhuǎn)錄而來(lái)的單鏈核糖核酸，攜帶遺傳信息能指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的一類(lèi)單鏈核糖核酸。在細(xì)胞內(nèi)，mRNA通過(guò)與核糖體結(jié)合，并在tRNA（轉(zhuǎn)運(yùn)RNA）的幫助下，翻譯成多肽鏈，進(jìn)而形成蛋白質(zhì)。mRNA在基因表達(dá)過(guò)程中起著承上啟下的作用，它從DNA傳遞遺傳信息，指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，從而控制生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育和功能。3.2自擴(kuò)增核糖核酸（saRNA）Self-amplifyingRNA自擴(kuò)增RNA是一種能夠以自身序列為模板，進(jìn)行自我擴(kuò)增的線性mRNA。saRNA主要衍生于甲病毒基因組，通過(guò)替換病毒結(jié)構(gòu)蛋白的編碼基因序列編碼來(lái)構(gòu)建。因此，saRNA保持了源于RNA病毒載體的自復(fù)制活性，在進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后可以像病毒一樣，能夠利用宿主細(xì)胞進(jìn)行自我復(fù)制，并指示細(xì)胞持續(xù)制造治療性蛋白質(zhì)來(lái)發(fā)揮作用。3.3環(huán)狀RNA（circRNA）circularRNA一類(lèi)單鏈閉合的RNA分子，由mRNA前體通過(guò)可變剪接產(chǎn)生，與傳統(tǒng)的線性RNA不同，circRNA分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶影響，表達(dá)更穩(wěn)定，不易降解。3.4體外轉(zhuǎn)錄Invitrotranscription主要是以質(zhì)粒DNA為模板通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄得到RNA，常用的是以線性化質(zhì)粒DNA或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板利用RNA聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄合成。3.5PIE（PermutedIntron-Exon）系統(tǒng)一種將mRNA合成環(huán)狀RNA的系統(tǒng)。通過(guò)序列設(shè)計(jì)將天然的內(nèi)含子、外顯子反向剪切而形成新的內(nèi)含子-外顯子構(gòu)建體，可以在構(gòu)建體中間插入目的序列，這個(gè)構(gòu)建體為PIE系統(tǒng)。3.6超濾ultrafiltration一項(xiàng)膜分離技術(shù)，主要以壓力為動(dòng)力，將大分子與小分子進(jìn)行分離，常用于溶液中溶劑的置換，樣品的純化等。3.73T/FDSAXXXX—202XRNAR酶RNaseR具有催化功能的小分子RNA，屬于生物催化劑。RNaseR能消化線性RNA（LinearRNA），但不能消化環(huán)狀RNA（CircularRNA，circRNA）、套索RNA（LariatRNA）、3’突出末端少于7個(gè)核苷酸的雙鏈RNA以及具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的tRNA、5SRNA等。3.8脂質(zhì)納米顆粒（LNP）lipidnanoparticle是一種由多個(gè)脂質(zhì)成分構(gòu)建的納米級(jí)載體。它通常由可電離脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)、膽固醇和PEG化脂質(zhì)組成。3.9聚合物分散性指數(shù)（PDI）polydispersityindex一種描述顆粒尺寸分布均勻程度的參數(shù)。PDI的值越小，顆粒尺寸分布越均勻；反之，PDI的值越大，顆粒尺寸分布越不均勻。3.10佐劑adjuvant與抗原同時(shí)或預(yù)先注射，可非特異性地增強(qiáng)或改變機(jī)體對(duì)抗原免疫應(yīng)答的物質(zhì)，稱為佐劑。3.11微流控microfluidic使用微管道（尺寸為數(shù)十到數(shù)百微米）處理或操縱微小流體（體積為納升到阿升）。3.12氮磷比（N/P）nitrogenphosphorusratio基于陽(yáng)離子胺氮（在陽(yáng)離子脂質(zhì)中）和核酸中磷酸基團(tuán)濃度計(jì)算正負(fù)電荷之比。3.13跨膜壓（TMP）transmembranepressure純化系統(tǒng)中跨越透析膜兩側(cè)的壓力差。3.14免疫原性immunogenicity能引起免疫應(yīng)答的性能，即抗原能刺激特定的免疫細(xì)胞，使免疫細(xì)胞活化、增殖、分化，最終產(chǎn)生免疫效應(yīng)物質(zhì)抗體和致敏淋巴細(xì)胞的特性。3.15轉(zhuǎn)錄Transcription是遺傳信息從DNA流向RNA的過(guò)程。即以雙鏈DNA中的確定的一條鏈（模板鏈用于轉(zhuǎn)錄，編碼鏈不用于轉(zhuǎn)錄）為模板，以A、U、C、G四種核糖核苷酸為原料，在RNA聚合酶催化下合成RNA的過(guò)程。3.164T/FDSAXXXX—202X質(zhì)粒plasmid一類(lèi)存在于細(xì)菌和真菌細(xì)胞中獨(dú)立于染色體DNA而自主復(fù)制的共價(jià)、閉合、環(huán)狀DNA分子，通常攜帶一定數(shù)量的基因，是基因工程最常見(jiàn)的載體。3.17外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）peripheralbloodmononuclearcell血液中具有單個(gè)核的細(xì)胞，主要包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和少量其他細(xì)胞類(lèi)型。3.18核糖核酸酶（RNase）ribonuclease水解核糖核酸（RNA）中磷酸二酯鍵，生成寡核苷酸或單核苷酸的核酸酶。3.19脫氧核糖核酸酶（DNase）deoxyribonuclease水解脫氧核糖核酸（DNA）中磷酸二酯鍵，生成寡核苷酸或單核苷酸的核酸酶。3.20STR分析shorttandemrepeatSTR分型檢測(cè)是一種用于檢測(cè)人類(lèi)及哺乳動(dòng)物的基因組。3.21T細(xì)胞T-lymphocyteT淋巴細(xì)胞來(lái)源于骨髓的多功能干細(xì)胞（胚胎期則來(lái)源于卵黃囊和肝）。在人體胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干細(xì)胞或前T細(xì)胞遷移到胸腺內(nèi)，在胸腺激素的誘導(dǎo)下分化成熟，成為具有免疫活性的T細(xì)胞。3.22感受態(tài)細(xì)胞competentcell理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞，吸收周?chē)h(huán)境中的DNA分子，使其處于最適攝取和容納外來(lái)DNA的生理狀態(tài)。3.23核苷酸nucleotide核苷酸是一類(lèi)由嘌呤堿或嘧啶堿、核糖或脫氧核糖以及磷酸三種物質(zhì)組成的化合物，又稱核甙酸。3.24自然殺傷細(xì)胞（NK）naturalkillercell自然殺傷細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，而且在某些情況下參與超敏反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生，能夠識(shí)別靶細(xì)胞、殺傷介質(zhì)。3.25原液Bulk5T/FDSAXXXX—202X指用于制造最終配制物（Fillalformulation）或半成品（FinalBulk）的均一物質(zhì)。4縮略語(yǔ)3’UTR：3′非翻譯區(qū)（3’Un-translatedregion）5’UTR：5′非翻譯區(qū)（5’Un-translatedregion）ATP：腺嘌呤核苷三磷酸（adenosinetriphosphate）CAR：嵌合抗原受體（ChimericAntigenReceptor）CAR-T：嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimericantigenreceptorTcell）CAR-NK：嵌合抗原受體NK細(xì)胞（chimericantigenreceptorNKcell）CAR-qPCR：測(cè)定CAR部分的qPCR方法（CARQuantitativePCR）CD3+：分化抗原簇3（ClusterofDifferentiation3）CD4+：分化抗原簇4（ClusterofDifferentiation4）CD8+：分化抗原簇8（ClusterofDifferentiation8）CRS：細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokinereleasesyndrome）DLT：劑量限制性毒性（Doselimitingtoxicity）DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyriboNucleicAcid）ddPCR：微滴式數(shù)字PCR（DropletDigitalPCR）dsRNA：雙鏈核糖核酸（double-strandedRNA）ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linkedimmunosorbentassay）FACS：流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry）FOB：功能觀察試驗(yàn)組合（FunctionalObservationBattery）GTP：鳥(niǎo)苷三磷酸（Guanosinetriphosphate）HHV：人類(lèi)皰疹病毒（Humanherpesvirus）HPLC：高效液相色譜法（HighPerformanceLiquidChromatography）HPLC-CAD：高效的高效液相色譜-電霧式檢測(cè)器（high-performanceliquidchromatography-diodearraydetection）HLA：人類(lèi)白細(xì)胞抗原（humanleukocyteantigen）IIT：研究者發(fā)起的臨床試驗(yàn)（Investigator-InitiatedClinicalTrial）IL-2：白細(xì)胞介素-2（interleukin2）IL-4：白細(xì)胞介素-4（interleukin4）IL-6：白細(xì)胞介素-6（interleukin6）IL-10：白細(xì)胞介素-10（interleukin10）INF-γ：干擾素γ（Interferongamma）IVT：體外轉(zhuǎn)錄（Invitrotranscription）IST：藥企發(fā)起的臨床試驗(yàn)（Industry-SponsoredClinicalTrial）mRNA：信使RNA（MessagerRNA）mRNAseq：轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（mRNAsequencing）nickedRNA：circRNA的開(kāi)環(huán)異構(gòu)體NAT：核酸擴(kuò)增檢測(cè)法（nucleicacidamplificationtest）NTP：核苷三磷酸（Nucleosidetriphosphate）PBMC：外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheralbloodmononuclearcell）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）Poly（A）：聚腺嘌呤（Polyadenine）6T/FDSAXXXX—202XRT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄PCR（ReverseTranscriptionPCR）preRNA：前體RNA（precursorRNA）qPCR：定量PCR（QuantitativePCR）RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）SAXS：X射線小角散射（small-anglex-rayscattering）TNF-α：腫瘤壞死因子-α（TumorNecrosisFactor）5mRNA-LNP制備及質(zhì)量控制5.1模板質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)與合成5.1.1mRNA模板質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)與合成線性mRNA模板質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)與合成.1DNA轉(zhuǎn)錄模板設(shè)計(jì)宜包括：a）目的基因。宜分別闡述其序列來(lái)源、基因和氨基酸序列、共翻譯機(jī)制，以及在疾病預(yù)防或治療中的作用；b）功能性元件的設(shè)計(jì)及確認(rèn)研究結(jié)果。功能性元件的設(shè)計(jì)宜包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的選擇，帽子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，5’UTR和3’UTR的設(shè)計(jì)，信號(hào)肽和蛋白標(biāo)簽的設(shè)計(jì)（如有Poly（A）加尾結(jié)構(gòu)及長(zhǎng)度設(shè)計(jì)，線性化位點(diǎn)選擇，所用核苷三磷酸（NTP）類(lèi)型及其修飾信息等。.2若對(duì)編碼目的蛋白的mRNA序列進(jìn)行了任何修飾、序列優(yōu)化（如密碼子優(yōu)化等宜保留修飾或序列優(yōu)化的依據(jù)與目的（如提高mRNA翻譯效率、降低模板合成難度、降低先天免疫原性、增加穩(wěn)定性等）。宜保留修飾或優(yōu)化后的序列示意圖等，并對(duì)序列修飾或優(yōu)化的利弊進(jìn)行權(quán)衡分析，保留確認(rèn)的支持性研究結(jié)果。自復(fù)制mRNA模板質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)與合成.1使用自復(fù)制mRNA載體來(lái)表達(dá)目的蛋白，除了闡述目的基因外，需保留以下信a）編碼病毒RNA依賴性RNA聚合酶復(fù)合物（復(fù)制子）的序列來(lái)源，并闡述其功能；b）若復(fù)制子序列含有氨基酸突變，闡述突變的依據(jù)和功能變化；c）若自復(fù)制mRNA的加帽序列與病毒天然起始序列不一致，闡述選擇依據(jù)和效果對(duì)d）若病毒復(fù)制子與目的蛋白分別位于不同的mRNA分子上，需額外的控制措施（比如二者長(zhǎng)度、純度、加帽類(lèi)型和摩爾比例）以確保它們的協(xié)同作用，并予以說(shuō)明。.2若對(duì)自復(fù)制mRNA序列進(jìn)行了任何修飾、序列優(yōu)化，宜保留修飾或序列優(yōu)化的依據(jù)與目的。宜保留修飾或優(yōu)化后的序列示意圖等，并對(duì)序列修飾或優(yōu)化的利弊進(jìn)行權(quán)衡分析，保留確認(rèn)的支持性研究結(jié)果。5.1.2circRNA模板質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)與合成序列設(shè)計(jì)策略circRNA成環(huán)策略包括化學(xué)合成法、酶促連接法、Ⅰ型內(nèi)含子自剪接系統(tǒng)、Ⅱ型內(nèi)含子自剪接系統(tǒng)等，宜闡述模板設(shè)計(jì)的環(huán)化方式及成環(huán)原理。目的基因7T/FDSAXXXX—202X.1宜闡述目的基因來(lái)源、基因和氨基酸序列及蛋白結(jié)構(gòu)，及其表達(dá)蛋白在疾病預(yù)防或治療中的作用或作用機(jī)理。.2關(guān)注序列篩選及優(yōu)化過(guò)程，若對(duì)編碼目的基因序列進(jìn)行了任何修飾、序列優(yōu)化或序列改構(gòu)，宜保留修飾或序列優(yōu)化的依據(jù)與目的。宜保留結(jié)構(gòu)示意圖等，宜與數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的相關(guān)序列進(jìn)行序列比對(duì)，并對(duì)基因修飾或序列改構(gòu)的利弊進(jìn)行權(quán)衡分析，保留確認(rèn)的支持性研究結(jié)果。功能性元件.1宜提供功能性元件的設(shè)計(jì)及確認(rèn)研究結(jié)果。功能性元件的設(shè)計(jì)宜包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、自剪切內(nèi)含子的選擇，IRES結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，5’UTR和3’UTR的設(shè)計(jì)，外顯子殘留，Poly（A）加尾結(jié)構(gòu)及長(zhǎng)度設(shè)計(jì)，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯效率相關(guān)元件、選擇性標(biāo)記、復(fù)制起始位點(diǎn)、額外引入的基因序列等的來(lái)源及選擇依據(jù)，明確完整的帶注釋的序列信息。.2宜設(shè)計(jì)合理線性化酶切位點(diǎn)，避免多余序列殘留。.3質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)宜避免使用β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素抗性基因。5.1.3質(zhì)粒載體骨架部分序列設(shè)計(jì)與合成對(duì)質(zhì)粒模板骨架中包含的控制元件和選擇標(biāo)記的序列與來(lái)源進(jìn)行闡述，如：轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、抗生素抗性標(biāo)記、質(zhì)粒復(fù)制子、多克隆位點(diǎn)、線性化位點(diǎn)等。a）宜選擇高拷貝的質(zhì)粒復(fù)制子（如pUC/pBR322），以提升質(zhì)粒產(chǎn)量。b）抗生素使用應(yīng)符合《中國(guó)藥典》的相關(guān)要求，避免使用β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素抗性基因。c）多克隆位點(diǎn)宜包含常見(jiàn)且唯一的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)如HindIII、BamHI、NotI等。d）明確轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子（如T7啟動(dòng)子）及其下游的加帽起始序列。e）明確終止子的序列及其功能。f）宜設(shè)計(jì)合理線性化酶切位點(diǎn)，避免多余序列殘留。5.2模板質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)與合成質(zhì)量控制5.2.1對(duì)轉(zhuǎn)錄模板的控制元件和選擇標(biāo)記的序列與來(lái)源進(jìn)行闡述，如：轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止序列、抗生素抗性標(biāo)記等進(jìn)行分析?？股厥褂脩?yīng)符合《中國(guó)藥典》的相關(guān)要求。5.2.2提供構(gòu)建和制備轉(zhuǎn)錄模板質(zhì)粒的詳細(xì)信息和步驟、鑒定及確證方法。5.2.3宜結(jié)合工程菌種子庫(kù)的檢定對(duì)轉(zhuǎn)錄模板質(zhì)粒進(jìn)行全基因序列分析及確認(rèn)，提供用于生產(chǎn)mRNA或circRNA的轉(zhuǎn)錄模板的全長(zhǎng)核苷酸序列，宜分析轉(zhuǎn)錄模板的控制元件、插入的目的基因序列、選擇標(biāo)記基因有無(wú)變異等。5.2.4質(zhì)粒模板中包含Poly（A）序列，宜通過(guò)測(cè)序等方法確保質(zhì)粒模板中Poly（A）序列的完整性可以滿足下游應(yīng)用。5.3建立種子批系統(tǒng)5.3.1建立種子批的關(guān)鍵起始原材料包括質(zhì)粒DNA和感受態(tài)細(xì)胞，宜有清晰的來(lái)源和完整的溯源信息，對(duì)轉(zhuǎn)錄模板質(zhì)粒宜明確其控制元件和選擇標(biāo)記的序列與來(lái)源，如轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、抗生素抗性標(biāo)記等。5.3.2將合格的目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至適宜的宿主菌，經(jīng)克隆篩選后建立至少兩級(jí)種子批系統(tǒng)，宜避免存在其他細(xì)菌、真菌和噬菌體的污染，以及確保在限定代次內(nèi)具有遺傳穩(wěn)定性。5.3.3原始種子庫(kù)的建立過(guò)程包括模板質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌、單克隆篩選和傳代培養(yǎng)。其中單克隆篩選宜重點(diǎn)關(guān)注模板質(zhì)粒的產(chǎn)量、超螺旋純度、Poly（A）完整性等。5.3.4主種子庫(kù)和工作種子庫(kù)的建立過(guò)程包括種子復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)和分裝凍存。建庫(kù)過(guò)程8T/FDSAXXXX—202X宜遵循《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》要求，確保無(wú)外源因子污染和交叉污染。5.3.5建立種子庫(kù)使用的物優(yōu)先采用風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別較低的物料，如國(guó)家已批準(zhǔn)上市的藥品，藥用級(jí)原輔料，GMP級(jí)物料，宜避免使用人源或動(dòng)物源性物料。5.3.6對(duì)各級(jí)種子庫(kù)，宜明確制備規(guī)模、擴(kuò)增條件、貯存條件等信息。種子庫(kù)標(biāo)簽標(biāo)明菌種編號(hào)、模板質(zhì)粒名稱、代次、批號(hào)、規(guī)格和制備日期等內(nèi)容。5.3.7種子庫(kù)的管理宜遵循《中國(guó)藥典》通則“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理及質(zhì)量控制”的要求。5.4種子庫(kù)檢定和穩(wěn)定性研究5.4.1種子批檢定宜遵循《中國(guó)藥典》通則“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理及質(zhì)量控制”和“人用基因治療制品總論”的要求。5.4.2種子批的檢定項(xiàng)目一般包括菌落形態(tài)、鑒別、染色鏡檢、生化特性、活率、抗生素抗性、電鏡檢查、目的基因和其他元件測(cè)序、限制性酶切圖譜等，種子批宜無(wú)其他細(xì)菌、真菌、噬菌體等污染。5.4.3對(duì)主種子庫(kù)和工作種子庫(kù)進(jìn)行傳代穩(wěn)定性研究，使用模擬或代表實(shí)際生產(chǎn)工藝的條件開(kāi)展傳代穩(wěn)定性研究，種子批的遺傳和表型特征宜能滿足生產(chǎn)需求。5.4.4傳代穩(wěn)定性考察的指標(biāo)一般包括質(zhì)粒序列、質(zhì)粒限制酶切圖譜、質(zhì)粒保有率、質(zhì)?？截悢?shù)、超螺旋純度、Poly（A）完整性等。根據(jù)研究結(jié)果明確種子批的限定傳代代次。限定傳代代次需要覆蓋生產(chǎn)規(guī)模的最大代次。5.4.5宜對(duì)主種子庫(kù)和工作種子庫(kù)開(kāi)展貯存穩(wěn)定性研究，關(guān)注在貯存條件下和時(shí)長(zhǎng)內(nèi)種子庫(kù)的活菌數(shù)和活率等，種子批的貯存穩(wěn)定性宜能滿足生產(chǎn)需求。5.5模板質(zhì)粒制備5.5.1模板質(zhì)粒的制備應(yīng)基于種子庫(kù)系統(tǒng)，一般包括種子庫(kù)復(fù)蘇和擴(kuò)增、發(fā)酵、純化和分裝保存，宜遵循《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》要求，確保無(wú)外源因子污染和交叉污染。宜采取適當(dāng)?shù)拇胧┓乐笵Nase等污染，包括環(huán)境、耗材及原料中的DNase消除和殘留檢測(cè)。5.5.2模板質(zhì)粒的制備過(guò)程中不宜使用人源和動(dòng)物源性材料。5.5.3在發(fā)酵過(guò)程中不宜使用β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素。如需使用其他種類(lèi)的抗生素，如卡那霉素，宜說(shuō)明使用的必要性，并對(duì)模板質(zhì)粒的純化中間體及成品的抗生素殘留量進(jìn)行控制和安全性評(píng)估。5.5.4模板質(zhì)粒的純化工藝單元的設(shè)定宜考慮后續(xù)生產(chǎn)規(guī)模放大的可行性，宜采用可放大的超濾和層析操作單元。5.5.5模板質(zhì)粒的成品分裝規(guī)格宜與后續(xù)的質(zhì)粒DNA線性化規(guī)模相適應(yīng)，宜開(kāi)展儲(chǔ)存穩(wěn)定性研究。5.5.6模板質(zhì)粒的成品標(biāo)簽標(biāo)明質(zhì)粒名稱、貯存條件、批號(hào)、規(guī)格、生產(chǎn)日期等信息。5.6模板質(zhì)粒質(zhì)量控制5.6.1宜建立模板質(zhì)粒質(zhì)量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側(cè)重點(diǎn)選取相應(yīng)的質(zhì)量控制指標(biāo)。特別注意外源因子污染和交叉污染，宜采取適當(dāng)?shù)拇胧┓乐笵Nase等污染，包括環(huán)境、耗材及原料中的DNase消除和殘留檢測(cè)。無(wú)菌可參照《中國(guó)藥典》通則“1101無(wú)菌檢查法”，或選用快速無(wú)菌檢查法如ATP生物發(fā)光法、固相細(xì)胞計(jì)數(shù)、呼吸作用進(jìn)行檢測(cè)。9T/FDSAXXXX—202X細(xì)菌內(nèi)毒素按照《中國(guó)藥典》通則“1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法：凝膠法、光度測(cè)定法”檢測(cè)。外觀可參照《中國(guó)藥典》通則“0901溶液顏色檢查法”、“0902澄清度檢查法”、“0904可見(jiàn)異物檢查法”進(jìn)行檢測(cè)。pH按照《中國(guó)藥典》通則“0631pH值測(cè)定法”檢測(cè)。質(zhì)粒純度（A260/280）按照《中國(guó)藥典》通則“0401紫外-可見(jiàn)分光光度法”檢測(cè)。宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留按照《中國(guó)藥典》通則“3412菌體蛋白質(zhì)殘留量測(cè)定法”檢測(cè)。宿主細(xì)胞DNA殘留量按照《中國(guó)藥典》通則“3407外源性DNA殘留量測(cè)定法”檢測(cè)。宿主細(xì)胞RNA殘留量可參照《中國(guó)藥典》通則“0541電泳法”、“0542毛細(xì)管電泳”，或選用PCR法、熒光毛細(xì)管電泳CE法進(jìn)行檢測(cè)。全序列測(cè)定可參照《中國(guó)藥典》指導(dǎo)原則“9108DNA測(cè)序技術(shù)指導(dǎo)原則”，或選用sanger法進(jìn)行檢測(cè)。0質(zhì)粒濃度（A260）按照《中國(guó)藥典》通則“0401紫外-可見(jiàn)分光光度法”檢測(cè)。1RNase殘留可參照熒光探針?lè)ǎㄔ斠?jiàn)附錄A），或選用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。2限制性內(nèi)切酶鑒別可參照《中國(guó)藥典》通則“0541電泳法”、“0542毛細(xì)管電泳”進(jìn)行檢測(cè)。3Poly（A）完整性可參照《中國(guó)藥典》指導(dǎo)原則“9108DNA測(cè)序技術(shù)指導(dǎo)原則”、“05或選用sanger法進(jìn)行檢測(cè)。4超螺旋比例可參照《中國(guó)藥典》通則“0512高效液相色譜法”、“0513離子色譜法”、“0542毛細(xì)管電泳法”、“3431質(zhì)粒DNA構(gòu)象測(cè)定法”進(jìn)行檢測(cè)。5.6.2質(zhì)量控制指標(biāo)匯總見(jiàn)表1。T/FDSAXXXX—202X表1模板質(zhì)粒質(zhì)量控制指標(biāo)匯總表）；）；- 質(zhì)-《中國(guó)藥典》三部毛細(xì)管電泳（通則0542）----pH5.7質(zhì)粒DNA線性化5.7.1制備流程制備流程：酶切→陰離子交換層析→超濾濃縮→除菌過(guò)濾→分裝。5.7.2模板質(zhì)粒的線性化T/FDSAXXXX—202X模板質(zhì)粒的線性化宜遵循《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》要求，宜使用一次性設(shè)備和耗材，避免外源因子污染和交叉污染。宜采取適當(dāng)?shù)拇胧┓乐笵Nase等污染，包括環(huán)境、耗材及原料中的DNase消除和殘留檢測(cè)。模板質(zhì)粒的線性化過(guò)程宜通過(guò)被確認(rèn)過(guò)的工藝參數(shù)，獲得線性化比例符合質(zhì)量控制要求的線性化DNA。5.7.3線性化質(zhì)粒的純化線性化質(zhì)粒的純化宜遵循《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的要求，明確制造工藝各單元操作，同時(shí)按照經(jīng)過(guò)驗(yàn)證和批準(zhǔn)后的操作規(guī)程的要求進(jìn)行。純化過(guò)程宜建立合理的中間體質(zhì)量控制程序，監(jiān)測(cè)和控制工藝相關(guān)雜質(zhì)，如宿主DNA殘留，宿主蛋白殘留，和宿主RNA殘留。5.7.4線性化質(zhì)粒的分裝在無(wú)菌條件下，使用符合要求的包裝材料對(duì)除菌過(guò)濾后的樣品進(jìn)行分裝，分裝精度、規(guī)格、包材宜經(jīng)過(guò)確認(rèn)和驗(yàn)證。樣品宜儲(chǔ)存在經(jīng)確認(rèn)和驗(yàn)證過(guò)的合適的儲(chǔ)存條件及環(huán)境下。5.8線性化質(zhì)粒DNA原液質(zhì)量控制5.8.1宜建立線性化質(zhì)粒DNA原液質(zhì)量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側(cè)重點(diǎn)選取相應(yīng)的質(zhì)量控制指標(biāo)。細(xì)菌內(nèi)毒素、外觀、pH、A260/A280純度、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留、宿主細(xì)胞DNA殘留量、宿主細(xì)胞RNA殘留、序列測(cè)定、濃度、RNase殘留按照—1檢測(cè)。質(zhì)粒檢查按照《中國(guó)藥典》通則“0541電泳法”檢測(cè)。線性比例可參照《中國(guó)藥典》通則“0512高效液相色譜法”、“0513離子色譜法”、“0542毛細(xì)管電泳法”、“3431質(zhì)粒DNA構(gòu)象測(cè)定法”進(jìn)行檢測(cè)?？偟鞍讱埩艨蓞⒄铡吨袊?guó)藥典》通則“0731蛋白質(zhì)含量測(cè)定法”，或選用熒光法（詳見(jiàn)附錄D）進(jìn)行檢測(cè)。微生物限度按照《中國(guó)藥典》通則“1105非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法”檢測(cè)。5.8.2質(zhì)量控制指標(biāo)匯總見(jiàn)表2。表2線性化質(zhì)粒原液質(zhì)量控制指標(biāo)匯總表T/FDSAXXXX—202XpH）；-量留量--PCR法--定定5.9mRNA合成5.9.1線性mRNA合成mRNA的合成所用原材料遵循《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的要求，根據(jù)物料風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)建立相適應(yīng)的控制措施。mRNA生產(chǎn)過(guò)程需要進(jìn)行原料藥制備，再進(jìn)行制劑的制備，原料藥制備過(guò)程中常使用PCR產(chǎn)物或者質(zhì)粒作為模板，宜制定模板的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。mRNA原料藥和制劑生產(chǎn)過(guò)程遵循《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》要求，宜保證純度以及無(wú)外源因子污染和交叉污染。宜采取適當(dāng)?shù)拇胧┓乐筊Nase等污染，包括環(huán)境、耗材T/FDSAXXXX—202X及原料中的RNase消除和殘留檢測(cè)。研究與優(yōu)化mRNA的關(guān)鍵工藝參數(shù)，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝選取相應(yīng)的關(guān)鍵工藝參數(shù)，關(guān)鍵工藝參數(shù)如下：a）體外轉(zhuǎn)錄工藝中的反應(yīng)體系、RNA聚合酶濃度以及活性標(biāo)準(zhǔn)、帽子類(lèi)似物（共轉(zhuǎn)錄體系）、NTP濃度、轉(zhuǎn)錄時(shí)間、溫度、Mg2+、補(bǔ)料方式、終止反應(yīng)條件等；b）DNA酶處理工藝（如有）中的DNA酶濃度、純度酶活性標(biāo)準(zhǔn)、處理時(shí)間、溫度、補(bǔ)料方式、終止反應(yīng)條件等；c）酶法加帽工藝（如有）宜研究RNA反應(yīng)濃度、加帽反應(yīng)緩沖體系、加帽酶濃度純RNA酶抑制劑、加帽酶等）、補(bǔ)料方式、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等；d）對(duì)加帽類(lèi)型（如有）及不同加帽類(lèi)型的比例進(jìn)行研究，有利于mRNA轉(zhuǎn)錄的5’UTR和3’UTR的選擇和優(yōu)化；e）加Poly（A）尾工藝（如有）宜研究加尾反應(yīng)體系、ATP濃度、加尾酶濃度純度活性標(biāo)準(zhǔn)、反應(yīng)溫度、時(shí)間、補(bǔ)料方式等；f）去磷酸化工藝中（如有）的磷酸酶濃度、反應(yīng)時(shí)間、補(bǔ)料方式等；g）如涉及修飾核苷酸，宜明確被修飾的核苷酸、修飾類(lèi)型、修飾后的純化方法和純度、投料比例等。且在保證不影響mRNA轉(zhuǎn)染的情況下，對(duì)修飾進(jìn)行優(yōu)化，促進(jìn)mRNA的穩(wěn)定性；h）mRNA純化（如有）宜研究純化方式、純化條件、純化后mRNA濃度、純度、完整性、雜質(zhì)殘留等；i）過(guò)濾除菌工藝（如有）宜研究過(guò)濾后mRNA的生物活性；j）mRNA凍干（如有）宜研究?jī)龈煞绞?、凍干條件、分裝方式、凍干復(fù)溶后mRNA濃度質(zhì)量，如濃度、純度、完整性、溶解性、表達(dá)蛋白效力等；5.9.2circRNA合成circRNA合成所用原材料宜遵循《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的要求，根據(jù)物料風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)建立相適應(yīng)的控制措施。DNA模板的質(zhì)量控制應(yīng)當(dāng)符合《中國(guó)藥典》要求，保證無(wú)外源因子污染和交叉污染。宜采取適當(dāng)?shù)拇胧┓乐筊Nase污染。circRNA制備宜明確circRNA環(huán)化方法，包括以下幾種：將線性RNA的首尾連接成環(huán)。b）酶法連接：常用于RNA環(huán)化的酶有3種，T4DNA連接酶1（T4Dnl1）、T4RNA連接酶1（T4Rnl1）和T4RNA連接酶2（T4Rnl2）。c）PIE系統(tǒng)：常用于RNA環(huán)化PIE系統(tǒng)-Ⅰ型內(nèi)含子自剪接、PIE系統(tǒng)-Ⅱ型內(nèi)含子自剪接。宜對(duì)circRNA合成的體外轉(zhuǎn)錄、DNA酶處理、RNA環(huán)化等工藝步驟的關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)行研究與優(yōu)化，以提高產(chǎn)率和效率，對(duì)關(guān)鍵工藝參數(shù)及其控制范圍進(jìn)行確認(rèn)。宜研究與優(yōu)化circRNA合成關(guān)鍵工藝參數(shù)，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝選取相應(yīng)的關(guān)鍵工藝參數(shù)，關(guān)鍵工藝參數(shù)如下：a）體外轉(zhuǎn)錄工藝參數(shù)：RNA聚合酶濃度、NTP濃度、模板濃度、轉(zhuǎn)錄時(shí)間、溫度、Mg2+、終止反應(yīng)條件等；b）DNA酶處理工藝參數(shù)（如有DNA酶濃度、處理時(shí)間、溫度、終止反應(yīng)條件等；T/FDSAXXXX—202Xc）RNA環(huán)化工藝參數(shù)（如有）：IVT產(chǎn)物濃度、溫度、反應(yīng)時(shí)間、GTP濃度、Mg2+濃度、連接酶濃度等；d）如涉及修飾核苷酸，宜明確被修飾的核苷酸、修飾類(lèi)型、修飾后的純化方法和純度、投料比例等。5.10mRNA合成質(zhì)量控制5.10.1線性mRNA合成質(zhì)量控制宜建立mRNA合成質(zhì)量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側(cè)重點(diǎn)選取相應(yīng)的質(zhì)量控制指標(biāo)。.1外觀、pH、細(xì)菌內(nèi)毒素、無(wú)菌按照—檢測(cè)。.2總蛋白殘留可參照《中國(guó)藥典》通則“0731蛋白質(zhì)含量測(cè)定法”，或選用熒光法（詳見(jiàn)附錄D）進(jìn)行檢測(cè)。.3mRNA序列長(zhǎng)度可參照《中國(guó)藥典》通則“0541電泳法”、“0542毛細(xì)管電泳法”進(jìn)行檢測(cè)。.4mRNA純度可參照《中國(guó)藥典》通則“0542毛細(xì)管電泳法”、“0401紫外-可見(jiàn)分光光度法”進(jìn)行檢測(cè)。.5DNA模板殘留量按照《中國(guó)藥典》通則“3407外源性DNA殘留量測(cè)定法”檢測(cè)。.6mRNA含量可參照《中國(guó)藥典》通則“0401紫外-可見(jiàn)分光光度法”，或選用《美國(guó)藥典》“mRNA疫苗質(zhì)量分析方法-指南草案”RiboGreen熒光檢測(cè)法（詳見(jiàn)附錄E或選用“熒光PCR法”、“ddPCR法”進(jìn)行檢測(cè)。.7dsRNA殘留量可參照《中國(guó)藥典》通則“3429免疫化學(xué)法”，或選用《美國(guó)藥典》“mRNA疫苗質(zhì)量分析方法-指南草案”ELISA法（詳見(jiàn)附錄B）進(jìn)行檢測(cè)。.8金屬元素殘留量按照《中國(guó)藥典》通則“0412電感耦合等離子體質(zhì)譜法”檢測(cè)。.9DNase殘留熒光探針?lè)ǎ斠?jiàn)附錄C。.10游離單核苷酸（NTPs）殘留量可參照《中國(guó)藥典》通則“0512高效液相色譜法”、“0431質(zhì)譜法”進(jìn)行檢測(cè)。T/FDSAXXXX—202X.11酶殘留量按照《中國(guó)藥典》通則“3429免疫化學(xué)法”檢測(cè)。.12序列完整性及準(zhǔn)確性（特別是關(guān)鍵元件）可參照《中國(guó)藥典》指導(dǎo)原則“9109標(biāo)準(zhǔn)核酸序列建立指導(dǎo)原則”，或選用mRNAseq法進(jìn)行檢測(cè)。.13有機(jī)溶劑殘留量按照《中國(guó)藥典》通則“3200化學(xué)殘留物測(cè)定法”檢測(cè)。.14帽子類(lèi)似物殘留量按照《中國(guó)藥典》通則“0512高效液相色譜法”檢測(cè)。.15加帽率可參照《中國(guó)藥典》通則“0542毛細(xì)管電泳法”、“0431質(zhì)譜法”、“0512高效液相色譜法”進(jìn)行檢測(cè)。.16ploy（A）尾長(zhǎng)度可參照《中國(guó)藥典》通則“0431質(zhì)譜法”、“0512高效液相色譜法”、“0542毛細(xì)管電泳法”進(jìn)行檢測(cè)。.17表達(dá)成蛋白的能力使用基于細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。.18不完整mRNA按照《中國(guó)藥典》通則“0542毛細(xì)管電泳法”檢測(cè)。.19mRNA聚集體按照《中國(guó)藥典》通則“0541電泳法”初步判斷，“0512高效液相色譜法”、“0514分子排阻色譜法”進(jìn)行檢測(cè)。.20生物負(fù)載量按照《中國(guó)藥典》通則“1105非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法”檢測(cè)。質(zhì)量控制指標(biāo)匯總見(jiàn)表3。表3mRNA合成質(zhì)量控制指標(biāo)匯總表pH0901）、澄清度檢查法（通則0902）、可見(jiàn)異物檢查法（通則0904）T/FDSAXXXX—202X）；性高效液相色譜法（通則0512））；>30%）；＜0.1/%---T/FDSAXXXX—202X量5.10.2circRNA合成質(zhì)量控制宜建立circRNA合成產(chǎn)物質(zhì)量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側(cè)重點(diǎn)根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝選取相應(yīng)的質(zhì)量控制指標(biāo)。.1外觀、pH、細(xì)菌內(nèi)毒素、無(wú)菌按照—檢測(cè)。.2circRNA序列長(zhǎng)度、circRNA純度、總蛋白殘留、DNA模板殘留量、circRNA含量、dsRNA殘留量、金屬元素殘留量、DNase殘留、游離單核苷酸（NTPs）殘留量、酶殘留、序列完整性及準(zhǔn)確性、有機(jī)溶劑殘留量按照.2—.13檢測(cè)。.3preRNA可參照《中國(guó)藥典》通則“0542毛細(xì)管電泳法”檢測(cè)，或使用RT-PCR和特異性引物檢測(cè)preRNA的存在，以評(píng)估轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的效率和精確性。.4內(nèi)含子片段可參照《中國(guó)藥典》通則“0542毛細(xì)管電泳法”檢測(cè)，或采用特異性PCR和電泳技術(shù)檢測(cè)是否有未正確剪接的內(nèi)含子片段，以確保RNA的成熟和功能性。.5nickedRNA可參照《中國(guó)藥典》通則“0542毛細(xì)管電泳法”檢測(cè)，或采用靈敏的電泳分析，識(shí)別和定量可能存在的nickedRNA，以評(píng)估RNA合成過(guò)程中的完整性。.6RNaseR耐受性可參照《中國(guó)藥典》通則“0541電泳法”檢測(cè)，或處理樣品后用RNaseR酶處理，通過(guò)RT-PCR和電泳確認(rèn)circRNA的耐酶性，以驗(yàn)證其環(huán)狀結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性。.7環(huán)化比例可參照《中國(guó)藥典》通則“0542毛細(xì)管電泳法”，或選用qPCR法進(jìn)行檢測(cè)，或通過(guò)RT-PCR結(jié)合特異性引物，定量環(huán)化和非環(huán)化RNA的比例，確保產(chǎn)品的一致性。T/FDSAXXXX—202X.8環(huán)化位點(diǎn)可參照《中國(guó)藥典》指導(dǎo)原則“9109標(biāo)準(zhǔn)核酸序列建立指導(dǎo)原則”檢測(cè)。或逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，按照Sanger法檢測(cè)?；虿捎肦T-PCR結(jié)合測(cè)序技術(shù)定位circRNA的環(huán)化位點(diǎn)，確保環(huán)化的特異性和準(zhǔn)確性。質(zhì)量控制指標(biāo)匯總見(jiàn)表4。表4circRNA體外合成質(zhì)量控制指標(biāo)匯總表pH可見(jiàn)異物檢查法（通則0904）性）；）；）；）；法preRNA）；）；）；）；-T/FDSAXXXX—202X---定定5.11mRNA純化5.11.1線性mRNA純化mRNA純化所用物料宜優(yōu)先采用風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別較低的物料，根據(jù)物料風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)建立相適應(yīng)的控制措施。mRNA純化生產(chǎn)過(guò)程宜遵循《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》要求，保證無(wú)外源因子污染和交叉污染。宜采取適當(dāng)?shù)拇胧┓乐筊Nase污染，包括環(huán)境、耗材及原料中的RNase消除和殘留檢測(cè)。mRNA的純化工藝單元的設(shè)定需要考慮后續(xù)生產(chǎn)規(guī)模放大的可行性，宜采用可放大的超濾和層析操作單元。宜對(duì)mRNA純化工藝參數(shù)（如層析介質(zhì)的選擇、載量、上樣和洗脫溶液條件、超濾膜截留分子量、流速和跨膜壓等）進(jìn)行研究和優(yōu)化，開(kāi)發(fā)穩(wěn)定的純化工藝。宜對(duì)mRNA純化工藝建立相應(yīng)的過(guò)程控制程序，包括純化產(chǎn)物檢測(cè)，如mRNA濃度、mRNA完整性、Poly（A）完整性、產(chǎn)品及工藝相關(guān)雜質(zhì)去除率等，確保mRNA的純度和結(jié)構(gòu)完整性。宜明確mRNA純化工藝中各單元操作的目的，進(jìn)行工藝相關(guān)雜質(zhì)清除研究。純化后mRNA原液的保存溶液和分裝規(guī)格應(yīng)與后續(xù)的LNP制備過(guò)程相適應(yīng)。并開(kāi)展儲(chǔ)存穩(wěn)定性研究，制定合理的儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)和儲(chǔ)存條件。mRNA原液的標(biāo)簽需標(biāo)明mRNA名稱、貯存條件、批號(hào)、規(guī)格、生產(chǎn)日期等信5.11.2circRNA純化circRNA純化所用原材料宜遵循《中國(guó)藥典》“生物制品生產(chǎn)用原材料及輔料質(zhì)T/FDSAXXXX—202X量控制規(guī)程”要求，并根據(jù)物料風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)建立相適應(yīng)的控制措施。circRNA純化生產(chǎn)過(guò)程宜遵循標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程和安全規(guī)范，確保可重復(fù)性和安全性，保證無(wú)外源因子污染和交叉污染。宜采取適當(dāng)?shù)拇胧┓乐筊Nase污染，包括環(huán)境、耗材及原料中的RNase消除和殘留檢測(cè)。circRNA純化工藝單元的設(shè)定需考慮后續(xù)生產(chǎn)規(guī)模放大的可行性，宜采用可放大的超濾和層析操作單元。宜明確circRNA純化工藝中各純化步驟的目的，并研究各純化步驟的雜質(zhì)去除如采用T4連接酶法制備circRNA，所制的circRNA與前體片段大小相同，宜詳細(xì)說(shuō)明其純度的評(píng)估方式。若采用RNaseR消除前體，宜評(píng)估RNaseR對(duì)環(huán)的結(jié)構(gòu)或完整性的影響。宜對(duì)circRNA純化工藝參數(shù)（如層析介質(zhì)的選擇依據(jù)、載量、雜質(zhì)去除率、上樣和洗脫溶液條件、超濾膜截留分子量、流速和跨膜壓、R酶消化等）進(jìn)行研究和優(yōu)化，開(kāi)發(fā)穩(wěn)定的純化工藝。宜對(duì)circRNA純化工藝建立相應(yīng)的過(guò)程控制程序，包括純化產(chǎn)物檢測(cè)，如RNA濃度、RNA完整性、環(huán)化接口驗(yàn)證、circRNA純度、R酶消化、產(chǎn)品及工藝相關(guān)雜質(zhì)去除率等，確保circRNA的純度和結(jié)構(gòu)完整性。circRNA原液成品的溶劑宜與LNP包封過(guò)程中的溶劑相同。0宜對(duì)circRNA原液開(kāi)展穩(wěn)定性研究，以確定合理的儲(chǔ)存條件和時(shí)長(zhǎng)。1circRNA原液的標(biāo)簽需標(biāo)明circRNA名稱、貯存條件、批號(hào)、規(guī)格、生產(chǎn)日期等信息。5.12mRNA原液質(zhì)量控制5.12.1線性mRNA原液質(zhì)量控制宜建立mRNA原液質(zhì)量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側(cè)重點(diǎn)選取相應(yīng)的質(zhì)量控制指標(biāo)。.1外觀、pH、細(xì)菌內(nèi)毒素、無(wú)菌按照—檢測(cè)。.2mRNA純度、DNA模板殘留量、mRNA含量、dsRNA殘留量按照.4—.7檢測(cè)。.3帽子類(lèi)似物殘留量、加帽率、poly（A）尾長(zhǎng)度、目的蛋白表達(dá)按照.13—.16檢測(cè)。.4mRNA測(cè)序可參照《中國(guó)藥典》指導(dǎo)原則“9109標(biāo)準(zhǔn)核酸序列建立指導(dǎo)原則”，或選用sanger法、高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。.5mRNA鑒別按照《中國(guó)藥典》通則“0541電泳法”檢測(cè)。.6A260/A230純度T/FDSAXXXX—202X按照《中國(guó)藥典》通則“0401紫外-可見(jiàn)分光光度法”檢測(cè)。.7NTP殘留（A、G、C、U）按照《中國(guó)藥典》通則“0512高效液相色譜法”檢測(cè)。.8總蛋白殘留可參照《中國(guó)藥典》通則“0731蛋白質(zhì)含量測(cè)定法”，或選用熒光法（詳見(jiàn)附錄D）進(jìn)行檢測(cè)。.9mRNA完整性可參照《中國(guó)藥典》通則“0542毛細(xì)管電泳法”，或選用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。.10工具酶殘留如T7RNA聚合酶按照《中國(guó)藥典》通則“3429免疫化學(xué)法”檢測(cè)。質(zhì)量控制指標(biāo)匯總見(jiàn)表5。表5mRNA原液質(zhì)量控制指標(biāo)匯總表）；ddPCR法-《中國(guó)藥典》第三毛細(xì)管電泳法（通則0542）《中國(guó)藥典》四部毛細(xì)管電泳法（通則0542）-《中國(guó)藥典》四部高效液相色譜法（通則0512）-《中國(guó)藥典》四部毛細(xì)管電泳法（通則0542）-法-《中國(guó)藥典》三部高效液相色譜法（通則0512）T/FDSAXXXX—202X《中國(guó)藥典》三部高效液相色譜法（通則0512）pH《中國(guó)藥典》四部毛細(xì)管電泳法（通則0542）-《中國(guó)藥典》四部高效液相色譜法（通則0512）-5.12.2circRNA原液質(zhì)量控制宜建立circRNA原液質(zhì)量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側(cè)重點(diǎn)選取相應(yīng)的質(zhì)量控制指標(biāo)。.1外觀、PH、細(xì)菌內(nèi)毒素、無(wú)菌按照—檢測(cè)。.2circRNA純度、DNA模板殘留量、circRNA含量、dsRNA殘留量按照.4—.7檢測(cè)。.3preRNA、內(nèi)含子片段、nickedRNA按照3.3—3.5檢測(cè)。.4總蛋白殘留、工具酶殘留如T7RNA聚合酶、序列完整性按照8—.0檢測(cè)。.5circRNA序列長(zhǎng)度按照《中國(guó)藥典》通則“0541電泳法”檢測(cè)。.6環(huán)化接口逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，按照Sanger法檢測(cè)。.7環(huán)化效率T/FDSAXXXX—202X按照《中國(guó)藥典》通則“0542毛細(xì)管電泳法”檢測(cè)。.8磁珠（如適用）可參照原子吸收光譜法（AAS）或感應(yīng)耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）進(jìn)行檢測(cè)。.9有機(jī)溶劑按照《中國(guó)藥典》通則“3200化學(xué)殘留物測(cè)定法”檢測(cè)。.10circRNA體外翻譯活性使用基于細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。.11RaseR耐受性酶按照《中國(guó)藥典》通則“0401紫外-可見(jiàn)分光光度法”檢測(cè)。質(zhì)量控制指標(biāo)匯總見(jiàn)表6。表6circRNA原液質(zhì)量控制指標(biāo)匯總表pH可見(jiàn)異物檢查法（通則0904））；--）；法-preRNA）；-）；）；）；-T/FDSAXXXX—202X--定定5.13脂質(zhì)納米顆粒Mix配方與mRNA包封/裝載及純化5.13.1脂質(zhì)納米顆粒Mix配方脂質(zhì)納米顆粒原材料脂質(zhì)納米顆粒原材料的質(zhì)量可能會(huì)對(duì)終產(chǎn)品RNA（包含mRNA、circRNA、saRNA）-LNP的粒徑與PDI、電荷、包封率、制備及純化工藝、免疫原性及活性產(chǎn)生重要的影響，宜對(duì)脂質(zhì)原材料進(jìn)行充分的篩選和質(zhì)量控制。宜保留LNP各個(gè)脂質(zhì)原材料的選擇依據(jù)、來(lái)源（動(dòng)物源、植物源；全合成、半合成等）、生產(chǎn)用原材料、生產(chǎn)純化工藝、特征鑒定、穩(wěn)定性及雜質(zhì)等研究資料。雜質(zhì)研究可考慮在合成或者生產(chǎn)過(guò)程中引入的有機(jī)溶劑或者重金屬殘留。多組分及（或）佐劑LNP通常由4個(gè)組分組成：可電離脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)（磷脂）、膽固醇和聚乙二醇化脂質(zhì)（PEG脂質(zhì)）；目前國(guó)內(nèi)外部分前沿研究中已經(jīng)出現(xiàn)5組分LNP及（或）佐劑的添加。對(duì)于多出的組分或佐劑，宜重點(diǎn)說(shuō)明添加的原理，確保不會(huì)影響脂質(zhì)納米顆粒關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)，宜保留多出組分或佐劑的安全性數(shù)據(jù)、提高產(chǎn)品藥效性能或穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)等。同時(shí)，鑒于mRNA遞送系統(tǒng)的復(fù)雜性及可能存在的佐劑作用、國(guó)內(nèi)外在研mRNA遞送平臺(tái)的實(shí)際情況，宜參照CDE《新型冠狀病毒預(yù)防用mRNA疫苗藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》指導(dǎo)要求，不建議添加單獨(dú)的佐劑成分。如需添加佐劑，應(yīng)保證添加的佐劑不會(huì)引起不可接受的毒性。臨床前須通過(guò)明確的功能指標(biāo)及試驗(yàn)研究證實(shí)佐劑發(fā)揮的具體的免疫調(diào)節(jié)作用，同時(shí)關(guān)注添加該佐劑成分后可能引入的風(fēng)險(xiǎn)，如，對(duì)mRNA結(jié)構(gòu)、非預(yù)期免疫反應(yīng)及免疫損傷和免疫病理等，對(duì)佐劑添加進(jìn)行全面的藥學(xué)研究。T/FDSAXXXX—202X新型原材料的首次使用遵循國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心《新藥用輔料非臨床安全性評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則》，對(duì)新型脂質(zhì)材料的作用機(jī)制、合成純化工藝、質(zhì)量控制、供應(yīng)商信息、生產(chǎn)批次、安全性、功效性等進(jìn)行充分研究及闡述。原材料的變更不同生產(chǎn)純化工藝、不同供應(yīng)商提供的脂質(zhì)材料，可能會(huì)在純度、雜質(zhì)或其他關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)方面有差異。如脂質(zhì)材料的合成或生產(chǎn)工藝、純化工藝、供應(yīng)商等發(fā)生變更，宜當(dāng)對(duì)變更后的新材料進(jìn)行詳盡的質(zhì)量特性研究，確保變更不會(huì)對(duì)下游工藝及成品產(chǎn)生負(fù)面影響。5.13.2RNA包封/裝載及純化RNA的包封/裝載主要是基于微流控或類(lèi)似技術(shù)，將脂質(zhì)混合物的乙醇溶液RNA酸性溶液快速通過(guò)微流控混合器來(lái)達(dá)到包封的目的。RNA-LNP的純化、換液、濃縮主要采用切向流過(guò)濾，以除去游離的脂質(zhì)分子，RNA，乙醇等。不同的包封及純化工藝、緩沖液體系及其它輔助添加劑可能會(huì)對(duì)RNA-LNP的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)、功效性、免疫原性、穩(wěn)定性產(chǎn)生重要影響。宜提交相關(guān)資料，說(shuō)明包封/裝載及純化工藝步驟的合理性以及工藝參數(shù)控制范圍的合理性?？刹捎妹荛]式的生產(chǎn)工藝，以減少生產(chǎn)過(guò)程中的暴露環(huán)節(jié)和儲(chǔ)存環(huán)節(jié)。生產(chǎn)過(guò)程中中間產(chǎn)物如需儲(chǔ)存，宜開(kāi)展穩(wěn)定性研究和相關(guān)驗(yàn)證研究，明確儲(chǔ)存條件、儲(chǔ)存方式a）包封設(shè)備及耗材如采用微流控包封設(shè)備來(lái)制備RNA-LNP，宜說(shuō)明包封設(shè)備的混合原理、包封設(shè)備接觸原液的管路的材料種類(lèi)和性質(zhì)。LNP包封過(guò)程中，通常是在乙醇和酸性緩沖液共存的條件下混合制備，如果包封設(shè)備的管路表面為非生物兼容性材料，宜關(guān)注包封設(shè)備管路表面是否被腐蝕破壞，制備產(chǎn)品是否被污染。微流控芯片推薦使用GMP/FDA認(rèn)可的衛(wèi)生級(jí)金屬材質(zhì)，如316L。對(duì)于使用塑料材料為微流控芯片的LNP包封生產(chǎn)工藝，應(yīng)當(dāng)按照國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心發(fā)布的《化學(xué)藥品注射劑生產(chǎn)所用的塑料組件系統(tǒng)相容性研究技術(shù)指南（試行）》相關(guān)要求，基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及必要的相容性研究，確認(rèn)上述塑料芯片組件系統(tǒng)的適用性。對(duì)于微流控芯片的質(zhì)量，應(yīng)當(dāng)建立合理的測(cè)試方案和指標(biāo)，確認(rèn)不同批次微流控芯片間的質(zhì)量穩(wěn)定性，以及重復(fù)使用芯片每次生產(chǎn)時(shí)的芯片質(zhì)量一致性。生產(chǎn)過(guò)程中設(shè)備應(yīng)對(duì)此相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行連鎖監(jiān)控，以確保設(shè)備在良好的狀態(tài)下穩(wěn)定生產(chǎn)。微流控包封設(shè)備的輸送泵、芯片、閥門(mén)、管道管件等部件應(yīng)當(dāng)可以進(jìn)行CIP，以確保所有接觸物料的部分均符合LNP生產(chǎn)的GMP要求。微流控包封設(shè)備的所有部件（包括芯片）應(yīng)當(dāng)能夠滿足高流速制備工藝產(chǎn)生的系統(tǒng)壓力（如≥10MPa的壓力），不宜因承壓不足而限制單個(gè)芯片或單組包封系統(tǒng)的混合流速（生產(chǎn)效率）。生產(chǎn)過(guò)程中使用的耗材和容器，如一次性儲(chǔ)液袋、移液管路、膜包等，宜具有穩(wěn)定的物理和化學(xué)特性，耗材與直接接觸的溶液、生產(chǎn)中間產(chǎn)物等宜有良好的相容性，需結(jié)合耗材的材質(zhì)、使用階段、供應(yīng)商提供的研究資料等對(duì)其評(píng)估或研究。b）包封/裝載工藝參數(shù)包封過(guò)程中，關(guān)鍵工藝參數(shù)包括：各個(gè)脂質(zhì)原材料的摩爾比例、濃度，RNA的濃度，脂質(zhì)與RNA的投料比例（或氮磷比），緩沖液的鹽離子種類(lèi)、濃度及pH值的；包封混合過(guò)程中的流速、混合壓力、包封前后廢液體積等。采用抗體偶聯(lián)的LNP，宜考慮制劑過(guò)程中的參數(shù)與物質(zhì)對(duì)抗體活性的影響。T/FDSAXXXX—202Xc）純化工藝參數(shù)純化過(guò)程中，關(guān)鍵工藝參數(shù)包括：純化替換緩沖液的鹽離子種類(lèi)、濃度、pH、跨膜壓、流速、中空纖維柱截留分子量、剪切力、除菌過(guò)濾等。5.14納米顆粒質(zhì)量控制脂質(zhì)納米顆粒相關(guān)的性能指標(biāo)包括粒徑及分布、電荷、載藥濃度與包封率等，建議結(jié)合納米顆粒的制備工藝以及對(duì)下游工序與成品的影響程度，對(duì)粒徑及分布、Zeta電位、RNA濃度及包封率、各個(gè)脂質(zhì)組分的含量、溶劑殘留等進(jìn)行分析研究，并考慮是否作為生產(chǎn)過(guò)程控制的一部分或中間產(chǎn)物建立質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。在選擇質(zhì)量控制方法時(shí)，應(yīng)關(guān)注擬表征的質(zhì)量屬性與擬采用的檢測(cè)方法之間的契合度，保證方法的適用性。5.15mRNA-LNP制劑處方以及工藝5.15.1制備工藝整體需求制備工藝需要在符合潔凈要求的生產(chǎn)車(chē)間進(jìn)行。宜明確mRNA-LNP制造工藝各單元操作要求，按照經(jīng)過(guò)驗(yàn)證和批準(zhǔn)后的操作規(guī)程的要求進(jìn)行，并有相關(guān)記錄。工藝設(shè)備符合計(jì)量、確認(rèn)、驗(yàn)證等要求。避免出現(xiàn)偏離工藝規(guī)程的偏差，如果出現(xiàn)偏差，宜采取必要措施進(jìn)行糾正。生產(chǎn)前后宜進(jìn)行清場(chǎng)和設(shè)備的清潔，避免產(chǎn)品間的交叉污染。制備工藝：a）液體制劑：IVT-mRNA原液→mRNA-LNP脂質(zhì)包封→超濾濃縮/換液→除菌過(guò)濾→DP制劑灌裝；b）凍干制劑：IVT-mRNA原液→mRNA-LNP脂質(zhì)包封→超濾濃縮/換液→除菌過(guò)濾→制劑灌裝→凍干→軋蓋。5.15.2mRNA-LNP脂質(zhì)包封明確脂質(zhì)組分配比，同時(shí)做好各LNP脂質(zhì)的質(zhì)量控制工作。包封過(guò)程中使用的混合芯片及管路宜使用一次性消耗品，包封設(shè)備在使用前后要進(jìn)行清潔和檢測(cè)。5.15.3mRNA-LNP純化mRNA-LNP的純化宜去除包封工藝過(guò)程中產(chǎn)生的雜質(zhì)乙醇，將其殘留控制在合理的范圍之內(nèi)。mRNA-LNP的純化過(guò)程宜建立合理的中間體質(zhì)量控制程序，檢測(cè)和控制LNP的粒徑、包封率、mRNA的質(zhì)量參數(shù)等。5.15.4mRNA-LNP制劑成品分裝mRNA-LNP制劑成品在無(wú)菌條件下進(jìn)行分裝，分裝精度、規(guī)格、包材宜經(jīng)過(guò)確認(rèn)和驗(yàn)證。制劑成品分裝宜建立批號(hào)管理程序。每批制劑批號(hào)唯一，并建立出入庫(kù)登記制度。制劑成品宜儲(chǔ)存在經(jīng)驗(yàn)證和確認(rèn)過(guò)的合適的儲(chǔ)存條件及環(huán)境下。5.15.5circRNA-LNP成品分裝成品制劑需按照《藥品包裝材料與藥物相容性試驗(yàn)指導(dǎo)原則》《國(guó)家藥包材標(biāo)準(zhǔn)》原則T/FDSAXXXX—202X開(kāi)展包材相容性研究。5.15.6mRNA/cirRNA制劑凍干工藝mRNA/cirRNA制劑在無(wú)菌條件下進(jìn)行灌裝，以半壓塞的形式轉(zhuǎn)移至凍干機(jī)的凍干倉(cāng)，用已驗(yàn)證過(guò)的凍干工藝對(duì)樣本實(shí)施凍干處理，其中含水率宜≤3.0%。凍干制劑儲(chǔ)存于經(jīng)驗(yàn)證和確認(rèn)的儲(chǔ)存條件和環(huán)境下，儲(chǔ)存溫度宜控制在2℃至8℃。5.15.7mRNA-LNP中間品質(zhì)量控制宜建立mRNA-LNP中間品質(zhì)量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側(cè)重點(diǎn)選取相應(yīng)的質(zhì)量控制指標(biāo)。.1外觀可參照《中國(guó)藥典》通則“0901溶液顏色檢查法”、“0902澄清度檢查法”、“0904可見(jiàn)異物檢查法”進(jìn)行檢測(cè)。.2微生物限度按照《中國(guó)藥典》通則“1105非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法”檢測(cè)。.3mRNA含量可參照《中國(guó)藥典》通則“0401紫外-可見(jiàn)分光光度法”，或選用《美國(guó)藥典》“mRNA疫苗質(zhì)量分析方法-指南草案”RiboGreen熒光檢測(cè)法（詳見(jiàn)附錄E或選用“熒光PCR法”、“ddPCR法”進(jìn)行檢測(cè)。.4包封率可參照《中國(guó)藥典》指導(dǎo)原則“9014微粒制劑指導(dǎo)原則”，或選用《美國(guó)藥典》“mRNA疫苗質(zhì)量分析方法-指南草案”RiboGreen熒光檢測(cè)法（詳見(jiàn)附錄E）進(jìn)行檢測(cè)。.5粒徑、PDI可參照《納米藥物質(zhì)量控制研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》選取采用動(dòng)態(tài)光散射法（DLS）（詳見(jiàn)附錄F），或采用顯微成像技術(shù)[如透射電鏡（TEM）、掃描電鏡（SEM）和原子力顯微鏡（AFM）]、納米顆粒跟蹤分析系統(tǒng)（NTA）、小角X射線散射（SAXS）和小角中子散射（SANS）等也可提供納米藥物粒徑大小的信息。其中，SAXS對(duì)納米顆粒粒徑的表征方法可參考國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)發(fā)布的ISO17867“ParticlesizeanalysisSmallangleX-rayScattering（SAXS）”。.6Zeta電位可參照《納米藥物質(zhì)量控制研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》選取采用相分析動(dòng)態(tài)光散射法（PALS）（詳見(jiàn)附錄F），電泳光散射法（ELS）或可調(diào)電阻脈沖感應(yīng)技術(shù)（TRPS）等。質(zhì)量控制指標(biāo)匯總見(jiàn)表7。表7mRNA-LNP中間品質(zhì)量控制指標(biāo)匯總表T/FDSAXXXX—202X可見(jiàn)異物檢查法（通則0904）動(dòng)態(tài)光散射法、小角X射線散射標(biāo)）；）；5.16mRNA-LNP成品質(zhì)量控制5.16.1mRNA-LNP成品質(zhì)量控制宜建立mRNA-LNP成品質(zhì)量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側(cè)重點(diǎn)選取相應(yīng)的質(zhì)量控制指標(biāo)。.1外觀、pH、細(xì)菌內(nèi)毒素、無(wú)菌按照—檢測(cè)。.2粒徑、PDI、Zeta電位按照.5—.6檢測(cè)。.3平均粒徑可參考《納米藥物質(zhì)量控制研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》選取采用動(dòng)態(tài)光散射法（DLS按照GB/T29022粒度分析動(dòng)態(tài)光散射法獲得平均流體動(dòng)力學(xué)粒徑。或參考國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)發(fā)布的ISO17867“ParticlesizeanalysisSmallangleX-rayScattering（SAXS）”。.4mRNA序列可參照《中國(guó)藥典》指導(dǎo)原則“9108DNA測(cè)序技術(shù)指導(dǎo)原則”，或選用sanger法進(jìn)行檢測(cè)。.5mRNA含量可參照《中國(guó)藥典》通則“0401紫外-可見(jiàn)分光光度法”，或選用《美國(guó)藥典》“mRNA疫苗質(zhì)量分析方法-指南草案”RiboGreen熒光檢測(cè)法（詳見(jiàn)附錄E或選用“熒光PCR法”、“ddPCR法”進(jìn)行檢測(cè)。.6包封率可參照《中國(guó)藥典》指導(dǎo)原則“9014微粒制劑指導(dǎo)原則”，或選用《美國(guó)藥典》“mRNA疫苗質(zhì)量分析方法-指南草案”RiboGreen熒光檢測(cè)法（詳見(jiàn)附錄E）進(jìn)行檢測(cè)。.7dsRNA殘留量T/FDSAXXXX—202X可參照《中國(guó)藥典》通則“3429免疫化學(xué)法”，或選用《美國(guó)藥典》“mRNA疫苗質(zhì)量分析方法-指南草案”ELSA法（詳見(jiàn)附錄C）進(jìn)行檢測(cè)。.8加帽率可參照《中國(guó)藥典》通則“0542毛細(xì)管電泳法”、“0431質(zhì)譜法”檢測(cè)、“0512高效液相色譜法”進(jìn)行檢測(cè)。.9可見(jiàn)異物按照《中國(guó)藥典》通則“0904可見(jiàn)異物檢查法”檢測(cè)。.10不溶性微粒按照《中國(guó)藥典》通則“0903不溶性微粒檢查法”檢測(cè)。.11裝量/裝量差異按照《中國(guó)藥典》通則“0102注射劑”、“0942最低裝量檢查法”檢測(cè)。.12水分（劑型：凍干粉）按照《中國(guó)藥典》通則“0832水分測(cè)定法-費(fèi)休氏法”檢測(cè)。.13滲透壓摩爾濃度按照《中國(guó)藥典》通則“0632滲透壓摩爾濃度測(cè)定法”檢測(cè)。.14遞送系統(tǒng)組分含量可參照《中國(guó)藥典》通則“0512高效液相色譜法”，或參考《美國(guó)藥典》“mRNA疫苗質(zhì)量分析方法-指南草案”使用HPLC-CAD法進(jìn)行檢測(cè)。.15截短序列RNA按照《中國(guó)藥典》通則“0542毛細(xì)管電泳法”檢測(cè)。.16加帽不完全的mRNA可參照《中國(guó)藥典》通則“0542毛細(xì)管電泳法”、“0431質(zhì)譜法”進(jìn)行檢測(cè)。.17去磷酸不完全的mRNA按照《中國(guó)藥典》通則“0512高效液相色譜法”檢測(cè)。.18修飾過(guò)度的mRNA按照《中國(guó)藥典》通則“0512高效液相色譜法”檢測(cè)。.19乙醇?xì)埩舭凑铡吨袊?guó)藥典》通則“0521氣相色譜法”檢測(cè)。.20異常毒性按照《中國(guó)藥典》通則“1141異常毒性檢查法”檢測(cè)。.21蛋白翻譯功能T/FDSAXXXX—202X可參照ELISA、FACS、WesternBlot進(jìn)行檢測(cè)。質(zhì)量控制指標(biāo)匯總見(jiàn)表8。表8mRNA-LNP成品質(zhì)量控制指標(biāo)匯總表法動(dòng)態(tài)光散射法、小角X射線散射動(dòng)態(tài)光散射法、小角X射線散射pH《中國(guó)藥典》三部溶液顏色檢查法（通則0901）、澄清度檢查法（通則0902）、可見(jiàn)異物檢查法（通度《中國(guó)藥典》四部可見(jiàn)異物檢查法（通則0904）《中國(guó)藥典》四部不溶性微粒檢查法（通則0903）《中國(guó)藥典》四部注射劑（通則0102）-《中國(guó)藥典》三部最低裝量檢查法（通則0942）-）；《中國(guó)藥典》三部毛細(xì)管電泳法（通則0542）列法《中國(guó)藥典》三部高效液相色譜法（通則0512）、T/FDSAXXXX—202X《中國(guó)藥典》四部毛細(xì)管電泳法（通則0542）《中國(guó)藥典》四部質(zhì)譜法（通則0431）-《中國(guó)藥典》四部高效液相色譜法（通則0512）-《中國(guó)藥典》三部高效液相色譜法（通則0512）《中國(guó)藥典》三部高效液相色譜法（通則0512）《中國(guó)藥典》四部氣相色譜法（通則0521）5.16.2circRNA-LNP成品質(zhì)量控制宜建立circRNA-LNP成品質(zhì)量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側(cè)重點(diǎn)選取相應(yīng)的質(zhì)量控制指標(biāo)。.1外觀、pH、細(xì)菌內(nèi)毒素、無(wú)菌按照—檢測(cè)。.2粒徑、PDI、Zeta電位按照.5—.6檢測(cè)。.3微生物限度按照《中國(guó)藥典》通則“1105非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法”檢測(cè)。.4滲透壓按照《中國(guó)藥典》通則“0632滲透壓摩爾濃度測(cè)定法”檢測(cè)。.5RNA序列可參照《中國(guó)藥典》指導(dǎo)原則“9108DNA測(cè)序技術(shù)指導(dǎo)原則”，或選用sanger法進(jìn)行檢測(cè)。.6mRNA含量可參照《中國(guó)藥典》通則“0401紫外-可見(jiàn)分光光度法”，或選用《美國(guó)藥典》“mRNA疫苗質(zhì)量分析方法-指南草案”RiboGreen熒光檢測(cè)法（詳見(jiàn)附錄E或選用“熒光PCR法”、“ddPCR法”進(jìn)行檢測(cè)。.7包封率可參照《中國(guó)藥典》指導(dǎo)原則“9014微粒制劑指導(dǎo)原則”，或選用《美國(guó)藥典》“mRNA疫苗質(zhì)量分析方法-指南草案”RiboGreen熒光檢測(cè)法（詳見(jiàn)附錄E）進(jìn)行檢測(cè)。.8靶蛋白的表達(dá)T/FDSAXXXX—202X可參照《中國(guó)藥典》通則“3401免疫印跡法”，或參考《美國(guó)藥典》“mRNA疫苗質(zhì)量分析方法-指南草案”采用基于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，或選用流式細(xì)胞法、PCR法進(jìn)行檢測(cè)。.9各個(gè)脂質(zhì)組分的含量可參照《中國(guó)藥典》通則“0512高效液相色譜法”，或參考《美國(guó)藥典》“mRNA疫苗質(zhì)量分析方法-指南草案”使用HPLC-CAD法進(jìn)行檢測(cè)。.10RNA濃度按照《中國(guó)藥典》通則“0401紫外-可見(jiàn)分光光度法”檢測(cè)。.11體內(nèi)效力動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。質(zhì)量控制指標(biāo)匯總見(jiàn)表9。表9circRNA-LNP成品質(zhì)量控制指標(biāo)匯總表）；量）；ddPCR法）；動(dòng)態(tài)光散射法、小角X射線散射pH性流式細(xì)胞法、PCR法-T/FDSAXXXX—202X6工程化免疫細(xì)胞制備及質(zhì)量控制6.1供者細(xì)胞的獲取、收集與運(yùn)輸6.1.1應(yīng)選擇依法取得《醫(yī)療機(jī)構(gòu)執(zhí)業(yè)許可證》資質(zhì)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行采集。開(kāi)展細(xì)胞采集人員需有相應(yīng)經(jīng)驗(yàn)并獲得《醫(yī)師執(zhí)業(yè)許可證》等資質(zhì)。6.1.2細(xì)胞來(lái)源宜符合《中華人民共和國(guó)人類(lèi)遺傳資源管理?xiàng)l例》的要求，且經(jīng)過(guò)醫(yī)療機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并建立“知情與保密”管理體系。6.1.3宜根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)建立供者篩選標(biāo)準(zhǔn)，如供者的基本信息，包括但不限于年齡、性別、既往已知的用藥情況和輻射暴露、既往病史、家族史、病原微生物篩查信息、HLA分型信息、血型、血常規(guī)檢測(cè)等。6.1.4病原微生物的篩查宜包括以下幾項(xiàng)：人類(lèi)免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋體等感染、人巨細(xì)胞病毒、人EB病毒、人類(lèi)嗜T淋巴細(xì)胞病毒。6.1.5實(shí)施采集操作的環(huán)境宜能保證采集細(xì)胞的微生物安全性，避免交叉污染或混淆風(fēng)險(xiǎn)。宜優(yōu)先使用基于一次性耗材的全自動(dòng)細(xì)胞采集機(jī)進(jìn)行單采血。6.1.6傳染性病毒陽(yáng)性患者的細(xì)胞采集應(yīng)該在陽(yáng)性樣本制備區(qū)進(jìn)行。6.1.7宜對(duì)采集的細(xì)胞確定適宜的保存條件、運(yùn)輸方式和時(shí)間，制定相應(yīng)操作規(guī)范。6.1.8應(yīng)當(dāng)建立產(chǎn)品標(biāo)識(shí)和追溯系統(tǒng)，確保在供者材料運(yùn)輸、接收以及產(chǎn)品生產(chǎn)和使用全過(guò)程中，來(lái)源于不同供者的產(chǎn)品不會(huì)發(fā)生混淆、差錯(cuò)，確保供者材料或細(xì)胞與患者之間的匹配性，且可以追溯。6.2供者細(xì)胞收集質(zhì)量控制6.2.1免疫細(xì)胞治療指人自體或異體來(lái)源的免疫細(xì)胞經(jīng)體外操作后回輸人體，用于疾病預(yù)防或治療的臨床研究和臨床應(yīng)用。宜建立供者細(xì)胞收集質(zhì)量控制要求。外觀細(xì)胞懸液清晰透明，細(xì)胞分布均勻，無(wú)明顯的細(xì)胞團(tuán)聚現(xiàn)象。包裝完整性包裝應(yīng)當(dāng)完整無(wú)損壞。細(xì)胞的數(shù)量及活率熒光計(jì)數(shù)法，詳見(jiàn)附錄G。細(xì)胞類(lèi)型及表型流式細(xì)胞法，詳見(jiàn)附錄H。無(wú)菌可參照《中國(guó)藥典》通則“1101無(wú)菌檢查法”，或選用快速無(wú)菌檢查法如ATP生物發(fā)光T/FDSAXXXX—202X法、固相細(xì)胞計(jì)數(shù)、呼吸作用進(jìn)行檢測(cè)。支原體可參照《中國(guó)藥典》通則“3301支原體檢查法”，或《美國(guó)藥典》<63>使用經(jīng)驗(yàn)證的NAT法（詳見(jiàn)附錄I）或酶學(xué)方法作為補(bǔ)充?；蚪M內(nèi)整合型病毒（如HHV特定亞型等）按照《中國(guó)藥典》通則“3302外源病毒因子檢查法”檢測(cè)。6.2.2質(zhì)量控制指標(biāo)匯總見(jiàn)表10。表10供者細(xì)胞收集質(zhì)量控制指標(biāo)匯總表>80%）；）；6.2.3供者細(xì)胞收集后處理：a）宜對(duì)質(zhì)量控制后合格的細(xì)胞進(jìn)行凍存或其他后續(xù)處理。b）對(duì)于質(zhì)量控制不合格的細(xì)胞，應(yīng)當(dāng)重新取樣。6.3T/NK細(xì)胞分選與激活6.3.1T/NK細(xì)胞分選與激活宜遵循《免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》。分選和激活采用的磁珠、包被抗體、磁珠抗體、細(xì)胞因子要有明確的來(lái)源及批號(hào)、要有質(zhì)量檢定合格報(bào)告和無(wú)TSE/BSE聲明。6.3.2免疫細(xì)胞培養(yǎng)及生產(chǎn)過(guò)程宜全程避免使用動(dòng)物源性材料，盡可能用規(guī)定組成成分的非動(dòng)物源性試劑替代。a）若必須使用動(dòng)物來(lái)源原材料，需要提供相關(guān)的研究資料說(shuō)明使用的必要性和合理性，并針對(duì)原材料的物種來(lái)源、生產(chǎn)地區(qū)、生產(chǎn)工藝建立完整的質(zhì)量控制體系，評(píng)估TSE/BSE安全性風(fēng)險(xiǎn)，并對(duì)終產(chǎn)品中的動(dòng)物源材料殘留量進(jìn)行檢測(cè)及開(kāi)展安全性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。不使用疫病流行區(qū)來(lái)源的動(dòng)物血清及未經(jīng)過(guò)安全性驗(yàn)證的血清非常重要。b）若生產(chǎn)過(guò)程使用自體血清或自體血漿，宜說(shuō)明血清/血漿的生產(chǎn)工藝，并對(duì)包裝、存放條件和時(shí)間等進(jìn)行研究。c）若使用同種異體血清，其使用的原則與安全性風(fēng)險(xiǎn)控制要求參考6.3.2a動(dòng)物來(lái)源原材料的要求，使用中重點(diǎn)關(guān)注人源外源因子的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控和不同來(lái)源、不同批次血清質(zhì)量差異可能對(duì)產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程產(chǎn)生的影響。T/FDSAXXXX—202Xd）人源性材料（如白蛋白、免疫球蛋白等）可以參考血液制品的質(zhì)量要求和檢測(cè)方法。6.3.3宜根據(jù)工藝要求，對(duì)單采血進(jìn)行分離PBMC，然后再進(jìn)一步確定是否分選特定T/NK細(xì)胞，也可以直接對(duì)單采血進(jìn)行特定T/NK細(xì)胞的分選。宜監(jiān)測(cè)分選后的特定T/NK細(xì)胞的比例，并建立控制標(biāo)準(zhǔn)。6.3.4轉(zhuǎn)染前宜對(duì)T/NK細(xì)胞進(jìn)行激活。激活后宜監(jiān)測(cè)活細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞活率、細(xì)胞直徑和活化標(biāo)志物。6.3.5若使用滋養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增NK的方式，宜對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行殘留研究，并對(duì)采用滋養(yǎng)細(xì)胞所產(chǎn)NK細(xì)胞進(jìn)行體外成瘤性、體內(nèi)成瘤性和致瘤性等安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)。若使用動(dòng)物源性滋養(yǎng)層細(xì)胞，需進(jìn)行滋養(yǎng)層細(xì)胞相關(guān)特定動(dòng)物源性病毒的全面檢測(cè)。6.4mRNA-LNP轉(zhuǎn)染T/NK細(xì)胞及CAR-T/NK細(xì)胞擴(kuò)增6.4.1mRNA-LNP轉(zhuǎn)染T/NK細(xì)胞操作宜遵循《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》《免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》的基本原則和相關(guān)要求，宜特別關(guān)注：mRNA-LNP轉(zhuǎn)染T/NK等免疫細(xì)胞的方法和條件、細(xì)胞生長(zhǎng)特性的變化、細(xì)胞的表型和/或基因型的變化、細(xì)胞功能的變化、目的細(xì)胞群和非目的細(xì)胞群的比例變化等進(jìn)行研究和驗(yàn)證，并不斷優(yōu)化。6.4.2在采用mRNA-LNP轉(zhuǎn)染T/NK等免疫細(xì)胞時(shí)，宜根據(jù)mRNA-LNP成品包封率檢測(cè)結(jié)果中mRNA濃度(μg/mL），進(jìn)行不同梯度的mRNA轉(zhuǎn)染量摸索，同步研究mRNA-LNP轉(zhuǎn)染前后T/NK等目的細(xì)胞群的活率、純度、密度及其擴(kuò)增倍數(shù)等影響因素，對(duì)mRNA-LNP轉(zhuǎn)染量的選擇及合理性、目的基因的表達(dá)/轉(zhuǎn)染效率等進(jìn)行研究和驗(yàn)證，并持續(xù)優(yōu)化。6.4.3不同細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)之間的差異可能是多種因素共同作用的結(jié)果，包括物理?xiàng)l件、氧氣水平、代謝狀態(tài)、細(xì)胞因子使用和刺激條件、自動(dòng)化程度，以及細(xì)胞產(chǎn)品的數(shù)量和質(zhì)量。這些因素共同決定了最終CAR-T/NK細(xì)胞產(chǎn)品的表型、功能和臨床應(yīng)用潛力。因此CAR-T/NK細(xì)胞擴(kuò)增過(guò)程中，宜對(duì)CAR-T/NK細(xì)胞密度、增殖能力、目的基因的表達(dá)時(shí)長(zhǎng)、培養(yǎng)基類(lèi)型、培養(yǎng)基補(bǔ)料等條件進(jìn)行研究和驗(yàn)證，為下一步CAR-T/NK細(xì)胞收獲工序提供生產(chǎn)決策依據(jù)。6.5CAR-T/NK細(xì)胞半成品或中間細(xì)胞產(chǎn)物的質(zhì)量控制建議采用中間樣品質(zhì)量檢驗(yàn)