AbMole揭示調(diào)節(jié) ASK1 抑制性磷酸化新機(jī)制

AbMole|揭示調(diào)節(jié)ASK1抑制性磷酸化新機(jī)制一．研究方法在本研究中，采用化學(xué)生物學(xué)方法研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡機(jī)制。使用基于細(xì)胞的高通量篩選(HTS)試驗(yàn)來(lái)鑒定從毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中拯救神經(jīng)元細(xì)胞系的化合物，研究中鑒定了苯二氮卓酮，可選擇性抑制由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑（毒胡蘿卜素和衣霉素）引起的細(xì)胞死亡，但不抑制外源性誘導(dǎo)劑引起的細(xì)胞死亡。這些苯二氮卓類化合物抑制與Ire1α通路相關(guān)的生化事件，包括調(diào)節(jié)凋亡信號(hào)激酶1(ASK1)的磷酸化和抑制JNK和p38MAPK的下游激活。研究中，選了平均濃度為15μg/ml(~20–50μM)的50,000種小分子化合物的ChembridgeDIVERset化學(xué)庫(kù)，使用HTS分析從中鑒定了198種主要苗頭化合物。其中，93種化合物在重新測(cè)試時(shí)得到確認(rèn)。其中，活性化合物CID-2879344和CID-2891837均來(lái)自于ChembridgeDIVERset化學(xué)庫(kù)。結(jié)構(gòu)式分別如下圖所示：Fig1.A.CID-2879344結(jié)構(gòu)式（#5976228）B.CID-2891837結(jié)構(gòu)式（#6239507）二．研究結(jié)果化學(xué)信息學(xué)數(shù)據(jù)分析顯示，26個(gè)確認(rèn)的活性化合物中的11個(gè)構(gòu)成了一系列11個(gè)結(jié)構(gòu)相關(guān)的苯二氮卓酮（EC50值范圍從10到25μM），化合物CID-2891837是11種苯二氮卓酮中最有效的(EC507.1μM)，如圖2所示。Fig2.IdentificationofcytoprotectivebenzodiazepinonebyHTS.研究中檢測(cè)了化合物對(duì)TG處理的原代小鼠皮層神經(jīng)元的活性。暴露于5μMTG18小時(shí)后，原代皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞顯示回縮的神經(jīng)突和濃縮的細(xì)胞核，這是典型的細(xì)胞凋亡。用TG和DMSO（對(duì)照）處理的原代神經(jīng)元中有一半以上在18小時(shí)內(nèi)發(fā)生凋亡，而在用TG和化合物CID-2891837處理的培養(yǎng)物中，神經(jīng)元凋亡并未顯著高于未處理的細(xì)胞（圖3D）。因此，可以得出結(jié)論，活性苯二氮卓類藥物如CID-2891837具有神經(jīng)保護(hù)活性。Fig3.BenzodiazepinonesselectivelyprotectagainstcelldeathinducedbyERstress.通過(guò)磷酸化特異性抗體免疫印跡，被觀察用活性苯二氮卓酮衍生物（CID-2891837、CID-2891533、CID-2891714、CID-2882794和CID-2879344）培養(yǎng)的細(xì)胞增加了絲氨酸967磷酸化，而845和絲氨酸83未調(diào)制，如圖4A、B所示。當(dāng)細(xì)胞與無(wú)活性的苯二氮卓酮CID-2882293一起培養(yǎng)時(shí)，獲得了類似的結(jié)果。相比之下，當(dāng)細(xì)胞與活性苯二氮卓酮CID-2891837一起培養(yǎng)時(shí)，絲氨酸967磷酸化在添加TG之前升高并保持升高。因此，活性苯二氮卓類藥物會(huì)破壞ASK1絲氨酸967磷酸化的正常模式。制備裂解物并進(jìn)行GSTpulldown以回收GST-14-3-3蛋白，并用抗HA抗體對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行免疫印跡以檢測(cè)相關(guān)的HA-ASK1蛋白。在DMSO處理的對(duì)照細(xì)胞中，TG最初在0.5小時(shí)誘導(dǎo)增加，然后在1小時(shí)時(shí)減少HA-ASK1與GST-14-3-3的結(jié)合，這與絲氨酸967磷酸化的變化相關(guān)（圖4D）。使用無(wú)活性的苯二氮卓酮CID-2882293處理的細(xì)胞進(jìn)行了類似的觀察。相比之下，當(dāng)細(xì)胞用活性苯二氮卓酮CID-2891837培養(yǎng)時(shí)，HA-ASK1與GST-14-3-3的結(jié)合增加，而與毒胡蘿卜素處理無(wú)關(guān)（圖4D）。為了將這些研究擴(kuò)展到內(nèi)源性ASK1和14-3-3蛋白，研究中使用腫瘤細(xì)胞系OVCAR5和SNB19進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，與293T細(xì)胞相比，它們含有更高水平的這些蛋白質(zhì)。內(nèi)源性ASK1被免疫沉淀，并通過(guò)免疫印跡檢測(cè)結(jié)合14-3-3。在這些細(xì)胞中，TG對(duì)ASK1與14-3-3的相互作用幾乎沒(méi)有影響，但活性苯二氮卓酮CID-2891837產(chǎn)生一致的結(jié)果，導(dǎo)致內(nèi)源性ASK1與14-3-3的關(guān)聯(lián)增加（圖4E）。Fig4.BenzodiazepinonecompoundsincreaseSer-967phosphorylationofASK1andassociationwith14-3-3.三．延展思考盡管本研究展示了化合物作用機(jī)制的物理證據(jù)，但研究中描述的細(xì)胞保護(hù)性苯二氮卓化合物調(diào)節(jié)ASK1磷酸化和活性的詳細(xì)機(jī)制仍有待闡明（圖5）。另外，關(guān)于磷酸酶，已報(bào)道鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（PPase3，以前稱為PPase2B）使ASK1的絲氨酸967去磷酸化。然而，本研究中沒(méi)有使用體外ASK1去磷酸化試驗(yàn)觀察到化合物CID-2891837對(duì)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的抑制作用，這意味著鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶不是細(xì)胞保護(hù)性苯二氮卓類化合物的直接靶標(biāo)。Fig5.Illustrationshowingsit