非細胞微生物病毒專家講座

第四章

非細胞微生物——病毒非細胞微生物病毒專家講座第1頁最早記載：狂犬病最早記載植物病毒病：郁金香碎花色病1884年，Chamberland創(chuàng)造了細菌過濾器1886年，Mayer發(fā)覺煙草花葉病1892年，俄國伊凡諾夫斯基發(fā)覺煙草花葉病原體濾過性1898年，荷蘭貝杰林克證實煙草花葉病病原體是病毒1915年和1917年，托特和德愛萊爾分別發(fā)覺噬菌體1935年，斯坦利成功地取得了煙草花葉病毒結(jié)晶體病毒發(fā)覺和研究歷史非細胞微生物病毒專家講座第2頁非細胞微生物病毒專家講座第3頁病毒（virus）：一類在活細胞內(nèi)營專性寄生，沒有細胞結(jié)構(gòu)，但有遺傳復(fù)制等生命特征，主要由核酸和蛋白質(zhì)組成超顯微非細胞生物。病毒與人類關(guān)系十分親密第一節(jié)病毒非細胞微生物病毒專家講座第4頁造成各種動植物疾病，影響人類生產(chǎn)和生活植物病毒?。簾煵莼ㄈ~病、水稻矮縮癥等動物病毒病：口蹄疫、禽流感等人類病毒?。嚎袢?、流感、肝炎、艾滋病、天花等微生物病毒?。河绊懓l(fā)酵工業(yè)促進生物科學(xué)和技術(shù)發(fā)展促進遺傳學(xué)、微生物學(xué)、基因工程等學(xué)科發(fā)展病毒與人類關(guān)系非細胞微生物病毒專家講座第5頁非細胞微生物病毒專家講座第6頁一、病毒特點2.不含有細胞結(jié)構(gòu)，含有普通化學(xué)大分子特征。Eg.一些簡單病毒僅由核酸和蛋白質(zhì)外殼（coat）組成，故可把它們視為核蛋白分子。3.一個病毒毒粒內(nèi)只含有一個核酸，DNA或者RNA。朊病毒甚至僅由蛋白質(zhì)組成4.大部分病毒沒有酶或酶系極不完全，不含催化能量代謝酶，不能進行獨立代謝作用。1.個體微小，在電子顯微鏡下才能看見。非細胞微生物病毒專家講座第7頁5.嚴格活細胞內(nèi)寄生，沒有本身核糖體，沒有個體生長，必須依賴宿主細胞進行本身核酸復(fù)制，形成子代。6.對大多數(shù)抗生素不敏感，對干擾素敏感。7.在離體條件下，能以無生命生物大分子狀態(tài)存在，并可長久保持其侵染活力。8.有些病毒核酸還能整合到宿主基因組中，并誘發(fā)潛伏性感染。非細胞微生物病毒專家講座第8頁真病毒（Euvirus）按組成成份最少含有核酸和蛋白質(zhì)兩種組分。亞病毒（subvirus）類病毒：只含含有獨立侵染性RNA組分擬病毒：只含不具獨立侵染性RNA組分朊病毒：只含單一蛋白質(zhì)組分二、病毒分類非細胞微生物病毒專家講座第9頁病毒幾乎能夠感染全部細胞生物，并含有宿主特異性噬菌體（phage）植物病毒（plantviruses）動物病毒（animalviruses）按宿主范圍非細胞微生物病毒專家講座第10頁三、病毒形態(tài)和結(jié)構(gòu)

（一）病毒大小

絕大多數(shù)病毒都是能經(jīng)過細菌過濾器微小顆粒，直徑在20～200nm范圍內(nèi)，必須在電鏡下觀察。最大病毒：d=200nm牛痘苗病毒（smallpox）；最小病毒之一：d=28nm脊髓灰質(zhì)炎病毒（poliovirus）；非細胞微生物病毒專家講座第11頁非細胞微生物病毒專家講座第12頁球形顆粒(或稱擬球形顆粒)桿狀顆粒復(fù)雜形狀顆粒（如蝌蚪狀，卵形）病毒形狀（二）病毒形態(tài)1.病毒個體形態(tài)非細胞微生物病毒專家講座第13頁病毒粒大量聚集并使宿主細胞發(fā)生病變時，就形成了含有一定形態(tài)、結(jié)構(gòu)并能觀察和識別特殊“群體”

包涵體（inclusionbody）噬菌斑(plaque)枯斑(lesion)空斑(plaque)2.病毒群體形態(tài)非細胞微生物病毒專家講座第14頁當(dāng)噬菌體侵染細菌后會快速引發(fā)敏感細菌裂解，釋放出大量子代噬菌體，然后它們再擴散和侵染周圍細胞，最終在含有敏感細菌平板上出現(xiàn)肉眼可見空斑噬菌斑（plaque）非細胞微生物病毒專家講座第15頁由植物病毒在植物葉片上形成局部壞死斑，稱之為枯斑（lesion，病斑）?？莅撸╨esion）非細胞微生物病毒專家講座第16頁1.病毒粒子經(jīng)典結(jié)構(gòu)病毒粒子：專指成熟、結(jié)構(gòu)完整和有感染性單個病毒，又稱為毒粒。（三）病毒結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu)（核衣殼）非基本結(jié)構(gòu)：包膜，刺突等關(guān)鍵：核酸，RNA或DNA衣殼：蛋白質(zhì)亞基非細胞微生物病毒專家講座第17頁對稱體制螺旋對稱二十面體對稱復(fù)合對稱無包膜有包膜桿狀：煙草花葉病毒（TMV）等絲狀：大腸桿菌f1、fd、M13等卷曲狀：正粘病毒（流感病毒）等彈狀：狂犬病毒，水泡性口膜炎病毒等無包膜有包膜：皰疹病毒大型：腺病毒等小型：脊髓灰質(zhì)炎病毒，

φX174噬菌體等無包膜：大腸桿菌T偶數(shù)噬菌體（蝌蚪狀）等有包膜：痘病毒（磚塊狀）2.病毒對稱體制非細胞微生物病毒專家講座第18頁（1）螺旋對稱及其代表——煙草花葉病毒非細胞微生物病毒專家講座第19頁由6390個核苷酸組成，每3個核苷酸與一個蛋白質(zhì)亞基相結(jié)合衣殼含2130個皮鞋狀蛋白亞基5％ssRNA95％衣殼蛋白煙草花葉病毒形態(tài)和結(jié)構(gòu)非細胞微生物病毒專家講座第20頁有12個角、20個面、30條棱。衣殼由252個衣殼粒組成，包含關(guān)鍵是由36500bp（堿基對）線狀雙鏈DNA（dsDNA）組成。六鄰體（hexon）衣殼粒240個（均勻分布在20個面上）；五鄰體（penton）衣殼粒12個（分布在12個頂角上）；每個五鄰體上突出一根末端帶有頂球蛋白纖維，稱為刺突（spike）。（2）二十面體對稱及其代表——腺病毒非細胞微生物病毒專家講座第21頁非細胞微生物病毒專家講座第22頁非細胞微生物病毒專家講座第23頁（3）復(fù)合對稱及其代表——T偶數(shù)噬菌體尾管尾絲刺突基板尾鞘頭部頸環(huán)非細胞微生物病毒專家講座第24頁1.病毒核酸核酸是病毒遺傳物質(zhì)，含量1％－5％不等普通一個病毒毒粒只含有一個核酸核酸類型：DNA/RNA;ds/ss;線狀/環(huán)狀；閉環(huán)/缺口環(huán)等病毒核酸種類是病毒系統(tǒng)分類中最可靠分子基礎(chǔ)（四）病毒化學(xué)成份非細胞微生物病毒專家講座第25頁非細胞微生物病毒專家講座第26頁蛋白質(zhì)是病毒主要成份，占95%左右。功效：組成病毒粒子外殼，保護核酸；決定病毒感染特異性；組成病毒組成中酶分類：結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白（3）其它成份：脂類、糖類、無機鹽類(2)病毒蛋白質(zhì)非細胞微生物病毒專家講座第27頁繁殖方式：復(fù)制，一個特殊繁殖方式復(fù)制：病毒感染宿主細胞——病毒核酸進入細胞——復(fù)制與表示——產(chǎn)生子代病毒基因組和新蛋白質(zhì)——裝配——釋放不存在個體生長過程！四、病毒繁殖——噬菌體為例非細胞微生物病毒專家講座第28頁（1）吸附尾絲與宿主細胞表面受體結(jié)合刺突和基板固定1.噬菌體繁殖過程不一樣噬菌體有不一樣吸附位點！宿主對各種噬菌體也有特異受體！非細胞微生物病毒專家講座第29頁非細胞微生物病毒專家講座第30頁吸附量：每一個敏感細胞所能吸附對應(yīng)噬菌體數(shù)量影響噬菌體吸附原因：內(nèi)因：噬菌體量、特異性受體外因：溫度、pH、陽離子等非細胞微生物病毒專家講座第31頁過程：尾鞘收縮——尾管插入宿主細胞——核酸注入宿主細胞——蛋白質(zhì)外殼留在細胞外（2）侵入非細胞微生物病毒專家講座第32頁核酸復(fù)制和蛋白質(zhì)合成過程(以E.coliT偶數(shù)系列噬菌體為例)宿主mRNA聚合酶——噬菌體mRNA——早期蛋白次早期mRNA聚合酶——噬菌體次早mRNA——次早期蛋白DNA聚合酶——新噬菌體DNA晚期mRNA聚合酶——晚期mRNA——晚期蛋白（3）增殖非細胞微生物病毒專家講座第33頁早期（early,immediateearly）次早期（delayedearly）晚期（late）非細胞微生物病毒專家講座第34頁（4）裝配非細胞微生物病毒專家講座第35頁子代噬菌體成熟后，在脂肪酶和溶菌酶作用下，從細胞內(nèi)部促進細胞裂解，實現(xiàn)噬菌體釋放，宿主細胞死亡。裂解量：噬菌體侵入宿主細胞后，每個細胞最終能裂解釋放出來噬菌體數(shù)量。自外裂解：（5）裂解非細胞微生物病毒專家講座第36頁非細胞微生物病毒專家講座第37頁噬菌體效價：每毫升試樣中所含有具侵染性噬菌體粒子數(shù)，亦是噬菌斑數(shù)量。噬菌斑測定方法：雙層平板法2.噬菌體效價非細胞微生物病毒專家講座第38頁雙層平板法底層平板（2％瓊脂培養(yǎng)基10mL）上層平板上層培養(yǎng)基（1％瓊脂培養(yǎng)基5mL）宿主菌懸液（對數(shù)期菌液0.2mL）噬菌體試樣（適當(dāng)稀釋液0.1mL）混勻37℃10h計數(shù)噬菌斑非細胞微生物病毒專家講座第39頁非細胞微生物病毒專家講座第40頁定量描述烈性噬菌體生長規(guī)律試驗曲線，以感染時間為橫坐標(biāo)，噬菌體效價為縱坐標(biāo)。3.一步生長曲線非細胞微生物病毒專家講座第41頁烈性噬菌體：侵染宿主細胞后，能在細胞體內(nèi)形成大量子噬菌體，從而引發(fā)菌體細胞裂解死亡噬菌體。溫和噬菌體：凡是吸附并入侵宿主細胞后，其DNA只是整合在宿主染色體上，并隨宿主DNA復(fù)制而進行同時復(fù)制，普通不進行增殖和引發(fā)宿主細胞裂解噬菌體4.溫和噬菌體非細胞微生物病毒專家講座第42頁溶源性：溫和噬菌體侵入宿主細胞后，將其基因組整合到宿主細胞基因組上，隨宿主細胞復(fù)制而進行同時復(fù)制，不引發(fā)宿主細胞裂解現(xiàn)象。溶源菌：帶有溫和噬菌體基因組，并能正常生長繁殖而不被裂解宿主細胞稱為溶源菌。三種狀態(tài)：游離態(tài)、整合態(tài)、營養(yǎng)態(tài)最常見溫和噬菌體：E.coliλ噬菌體相關(guān)概念：非細胞微生物病毒專家講座第43頁λ噬菌體進入宿主后線狀基因組依靠粘性末端環(huán)化非細胞微生物病毒專家講座第44頁λ噬菌體溶源性反應(yīng)經(jīng)過特定位點整合（切離）細菌染色體非細胞微生物病毒專家講座第45頁將少許溶源菌與大量敏感性指示菌相混合，混勻后培養(yǎng)，會產(chǎn)生一個個中央有溶源菌小菌落、四面有透明圈特殊噬菌斑。

溶源菌檢驗：非細胞微生物病毒專家講座第46頁亞病毒（subvirus）：在核酸和蛋白質(zhì)兩種成份中，只含其中一個成份分子病原體，包含類病毒、擬病毒和朊病毒

3類。第二節(jié)亞病毒非細胞微生物病毒專家講座第47頁類病毒（viroid）是一類只含RNA、專性寄生在活細胞內(nèi)分子病原體，當(dāng)前只在植物體中發(fā)覺所含核酸為裸露環(huán)狀ssRNA經(jīng)典類病毒：馬鈴薯紡錘形塊莖?。≒STD）類病毒（PSTV）一、類病毒（Viroid）非細胞微生物病毒專家講座第48頁非細胞微生物病毒專家講座第49頁擬病毒（virusoid）：又稱類類病毒或衛(wèi)星病毒，指一類包裹在真病毒粒中類病毒。極其微小，普通僅由裸露RNA（300～400個核苷酸）或DNA所組成。被擬病毒“寄生”真病毒又稱輔助病毒二、擬病毒（Virusoid）非細胞微生物病毒專家講座第50頁朊病毒（prion）又稱“普列昂”或蛋白質(zhì)侵染因子，是一類不含核酸傳染性蛋白質(zhì)分子，因能引發(fā)宿主體內(nèi)現(xiàn)成同類蛋白質(zhì)分子發(fā)生與其相同構(gòu)象改變，從而可使宿主致病。1982年，美國S.B.Prusiner，羊搔癢癥三、朊病毒（Prion）非細胞微生物病毒專家講座第51頁Prusiner(1982)提出羊搔癢病因子是一個蛋白質(zhì)侵染顆粒（proteinaceousinfectiousparticle），并將之稱做Prion。

-------朊病毒1997年，StanleyB.Prusiner榮獲諾貝爾獎非細胞微生物病毒專家講座第52頁link1人庫魯病(kuru)、克雅氏病(CreutzfeldtJakobdisease,CJD)等羊搔癢癥(scrapie)牛海綿狀腦病(spongiformencephalopathy)非細胞微生物病毒專家講座第53頁呈淀粉樣顆粒狀無免疫原