血小板功能檢測

血小板功能檢測：血小板在止血和動脈血栓形成中的作用包括粘附到受損血管處或破裂的動脈粥樣硬化斑塊處，形成止血栓或凝塊；加速凝血瀑布導致凝血酶的形成。本文綜述了血小板的作用，列舉了遺傳性的血小板缺陷及異常出血性疾病，并討論了各種血小板致聚劑。本文綜述了各種血小板功能檢測方法以及它們的優(yōu)缺點：出血時間測定；利用透光性的改變來檢測枸櫞酸鈉抗凝的富含血小板血漿中血小板的聚集功能；阻抗聚集儀檢測枸櫞酸鈉抗凝全血中血小板的聚集功能；高切變力血小板功能分析儀（PFA-100）和Ultegra快速血小板功能測定儀檢測血小板相關的止血功能；用錐板分析儀檢測高切變力下血小板的粘附和聚集功能；檢測血小板顆粒內(nèi)容物的分泌（ATP,14C-5-羥色胺,血小板第4因子和β－血小板球蛋白）和血栓烷B2的形成；流式細胞術檢測體內(nèi)和體外使用致聚劑的血小板激活情況（包括血小板膜糖蛋白構象改變，P-選擇素和磷脂酰絲氨酸的表達）；檢測遺傳性缺陷中血小板膜糖蛋白的水平。1簡介血小板在止血和血栓中的作用當血管損傷時，血小板會迅速粘附到損傷處，聚集形成由纖維蛋白固定的止血塊。在微血管損傷處及破裂的動脈粥樣硬化斑塊處也會發(fā)生類似的過程，最終形成血小板－纖維蛋白血栓，引發(fā)動脈硬化癥的血栓性并發(fā)癥。體內(nèi)能夠激活血小板的誘導劑主要有膠原蛋白，ADP，血栓烷A2（TXA2），凝血酶，弱誘導劑有5－羥色胺和腎上腺素。血小板上不僅有針對這些介質(zhì)的受體，還有纖維蛋白原和VWF的受體。TXA2的形成和釋放以及血小板致密顆粒中分泌的ADP和5－羥色胺會加速血小板的激活過程，促凝表面的暴露促進凝血酶的形成，而凝血酶是強有效的激活劑。激活也會誘導α-顆粒內(nèi)容物的分泌和顆?？缒さ鞍譖-選擇素出現(xiàn)在血小板的表面上。所有血小板致聚劑都具有協(xié)同作用，因此當凝集過程的某個途徑存在缺陷或被抑制時，血小板的凝集功能將被大大受損。在血管壁的損傷處，血小板與內(nèi)皮下細胞外基質(zhì)中的VonWillebrand因子（VWF），膠原蛋白和纖維結合素粘附在一起。在高切變力情況下，血小板糖蛋白GPIb/IX/V復合物與VWF的相互反應是非常短暫的，但當VWF與血小板表面的GPIIb/IIIa結合，這一過程會變成不可逆的。血小板表面膠原蛋白受體包括GPIa/IIa（α2β1），它在粘附過程中具有非常重要的作用；而GPVI在血小板活化引起TXA2的形成和釋放以及致密顆粒和α貯存顆粒內(nèi)容物的分泌過程中起作用。血小板存在TXA2和ADP受體，在損傷處流動的血小板受刺激后會改變形狀，伸出偽足，進而在粘附血小板周圍形成聚集物。聚集過程需要血小板表面的異二聚體整合素分泌和血小板表面磷脂雙分子層翻轉(zhuǎn)暴露促凝磷脂表面，通常為磷脂酰絲氨酸（PS）翻轉(zhuǎn)到血小板表面。也會產(chǎn)生促凝活性的微粒。PS的暴露大大加速了凝血途徑因子Ⅹ和凝血酶原酶的反應，產(chǎn)生了最有效的血小板誘導劑--凝血酶。凝血酶切開血小板表面的蛋白酶激活受體，導致GPIIbGPIIb/IIIa復合物轉(zhuǎn)變成纖維蛋白原的受體或某些情況下作為VWF的受體。這些蛋白會在鄰近的受刺激的血小板之間搭橋。激活的正常的GPIIb/IIIa在血小板聚集過程中非常重要。當血小板受膠原蛋白和凝血酶等致聚劑刺激，能引起血小板顆粒的/IIIa的激活，形成TXA2和引起血小板顆粒內(nèi)容物的分泌。凝血酶同樣促使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，包裹在血小板聚合物表面形成堅固的止血塊或血栓。在磷脂酶A2作用下膜磷脂釋要目的在于確定異常出血的原因或確保在手術或牙科侵入性操作（包括拔牙）過程中的正常止血功能。多種方法嘗試來證實高血小板活性有血栓形成的傾向，這個專題最近被Thiagarajan和Wu等進行綜述。異常出血常見的原因為血小板減少癥，這可通過血小板計數(shù)來確定。當血小板計數(shù)低放出花生四烯酸時可產(chǎn)生TXA2。在環(huán)氧化酶（COX-1）和血栓烷合酶作用下，花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)門XA2。TXA2只能短期存在，很快形成無活性的穩(wěn)定產(chǎn)物TXB2。COX－1被阿司匹林不可逆地滅活，因此血小板生成TXA2的能力受到它們在外周循環(huán)停留時間的影響。任何一項血小板功能受損，都會削弱凝血功能。血小板功能檢測的主于50-70×109/l，就會導致瘀斑和凝血異常。血小板減少癥會影響大多數(shù)血小板功能檢測方法，但對流式細胞術除外。1.1遺傳性和獲得性血小板功能缺陷表1列舉了部分遺傳性疾病，它們的血小板功能存在某種程度的受損，有明顯的出血癥狀。除VonWillebrand病(VWD)外，大多數(shù)缺陷非常罕見。雖然某些食物和天然物質(zhì)中含有抑制物，但是藥物因素仍是最主要的引起獲得性血小板功能低下的原因。抑制血小板功能的藥物中有能抑制COX的阿斯匹林和其它非甾醇類抗感染藥，抗生素如青霉素，thienopyridines（噻氯匹定和clopidogrel），GPIIb/IIIa拮抗劑，影響cAMP水平的藥物，抗凝劑如肝素，纖溶制劑，心血管藥物，神經(jīng)科藥物和麻醉藥物等。到目前為止阿司匹林是最常見的抑制劑，至少有250種藥物中含有這種成分。阿司匹林的作用是長期的，它對COX-1的乙酰化作用是不可逆的。非血液系統(tǒng)疾病引起血小板功能降低的疾病有：尿毒癥，慢性肝病，骨髓增殖性疾病和獲得性VWD。表1遺傳性出血疾病Glanzmann血小板機能不全：GPIIb/IIIa（αIIbβ3）缺失或異常它是纖維蛋白原和VWF的受體，對任何血小板致聚劑無反應。Bernard-Soulier巨大血小板綜合癥：GPIb/IX/V缺失或異常它參與血小板與內(nèi)皮下的VWF粘附。對瑞斯霉素無反應。GPIa/IIa（α2β1）缺失或異常。不能粘附膠原蛋白ADP誘導聚集嚴重減弱，以及膠原蛋白和凝血酶誘導聚集受損，提示為罕見的P2Y12ADP受體異常。噻氯匹定和clopidogrel通過此受體作用，產(chǎn)生類似的對ADP誘導選擇性抑制。弱的致聚劑，腎上腺素（5-10uM），可聚集PRP中的血小板，而不改變血小板的形態(tài)，但腎上腺素的致聚作用并不一致。如果服用了阿司匹林或其它抑制TXA2形成的藥物，血小板對任何濃度的腎上腺素都不反應，不會產(chǎn)生聚集。膠原纖維（1-5μg/ml）會引起特征性滯后（可達1分鐘）的血小板聚集,聚集需要TXA2形成和顆粒內(nèi)容物的分泌，而且基本上是不可逆的。雖然血小板形態(tài)發(fā)生了變化，但是阿司匹林及其它抑制TXA2形成的藥物可以阻斷低濃度的膠原蛋白引起的聚集反應。罕見的GPVI缺陷癥表現(xiàn)為血小板受膠原蛋白刺激后并不發(fā)生聚集，但在受到其它致聚劑的刺激后通常會發(fā)生聚集?；ㄉ南┧峥梢赞D(zhuǎn)變?yōu)門XA2，因此可作為聚集劑。阿司匹林和其它可以抑制環(huán)氧化酶的藥物具有抑制作用。但是TXA2的類似物U46619，卻可以在此類抑制劑的存在狀況下產(chǎn)生聚集作用。在罕見的環(huán)氧化酶缺失的病人，花生四烯酸不誘導血小板聚集，但U46619會引起血小板的聚集。SFLLRN(TRAP)具有凝血酶的誘導血小板強聚集作用的功能，只有當TXA2形成障礙時，這一作用才會稍有減弱。分泌缺陷，特別是致密顆粒缺少ADP的增強作用，會造成異常的聚集，即存在正常的第一相過程，而無第二相過程。分泌缺陷時低濃度的膠原蛋白和SFLLRN誘導血小板聚集會減弱。2.2瑞托霉素聚集血小板這一試驗同樣用聚集儀對枸櫞酸抗凝的PRP進行測試?？股厝鹜忻顾乜勺鳛橹戮蹌?，終濃度常見為1.5mg/ml。正常的樣本是第一相聚集后緊接著會發(fā)生第二相聚集。缺乏反應提示為Bernard-Soulier綜合癥或VWF缺乏。2.3全血血小板聚集用阻抗血小板聚集儀可測定稀釋的抗凝全血的血小板聚集功能。將兩個電極插入樣本中，當有電流通過時，血小板會粘附到電極上。然后添加致聚劑加以攪拌，在電極上的血小板周圍血小板聚集，記錄阻抗變化的速率和幅度。這一試驗的優(yōu)點在于不用制備PRP，而且脂血中的血小板功能也可測量，但不適合血小板計數(shù)極低的病人。2.4血小板功能分析儀－100DadeBehring血小板功能分析儀（PFA－100）是微處理器控制的儀器，它可定量測定高切變力下血小板和血小板相關的止血功能。試驗過程為0.8ml枸櫞酸抗凝血加到裝有一次性試驗管的槽內(nèi)（要求4小時內(nèi)血樣），預溫到37℃，然后利用真空吸力使血樣通過一個直徑200μm的不銹鋼毛細管和直徑為150μm的硝酸纖維膜微孔，膜上包被膠原蛋白和腎上腺素（CEPI）或膠原蛋白和ADP（CADP）。在5000-6000/s的高切變和誘導劑的作用下，血小板產(chǎn)生聚集，阻礙血液穿過微孔，堵塞微孔的時間稱為終止時間（CT），最大測定值為300秒。血小板最初通過GPIb/IX/V和VWF間的相互作用以及GPIa/IIa,VWF的直接連接粘附到膜上的膠原蛋白上導致聚集，而不是由纖維蛋白原連接到活化血小板的GPIIb/IIIa引起聚集。12.9mM的枸櫞酸鈉抗凝時得到的CT值比濃度為10.9mM枸櫞酸鈉抗凝CT值要大，因此選擇合適的抗凝劑濃度是非常重要的。PPACK也可用作抗凝劑。僅在CEPI管CT時間延長，可能是輕微的遺傳性血小板功能缺陷（如貯存池異常）和阿司匹林抑制。CEPI管和CADP管CT時間均延長，可能為嚴重的遺傳性血小板功能障礙（如Glanzmann血小板機能不全和Bernard-Soulier綜合癥）和VWD。實際上PFA-100是有效的篩選VWD的手段，特別是1型－VWD，而且對婦女月經(jīng)過多及兒童的鼻出血懷疑有血小板異?；騐WD進行鑒別是非常有用的。它同時有利于監(jiān)測1型－VWD患者對DDAVP的反應和PTCA患者對GPIIb/IIIa拮抗劑的反應，也可用于評估血庫提供的濃縮血小板質(zhì)量和血小板輸注的效果。PFA-100具有操作簡單，快速，重復性好，全血用量少的優(yōu)點。血小板計數(shù)少于50×109/L和紅細胞比容＜25％時會引起CT時間延長。2.5Ultegra快速血小板功能檢測Accumetrics快速血小板功能實驗（RPFA）提供了一種簡單，快速，準確的血小板功能檢測方法，它用于床邊監(jiān)測接受GPIIb/IIIa拮抗劑的患者。枸櫞酸鈉抗凝全血采集后，馬上取0.16ml樣本加到有2個樣本通道的一次性試管中。通過由微處理器驅(qū)動的鋼珠運動，血液與血小板致聚劑（iso-S）FLLRN和纖維蛋白原包被的聚苯乙烯珠混勻70秒，檢測樣本的透光強度。激活的血小板和包被纖維蛋白原的珠子之間發(fā)生凝集，沉入底部，引起光透過率的增加。凝集的速度和強度可用血小板凝集單位（PAU）計算，當有GPIIb/IIIa拮抗劑存在，PAU值會迅速下降，這是因為凝集發(fā)生與活化血小板上的未被阻斷的GPIIb/IIIa受體成正比關系。RPFA用來監(jiān)測GPIIb/IIIa拮抗劑abciximab,tirofiban,eptifibatide和orofiban對血小板的阻斷效果。2.6錐板分析儀Varon及其同事開發(fā)了錐板分析儀（CPA），在高切變力的條件下使用錐板粘度計檢測血小板的粘附和聚集。這一裝置通過錐體的旋轉(zhuǎn)在板表面產(chǎn)生均一的切變壓力引起層流。0.2ml的枸櫞酸鈉抗凝全血加到聚苯乙烯板上，以1800/s切變速度旋轉(zhuǎn)2分鐘，隨后染色。圖形分析儀分析粘附的血小板和血小板聚集，可提供大小分布的的直方圖，表面覆蓋的百分比(SC)和平均大小(AS)。血小板粘附到聚苯乙烯板上依賴于板上包被的VWF和纖維蛋白原，GPIIb/IIIa，GPIb/IX/V以及血小板的激活。CPA可快速確定先天性和獲得性的血小板缺陷及VWD，也可測試抗血小板療效和確定血小板功能亢進患者的血栓前形成狀態(tài)。CPA的優(yōu)點在于快速，簡單，只需0.2ml全血。2.7顆粒內(nèi)容物分泌的檢測發(fā)光聚集儀可同時檢測血小板聚集和ATP（一種致密顆粒的組成部分）的釋放。用熒光素酶檢測ATP，ATP的濃度參照正常人PRP和已知ATP濃度制備的標準曲線進行計算。加入誘導劑，檢測已標記血小板的14C-5-羥色胺的分泌狀況可指示致密顆粒的分泌情況。當誘導分泌內(nèi)容物時，α顆粒跨膜蛋白P-選擇素會出現(xiàn)在血小板的表面，這可通過流式細胞儀檢測（見2.9）。血小板第4因子（PF4）和β－血小板球蛋白是血小板特異性蛋白，貯存于α顆粒，在血小板激活時釋放?？捎梅派湫悦庖叻椒y定，但應注意靜脈穿刺對結果影響比較大。2.8花生四烯酸的動員和血栓烷B2的形成在正常情況下，誘導劑可將花生四烯酸從血小板的磷脂層中動員出來，并通過血小板轉(zhuǎn)變?yōu)檠ㄍ锽2。血栓烷B2是一種穩(wěn)定的復合物，可通過商用的放射性免疫測定法和酶免法來測定。2.9流式細胞術流式細胞術可快速檢測抗凝血、稀釋全血、PRP、人工介質(zhì)中懸浮的少量血小板。使用全血可以避免操作過程中血小板被激活。通常血小板與聯(lián)接不同光譜的熒光素的兩種單克隆抗體（MoAbs）反應。為確定血小板的特異性，第一個MoAb特異性針對GPIb,IIb或IIIa，并在近飽和溶液中使用。為確定血小板上的抗原決定簇，血小板還與另一標記MoAb反應。這種MoAb特異性針對表位，也在飽和溶液中使用。與抗體孵育后，稀釋樣本以1000-100，000細胞/min的速度在流式細胞儀上檢測。聚焦激光束在其相應的吸收光譜內(nèi)激發(fā)了聯(lián)接的熒光。血小板通過標識的熒光素以及前向角和側(cè)向角的特性進行確認。第二個單抗發(fā)出的熒光強弱與某一抗原決定簇的密度成正比，并可通過獲取上千個血小板來計數(shù)。這些數(shù)據(jù)均可用軟件來分析。因為激發(fā)光譜有部分被重疊，每一混合熒光需設置補償。如果抗原決定簇的表達隨著時間而變化（如膜GPs的滑動），著色前血小板可先用1％的多聚甲醛固定，它不干擾抗體結合。如果不是立即進行流式細胞儀檢測，血小板也可在加入著色劑后再固定（原理同上）。許多熒光素標記的抗體及非抗體源的探針均可標記血小板抗原決定簇。MoAbs除可以和未被活化血小板的GPs結合外，某些激活依賴MoAbs可檢測GPs構象變化（如PAC1可檢測GPIIb/IIIa）或顆粒膜蛋白表達（如抗P－選擇素）。非抗體探針包括PKH親脂性膜染料，可用鏈親和素標記熒光檢測的生物素和用于檢測血小板活化促凝表面的暴露情況的熒光標記的annexinV。流式細胞儀可有效評估離體血小板活化程度及評價體外使用致聚劑后血小板的敏感性。它用來檢測某些病程中血小板的活化情況，如不穩(wěn)定心絞痛，急性心肌梗死，頑固冠心病，初期子癇，外周血管病，腦血管缺血和冠狀動脈血管成形術。流式細胞儀還被用來監(jiān)測血庫提供的濃縮血小板的質(zhì)量，因為保存期內(nèi)血小板會有所變化。遺傳性血小板膜GP缺陷如Glanzmann血小板機能不全和Ber