微生物成品 (終極版)

黃原膠生產(chǎn)應(yīng)用研究進(jìn)展

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黃原膠發(fā)酵生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)介發(fā)酵生產(chǎn)方法改良黃原膠應(yīng)用阜豐集團(tuán)是國(guó)內(nèi)最大的黃原膠生產(chǎn)企業(yè)一三二一、黃原膠發(fā)酵生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)介

1、黃原膠(xanthangum)黃原膠又稱黃膠、漢生膠，黃單胞多糖，是一種由黃單胞菌屬發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖。一般由甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌以碳水化合物為主要原料，經(jīng)好氧發(fā)酵生物工程技術(shù)，切斷1,6-糖苷鍵，打開支鏈后，再按1,4-鍵合成直鏈組成的一種胞外雜多糖。是一種類白色或淺米黃色的粉末，無味、無毒、食用安全，易溶于水黃原膠基本結(jié)構(gòu)黃原膠是一種水溶性生物多糖，基本結(jié)構(gòu)是由重復(fù)的“五糖結(jié)構(gòu)單元”組成,相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為2xl06~2xl07，單體包括2個(gè)D-葡萄糖、2個(gè)D-甘露糖和1個(gè)D-葡糖醛酸，具有類似纖維素的一級(jí)結(jié)構(gòu)，包括由β-1,4鍵連接的D-葡萄糖基主鏈與D-甘露糖和D-葡糖醛酸交替連接的三糖側(cè)鏈組成，在C6位置帶有

乙?；腄-甘露糖以α-1,3鍵與主鏈連接在側(cè)鏈末端的D-甘露

糖殘基上以縮醛形式帶有丙酮酸。黃原膠的二級(jí)結(jié)構(gòu)是其側(cè)鏈通過氫鍵反向纏繞主鏈形成雙螺旋或多螺旋結(jié)構(gòu),正是由于這些多螺旋體形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使黃原膠具有良好的控制水流動(dòng)的性質(zhì)。黃原膠在氯化鈉水溶液中主要以多分子締合狀態(tài)存在,少量以單分子狀態(tài)存在,締合狀態(tài)的分子呈分段的雙股螺旋構(gòu)象黃原膠高級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)是二級(jí)結(jié)構(gòu)通過非共價(jià)鍵組成的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)黃原膠獨(dú)特的理化性質(zhì)由其二級(jí)結(jié)構(gòu)決定，黃原膠具有很強(qiáng)的耐酸、堿、鹽、熱等特性，具有突出的高粘性和水溶性、獨(dú)特的流變特性、優(yōu)良的溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性、極好的兼容性等獨(dú)特的理化性質(zhì)黃原膠的性質(zhì)2.黃原膠生產(chǎn)1952年由美國(guó)農(nóng)業(yè)部伊利諾伊斯州皮奧里爾北部研究所分離得到的甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌（Xanthomonascampestris），并使甘藍(lán)提取物轉(zhuǎn)化為水溶性胞外雜多糖而得到黃原膠甘藍(lán)黑腐病單胞菌(Xanthomonascampestris)菌體短桿狀，G-，單生，鞭毛，可移動(dòng)，好氧，無芽孢，寬0.4μm-0.7μm，菌落一般呈黃色，光滑粘稠，產(chǎn)生非水溶性黃單胞菌色素。33生產(chǎn)工藝流程圖解黃原膠的生產(chǎn)受到培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件(溫度，pH值，溶氧等)、反應(yīng)器類型、操作方式(連續(xù)式或間歇式)等多方面因素的影響。培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基選用天然培養(yǎng)基，以葡萄糖、蔗糖或淀粉等為碳源，以蛋白質(zhì)、魚粉、豆粉或硝酸鹽為氮源，加KH2PO4、MgSO4、CaCO3等無機(jī)鹽和Fe2+、Mn2+、Zn2+等微量元素，以及生成促進(jìn)劑谷氨酸、檸檬酸等。3.1發(fā)酵參數(shù)接種接種體積一般為反應(yīng)器中料液體積的5％-10％，接種的次數(shù)應(yīng)隨發(fā)酵液體積增大而增多菌種培養(yǎng)斜面活化→搖瓶種子→發(fā)酵種子培養(yǎng)：將保藏4℃的斜面種子在斜面上活化傳代2次，然后將菌苔接入到含50mL種子液的250mL搖瓶中，28℃、180r/min搖床培養(yǎng)24h搖瓶發(fā)酵：把5％(v/v)的種子液接入裝有100mL培養(yǎng)基的500mL的三角瓶中，溫度控制在28℃、轉(zhuǎn)速為180r/min，發(fā)酵周期為72h控制條件菌株可在25℃-30℃下生長(zhǎng)，最適的發(fā)酵溫度為28℃，如需提高黃原膠產(chǎn)量，應(yīng)選擇溫度在31℃-33℃，而要增加丙酮酸含量就應(yīng)選擇溫度范圍在27℃-31℃。pH范圍在中性時(shí)最適于黃原膠的生產(chǎn)，隨著產(chǎn)品的產(chǎn)出，酸性基團(tuán)增多，pH值降至5左右。研究表明控制反應(yīng)中的pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)有利，但對(duì)黃原膠的生產(chǎn)沒有顯著影響反應(yīng)器的類型及通氧速率、攪拌速率等都有相應(yīng)的經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)，須根據(jù)具體條件而定?？蓞⒖既缦聰?shù)據(jù)：攪拌速率在200-300r/min，空氣流速為1L/L·min。操作方式多采用間歇式，但也有采取連續(xù)式操作方式3.2分離提純預(yù)處理(調(diào)pH值、加熱、稀釋等)固液分離(過濾、超濾、離心分離等)初步純化(超濾、沉淀、離心分離等)高度純化(溶解、超濾、沉淀、離心分離等)制成成品(干燥、粉碎等)預(yù)處理（滅菌、分離）預(yù)處理時(shí)可先用水稀釋，再加硅藻土過濾除去菌體；或調(diào)pH值6.3-6.9、加熱至80℃-130℃、時(shí)間10min-20min殺死菌體，再用中性蛋白酶分解菌體，除去菌體后可以降低黃原膠產(chǎn)品的總氮含量。(GB13886-2007:總氮≤1.5%)初步純化（沉淀）通常將發(fā)酵液濃縮至黃原膠濃度為6％左右，再用乙醇沉淀法提取，此法將比直接用乙醇沉淀提取黃原膠節(jié)約3～4倍乙醇。當(dāng)然，發(fā)酵液經(jīng)硅藻土過濾后也可直接用乙醇沉淀法提取，或用鹽酸沉淀法提取工業(yè)級(jí)產(chǎn)品高度純化（產(chǎn)品分離）精制可采用溶解、超濾、沉淀和分離等方法；黃原膠精制尚沒有找到一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用的方法制成成品（脫水干燥）黃原膠粘度大，干燥操作困難，常用的方法有真空干燥法、噴霧干燥法、盤式連續(xù)干燥法、滾筒干燥法、沸騰干燥法等。真空干燥法簡(jiǎn)便易行，可用于生產(chǎn)各種等級(jí)的黃原級(jí)產(chǎn)品；噴霧干燥法不預(yù)處理發(fā)酵液、不除菌體，直接進(jìn)行噴霧干燥，所得產(chǎn)品雜質(zhì)含量多、顏色深，粘度較小，產(chǎn)品通常為工業(yè)級(jí)；滾筒干燥法、沸騰干燥法等用于生產(chǎn)食品級(jí)黃原膠二、發(fā)酵生產(chǎn)方法改良（1）產(chǎn)膠量取發(fā)酵液適當(dāng)稀釋后，12000r/min離心10min除去菌體及剩余淀粉，上清液用2倍體積乙醇沉淀黃原膠多糖，50℃真空干燥后稱重，并換算成單位重量發(fā)酵液中的含膠量。（2）發(fā)酵液黏度黃原膠發(fā)酵結(jié)束后,用Brookfield黏度計(jì)03號(hào)轉(zhuǎn)子60r/min下測(cè)定發(fā)酵液黏度值。布氏粘度計(jì)粘度測(cè)定原理是通過浸入被測(cè)液中的轉(zhuǎn)子的持續(xù)旋轉(zhuǎn)形成的扭矩來測(cè)量粘度值，扭矩與浸入樣品中的轉(zhuǎn)子被粘性拖拉形成的阻力成比例，因而與粘度也成比例。1、發(fā)酵效果評(píng)價(jià)指標(biāo)（3）丙酮酸丙酮酸含量測(cè)定釆用2,4-二硝基苯肼比色法

在375nm處測(cè)吸光度，與已知丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，即可求得樣品中丙酮酸含量(GB13886-2007)棕紅色菌種在發(fā)酵中起著重要作用，它是決定發(fā)酵產(chǎn)品是否具有產(chǎn)業(yè)化價(jià)值和商業(yè)化價(jià)值的關(guān)鍵因素。而自然界分離的菌種往往生產(chǎn)能力很低，不符合發(fā)酵工業(yè)要求，因此需要通過育種和條件培養(yǎng)打破微生物的正常代謝，使微生物按照人們要求的代謝方向積累代謝產(chǎn)物。

常規(guī)的菌種選育包括自然誘變、誘變育種、雜交育種、原生質(zhì)體融合育種等技術(shù)。2、菌種改良紫外線誘變育種技術(shù)路線：活化菌種→紫外線誘變→初篩→復(fù)篩→亞硝基胍誘變→初篩→復(fù)篩→目的菌株出發(fā)菌株：實(shí)驗(yàn)室保存的野油菜黃單胞菌紫外誘變條件：

15W的紫外燈管，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞

紫外線誘變育種原理：紫外線照射能使DNA鏈中兩個(gè)相鄰的嘧啶核苷酸形成二聚體造成局部DNA分子無法配對(duì),而影響DNA的正常復(fù)制,造成基因突變。紫外誘變對(duì)微生物致死率的影響紫外誘變菌株的初篩紫外誘變菌株的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)UV-32的亞硝基胍誘變亞硝基胍(NTG):黃色結(jié)晶狀物質(zhì)，性質(zhì)不穩(wěn)定，見光易分解，不溶于水,因此用作誘變劑時(shí)需要加入助溶劑溶解誘變機(jī)理：亞硝基胍屬烷化劑，而烷化劑是突變中一類相當(dāng)有效的化學(xué)誘變劑，這類誘變劑具有1個(gè)或多個(gè)活性烷基，它們易取代DNA分子中活潑的氫原子，使DNA分子上的堿基及磷酸部分被烷化，DNA復(fù)制時(shí)導(dǎo)致堿基配對(duì)錯(cuò)誤而引起突變?nèi)芤旱乃釅A影響NTG的誘變效果，當(dāng)pH6.0時(shí)，NTG的烷基化作用最強(qiáng)，因此需配置磷酸緩沖液來調(diào)節(jié)pH值。出發(fā)菌株：UV-32亞硝基胍對(duì)微生物致死率的影響亞硝基胍誘變菌株的初篩亞硝基胍誘變菌株穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)通過上述紫外線誘變和化學(xué)誘變過程，得到菌株UN-26，在相同條件下，其黃原膠產(chǎn)量比原菌株高39.9%。3.1發(fā)酵后期補(bǔ)糖黃原膠的發(fā)酵屬于菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物生成半偶聯(lián)型。在前期主要是菌體生長(zhǎng)期，后期主要為產(chǎn)膠期。較低的C/N利于菌體的生長(zhǎng)，而高的C/N較利于黃原膠的合成。前期菌體基本上達(dá)到最大值，黃原膠的合成主要在中后期，所以考慮補(bǔ)糖的時(shí)間應(yīng)選在中前期。3、發(fā)酵條件改良3.2氧氣

甘藍(lán)黑腐病黃單胞桿菌是好氧菌，溶氧量在黃原膠發(fā)酵中有著非常重要的作用。

溶氧濃度會(huì)影響到黃單胞桿菌的生長(zhǎng)速率、黃原膠的生成率以及質(zhì)量。

隨著發(fā)酵過程中黃原膠含量的增加，發(fā)酵液濃度增大，氧含量顯著降低，影響黃原膠的持續(xù)合成針對(duì)氧含量問題，可采取以下措施：3.2.1轉(zhuǎn)基因技術(shù)

可在表達(dá)載體中插入細(xì)菌血紅蛋白基因,構(gòu)建了新的基因工程菌,提高菌株結(jié)合氧的能力,進(jìn)一步提高黃原膠的產(chǎn)量。

轉(zhuǎn)入的細(xì)菌血紅蛋白能夠結(jié)合環(huán)境中的氧氣，在細(xì)胞內(nèi)創(chuàng)造更高水平的氧濃度，這樣可以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，顯著地增加細(xì)胞對(duì)氧的吸收，并且增加產(chǎn)量。3.2.2氧載體（攜氧劑）

▲通過在發(fā)酵液中引入一種新的液相(與發(fā)酵液互不相溶)，以減少氣液傳氧阻力，從而提高氧氣的傳質(zhì)速率，這種液相一般具有比水更高的溶氧能力。例如：加入大豆油使黃原膠產(chǎn)率有明顯提高，與未加大豆油的對(duì)照組相比，黃原膠產(chǎn)率由1.64%增加到2.41%（加入6%大豆油）。隨著大豆油加入量的增加，產(chǎn)率反而下降，這可能是因?yàn)殡m然氧載體能提高溶氧能力，但由于培養(yǎng)基失水較多，影響產(chǎn)率另外，表觀粘度的不斷增加會(huì)影響氧傳質(zhì)系數(shù)由于黃原膠的粘連性極好，在發(fā)酵中后期，發(fā)酵液粘度非常高。物料的混合及氧的分散能力大大下降，導(dǎo)致供氧不足，發(fā)酵無法進(jìn)行。要獲得優(yōu)質(zhì)的黃原膠產(chǎn)品，必須先除去發(fā)酵終產(chǎn)物中的菌體。通常要將發(fā)酵液稀釋幾倍，然后離心除去菌體，這樣必然導(dǎo)致沉淀分離黃原膠時(shí)的乙醇含量增加。▲可以采用無菌體的發(fā)酵液——酶液發(fā)酵合成黃原膠。一級(jí)培養(yǎng)是為了獲得較大生物量的胞外酶而不生成黃原膠。由于黃原膠會(huì)影響胞外酶的分泌及菌體的分離，因而采用少量的碳源及較低的碳氮比。第二步由于是采用一級(jí)培養(yǎng)產(chǎn)生的胞外酶作用底物合成黃原膠，因此可采用無氮培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。3.3發(fā)酵方式改良2酶液發(fā)酵VS普通法可以看出，發(fā)酵前期普通法粘度增加較快，而后兩者幾乎同時(shí)到達(dá)最高點(diǎn)，粘度相差不大酶液發(fā)酵：一級(jí)培養(yǎng)25小時(shí)，5000r/min分離除菌后進(jìn)行發(fā)酵3.4.1醇種類對(duì)醇沉淀黃原膠的影響

傳統(tǒng)使用單一有機(jī)溶劑作為沉淀劑，嘗試采用不同比例的乙醇和異丙醇的混合溶劑來提取。3.4提取方法改良提膠率隨著醇用量的增加而提高，當(dāng)醇量為發(fā)酵液體積3倍時(shí)提膠率最高,當(dāng)醇量繼續(xù)增加，提膠率降低。3.4.2醇用量對(duì)醇沉淀提取黃原膠的影響3.4.3無機(jī)鹽對(duì)醇沉淀提取黃原膠的影響

將各添加劑按等摩爾電荷加入已經(jīng)預(yù)處理好的發(fā)酵液中,加入混醇(乙醇:異丙醇=3:l),離心30min(4000r/min)。添加5種無機(jī)鹽，結(jié)果如圖3.4.4發(fā)酵液稀釋倍數(shù)對(duì)醇沉淀提取黃原膠的影響

發(fā)酵72h后，發(fā)酵液十分粘稠，

如果直接進(jìn)行預(yù)處理，硅藻土不

能將菌體、色素及其他雜質(zhì)完全

吸附，而且還可能吸附部分膠體，導(dǎo)致?lián)p失。所以在預(yù)處理時(shí)，就

要進(jìn)行一定的稀釋，降低膠液的

粘度三、黃原膠的應(yīng)用

發(fā)展歷程：1988年8月衛(wèi)生部頒布了食品級(jí)黃原膠的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，并將黃原膠列入食品添加劑名單，1992年制定了食品添加劑黃原膠的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB13886-92)，2007年又出臺(tái)了新的國(guó)標(biāo)(