《飼料原料中赭曲霉毒素的快速篩查 膠體金快速定量法-江西省地方標(biāo)準(zhǔn)編制說明》

一、標(biāo)準(zhǔn)制定意義

（一）介紹

赭曲霉毒素A是由多種生長在糧食（小麥、玉米、大麥、燕麥、黑麥、大米和黍類等）、

花生、蔬菜（豆類）等農(nóng)作物上的曲霉和青霉產(chǎn)生的。動(dòng)物攝入霉變飼料后，這種毒素也可

能出現(xiàn)在豬和母雞等的肉中。赭曲霉毒素主要損害動(dòng)物肝臟與腎臟，引起肝臟和腎臟損傷，

大量毒素也可能引起動(dòng)物腸黏膜炎癥和壞死。有報(bào)道指出，食物中的OTA與一種致命的地方

性腎臟疾病（balkanendemicnephropathy）有關(guān)，且有致癌、致畸作用，近年來引起了人類

營養(yǎng)學(xué)家的重視。正常條件下，小麥和玉米受OTA污染的機(jī)率較小，約1%～5%，其含量為

0.01～5mg/kg；大麥和燕麥被污染的機(jī)率較高，約為10%，其含量一般在0.1mg/kg以下，

個(gè)別樣品高達(dá)27mg/kg。

赭曲霉毒素包括3種類型，毒性強(qiáng)弱順序是：OTA>OTC>OTB。OTB是OTA的脫氯衍生物，

OTC是OTA的乙基酯，OTB和OTC的含量一般較低，毒性較OTA小。因此，飼料檢測時(shí)可以

主要分析OTA含量。

目前，小麥、大麥、玉米等谷類作物中OTA的測定方法有薄層色譜法（TLC）、酶聯(lián)免

疫吸附法（ELISA）、氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）、高效液相色譜-質(zhì)譜法

（HPLC-MS）。TLC法繁瑣費(fèi)時(shí)，且靈敏度、特異性較差，提取過程中所需有機(jī)溶劑品種多

且量大，易污染環(huán)境，對人體有較大危害。ELISA法測定結(jié)果受試劑盒差異、實(shí)驗(yàn)溫度、儀

器靈敏度等條件影響較大。GC、GC-MS、HPLC和HPLC-MS法普遍存在著樣品前處理過程復(fù)雜，

靈敏度易受樣品的凈化、濃縮等步驟的影響，耗時(shí)，檢測設(shè)備昂貴，并要求有專業(yè)的技術(shù)人

員及較長的分析周期。同時(shí)，這些檢測方法無一例外要求在檢測過程中使用毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，

給環(huán)境和檢測人員的安全造成風(fēng)險(xiǎn)。本標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目是通過化學(xué)合成法制備赭曲霉毒素A人工抗

原，利用此抗原免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制備赭曲霉毒素A單克隆抗體，基于此原料基礎(chǔ)上開發(fā)赭曲霉

毒素A快速檢測試紙條，再通過膠體金讀數(shù)儀進(jìn)行大米、玉米、小麥等樣品中赭曲霉毒素的

定量分析。定量分析便于將檢測結(jié)果與國家限量對比，有助于監(jiān)管部門根據(jù)糧食的污染水平

進(jìn)行糧食分級(jí)管理，同時(shí)有助于企業(yè)內(nèi)部更好地進(jìn)行質(zhì)量控制。本標(biāo)準(zhǔn)可提高糧食樣品檢測、

監(jiān)測效率，降低成本，保護(hù)環(huán)境，保障從業(yè)人員健康安全。

（二）背景

1

據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)，全世界每年谷物產(chǎn)量的25%受到真菌毒素不同程度的

污染。隨著飼料工業(yè)的快速發(fā)展，近年來，中國的飼料也受到霉菌污染的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。自2006

年以來，玉米等飼料原料價(jià)格普遍上漲，致使很多飼料企業(yè)及養(yǎng)殖戶使用低質(zhì)飼料原料，加

上近年來氣候的變化，華北、東北地區(qū)降雨量增加，進(jìn)一步加重了飼料原料中真菌毒素的污

染。而由于飼料原料和配合飼料中多種真菌毒素同時(shí)存在，在食用油等產(chǎn)品及牛奶中真菌毒

素污染也比較嚴(yán)重。在世界許多地方，目前真菌毒素已構(gòu)成重要的食品安全問題。

真菌毒素對人類和動(dòng)物健康可產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，這一認(rèn)識(shí)導(dǎo)致了許多國家在近幾十年來

制定了諸多有關(guān)食品和飼料中真菌毒素的法規(guī)，以保護(hù)人類的健康，并保障生產(chǎn)者和貿(mào)易商

的經(jīng)濟(jì)利益。隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化的進(jìn)程，類似真菌毒素等涉及安全衛(wèi)生項(xiàng)目的限量標(biāo)準(zhǔn)，

越來越多地被利用為貿(mào)易保護(hù)主義中非關(guān)稅壁壘的重要手段。因此，為了保證食品安全，保

障消費(fèi)者的健康，為了打破國外的技術(shù)壁壘，同時(shí)在合理有利的前提下，更多地樹立我國的

技術(shù)性壁壘，開展飼料中真菌毒素的檢測并建立標(biāo)準(zhǔn)方法是有效的方法之一。目前國內(nèi)應(yīng)用

標(biāo)準(zhǔn)檢測方法大多為儀器方法，所需儀器設(shè)備昂貴，不利于進(jìn)行廣泛推廣，并且限制了很多

檢測單位高效、廣泛地開展檢測工作。建立符合中國國情的快速檢測方法標(biāo)準(zhǔn)，具有檢測快

速、簡便、靈敏、成本低等優(yōu)點(diǎn)，為打開市場并占領(lǐng)市場提供了先決條件。

（三）限量標(biāo)準(zhǔn)、檢測方法及研究現(xiàn)狀

1、限量標(biāo)準(zhǔn)

世界各國均對食品中赭曲霉毒素A的含量做出了嚴(yán)格的規(guī)定。歐盟關(guān)于赭曲霉毒素A

的限量標(biāo)準(zhǔn)分類最為詳細(xì)，未加5工谷物為μg/kg，由未加工的谷物制備的所有產(chǎn)品，包括

加工的谷物制品及直接供人食用的食物為3.0μg/kg，供嬰幼兒食用的谷類加工食品和嬰兒

食品為0.5μg/kg。我國對食品中赭曲霉毒素A的限量標(biāo)準(zhǔn)（GB2761-2011）是：谷物及其

制品≤5μg/kg；豆類及其制品≤5μg/kg。我國對飼料中赭曲霉毒素A的限量標(biāo)準(zhǔn)

（GB13078.2-2006）是：配合飼料和玉米≤100μg/kg。

表1我國飼料中的赭曲霉毒素A限量標(biāo)準(zhǔn)

產(chǎn)品名稱限量/(μg/kg)

谷物及其加工產(chǎn)品≤100

配合飼料≤100

2

2、檢測方法及研究現(xiàn)狀

真菌毒素的檢測方法主要有兩種，一是將色譜技術(shù)作為基礎(chǔ)的物理化學(xué)檢測方法，包括

高效液相色譜法（HPLC）和氣相色譜法（GC）等，而薄層層析法（TLC）由于操作過程太復(fù)

雜，國際上近些年使用這種方法檢測真菌毒素的情況越來越少；二是免疫化學(xué)檢測法，主要

指免疫親和柱法（IAC）以及酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等。

GC可同時(shí)檢測多種真菌毒素且檢測限較低，但仍存在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不理想、測定

時(shí)需要進(jìn)行衍生化、上一次進(jìn)樣待測物品滯留、重復(fù)進(jìn)樣變異系數(shù)大使得重現(xiàn)性較差等一系

列問題。HPLC法雖可精確進(jìn)行定性定量測定，但是樣品前處理較為繁瑣、儀器昂貴而成本

高，同時(shí)需要專門的技術(shù)操作人員，因而一般用于大型企業(yè)、科研院校和專業(yè)檢測機(jī)構(gòu)的定

量分析。ELISA檢測黃曲霉毒素，樣品前處理步驟簡單且可實(shí)現(xiàn)定量化，但這種生物學(xué)方法，

受環(huán)境因素影響大，所用抗體和酶特別容易發(fā)生變質(zhì)，如今市場上的同一物質(zhì)試劑盒檢測結(jié)

果差異性較大，穩(wěn)定性還有待提高。

相比較而言，膠體金免疫層析法無需大型儀器、所需輔助試劑少、交叉反應(yīng)率低、試紙

條易于保存且可單份測定，避免了分析步驟繁瑣、成本高等缺點(diǎn)，而且因其檢測更快速、操

作更簡單，測試人員無需進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)，所以更適合食品安全快速檢測行業(yè)的快速檢驗(yàn)和基

層檢測，尤其是野外和偏遠(yuǎn)地區(qū)人員現(xiàn)場應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)十分方便。

（四）制定標(biāo)準(zhǔn)的必要性和意義

1、提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量的需要

赭曲霉毒素A是由產(chǎn)毒真菌產(chǎn)生的代謝物，廣泛存在于糧油食品和飼料中。這些產(chǎn)毒真

菌分布于各級(jí)食物鏈，即使是在現(xiàn)今擁有先進(jìn)的農(nóng)業(yè)技術(shù)和食品加工工藝的條件下，在作物

種植、收獲、儲(chǔ)藏和加工過程中，仍然無法避免和防止產(chǎn)毒真菌的危害。隨著我國經(jīng)濟(jì)快速

發(fā)展，人民群眾物質(zhì)文化生活水平不斷提高，對食品安全的關(guān)注進(jìn)一步提高，迫切需要相應(yīng)

的檢測技術(shù)，鑒于傳統(tǒng)檢測方法的專業(yè)性要求高和成本昂貴的缺點(diǎn)，赭曲霉毒素A快速檢測

技術(shù)的研究及制訂相應(yīng)的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)是非常必要的。

2、實(shí)現(xiàn)以人為本，保證廣大群眾生命健康的需要

赭曲霉毒素A是曲霉菌屬和青霉菌屬的某些種產(chǎn)生的二級(jí)代謝產(chǎn)物，包括赭曲霉毒素A、

赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C、赭曲霉毒素D四種結(jié)構(gòu)類似的化合物，其中分布最廣、產(chǎn)毒

3

量最高、毒性最大、對農(nóng)作物的污染最重、與人類健康關(guān)系最密切的是赭曲霉毒素A，普遍

存在于飼料、谷物及動(dòng)物體內(nèi)，可以導(dǎo)致動(dòng)物的免疫抑制、腎萎縮、胎兒畸形、流產(chǎn)及死亡，

并具有高度的致癌、致畸、致突變的作用，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將其定為2B類致癌物。

3、適應(yīng)市場經(jīng)濟(jì)和加入WTO新形勢的需要

我國已經(jīng)加入WTO，我國農(nóng)產(chǎn)品已面臨國際和國內(nèi)兩個(gè)市場，為我國農(nóng)產(chǎn)品（勞動(dòng)密集

型）進(jìn)入國際市場提供了很好的機(jī)遇，但國際上十分重視農(nóng)產(chǎn)品的安全問題，而農(nóng)產(chǎn)品易于

被真菌污染，可能存在赭曲霉毒素A等真菌毒素殘留問題，這已成為影響出口創(chuàng)匯的最大制

約因素。由于毒素殘留超標(biāo)，引起外國拒收，退貨、扣留、索賠、撤消合同等事件經(jīng)常發(fā)生，

給我國農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)者造成很大損失，并影響了我國農(nóng)產(chǎn)品的形象。為了從源頭保證農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)

量，提高我國農(nóng)產(chǎn)品的競爭力，研究赭曲霉毒素A快速檢測技術(shù)并制訂相應(yīng)的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)

是非常必要的。

二、標(biāo)準(zhǔn)制定過程

《飼料原料中赭曲霉毒素A的快速篩查膠體金免疫層析法》標(biāo)準(zhǔn)由江西省獸藥飼料監(jiān)

察所、中檢環(huán)貿(mào)生物技術(shù)（北京）有限公司、雙胞胎（集團(tuán)）股份有限公司、江西正邦科技

股份有限公司負(fù)責(zé)起草編寫。根據(jù)國家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定和修訂工作的要求，標(biāo)準(zhǔn)起草單位在《飼

料原料中赭曲霉毒素A的快速篩查膠體金免疫層析法》的起草編制過程中，主要工作包括

以下幾個(gè)方面：

（1）詳細(xì)查閱了國內(nèi)、國外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)專業(yè)期刊上發(fā)表過的參考文獻(xiàn)等技術(shù)資料，

并對這些資料進(jìn)行了詳細(xì)的對比，從方法的先進(jìn)性、可靠性和實(shí)用性等幾個(gè)方面考慮，選取

了幾個(gè)代表性的參考資料作為標(biāo)準(zhǔn)起草中的主要技術(shù)參考文本。

（2）及時(shí)購置相關(guān)的實(shí)驗(yàn)儀器、試劑、標(biāo)準(zhǔn)品和其他材料，建立了膠體金免疫層析法

的反應(yīng)體系，摸索不同條件對方法進(jìn)行最優(yōu)化，最終確定了最佳的檢測方法。

（3）開展多種飼料原料膠體金快速檢測方法的試驗(yàn)，包括小麥、大米、黃豆、玉米、

豆粕、花生粕、DDGS，這是方法的重要步驟和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。不同樣品用同一種方法進(jìn)行試驗(yàn)和

驗(yàn)證，確保本檢測方法能夠靈敏、特異、準(zhǔn)確地檢測出飼料原料中OTA的含量。如：方法的

靈敏度，選取多份陰性樣品平行測定，以均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差的方法確認(rèn)檢測限符合要求；方

法的準(zhǔn)確率，通過對經(jīng)驗(yàn)證的陽性樣品進(jìn)行檢測，得到本檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù)，

4

確保本方法的檢測結(jié)果可靠；原料中OTA殘留。方法的批間穩(wěn)定性，選取多份確證濃度的陽

性樣品進(jìn)行不同批次的平行測定，計(jì)算批間變異系數(shù)，確保OTA毒素測定的批間穩(wěn)定性。

（4）在技術(shù)指標(biāo)完成試驗(yàn)工作之后，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)的格式，起草編寫標(biāo)準(zhǔn)文本內(nèi)容和

編制說明內(nèi)容。

三、標(biāo)準(zhǔn)制定依據(jù)

本標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》、GB/T

20001.4-2015《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則第4部分：試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)》的要求而進(jìn)行編寫的。有關(guān)技術(shù)

內(nèi)容是在參考國外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上經(jīng)研究、改進(jìn)和驗(yàn)證后制定的。

四、標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)內(nèi)容和技術(shù)指標(biāo)的論證

（一）技術(shù)原理

本方法應(yīng)用了競爭疫層析原理。使用一個(gè)能夠特異性識(shí)別某一分子或某分子家族的抗體

和配對的抗原，將抗體標(biāo)記膠體金顆粒，將配對的抗體噴涂到反應(yīng)膜上做檢測線。檢測過程

中，如果樣品中含有待檢測物質(zhì)，則待檢測物質(zhì)首先與膠體金顆粒標(biāo)記的抗體結(jié)合形成復(fù)合

物，之后沿反應(yīng)膜向吸水紙方向流動(dòng)，到達(dá)檢測線時(shí)，因?yàn)榇龣z測分子表面的表面決定簇大

部分已經(jīng)被抗體占據(jù)，少量與檢測線處的抗原結(jié)合，形成比較淺的色帶，待檢測物質(zhì)-膠體

金顆粒標(biāo)記的抗體結(jié)合形成復(fù)合物繼續(xù)沿反應(yīng)膜流動(dòng)，到達(dá)質(zhì)控線后被質(zhì)控線處的膠體金顆

?？贵w所捕獲，形成清晰可見的色帶。反應(yīng)完成后，使用讀數(shù)儀讀取檢測區(qū)域和質(zhì)控區(qū)域的

顏色強(qiáng)度信號(hào)，根據(jù)內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中OTA毒素的含量。

（二）適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了膠體金法測定飼料原料樣品中赭曲霉毒素A的條件和詳細(xì)分析步驟。

本方法適用于小麥、大米和玉米等谷物中赭曲霉毒素A毒素快速定量篩查的測定，檢測

限為<2μg/kg。

（三）關(guān)于樣品制備的要求

理論上講樣品顆粒的大小與樣品的均勻性以及毒素的提取效率有關(guān)，當(dāng)樣品細(xì)度不足

20目時(shí)，真菌毒素的提取效率較低，因此國家標(biāo)準(zhǔn)方法中真菌毒素檢測的制樣一般都要求

制備至少500g，全部通過20目篩，本行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)直接采用，從測試數(shù)據(jù)看，能夠滿足方法需

5

求。

（四）方法精密度及準(zhǔn)確度

采用5μg/kg、10μg/kg和20μg/kg三個(gè)濃度水平的陽性樣品，每個(gè)濃度水平測定10

次，重復(fù)測定的變異系數(shù)在4%-13%之間，平均變異系數(shù)為8.34%，結(jié)果見表2。

表2飼料樣品中赭曲霉毒素A檢測數(shù)據(jù)分析表（濃度：μg/kg）

編號(hào)測定結(jié)果

參考濃度

51020

（μg/kg）

151122

261023

351021

461120

541222

661020

751122

861021

951222

1051123

平均結(jié)果

5.3010.8021.60

（μg/kg）

標(biāo)準(zhǔn)偏差0.670.791.07

變異系數(shù)（%）12.737.304.98

（五）檢測限

取20份陰性樣品平行測定，結(jié)果均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差為1.71，本方法的檢出限為2μg/kg，

陰性樣品結(jié)果見表3。

表3陰性飼料樣品赭曲霉毒素A測定結(jié)果分析表（濃度：μg/kg）

樣品編號(hào)測定結(jié)果

11

20

30

41

50

60

71

6

80

90

100

110

121

130

140

151

160

171

180

190

200

平均結(jié)果（μg/kg）0.3

標(biāo)準(zhǔn)偏差0.47

檢測限（μg/kg）1.71

（六）批間穩(wěn)定性

采用5μg/kg左右濃度水平的陽性樣品，不得低于6個(gè)批次，每個(gè)批次測定不低于2

次，批內(nèi)測定取平均值，通過批間變異系數(shù)來表達(dá)，變異系數(shù)應(yīng)≤25%。經(jīng)多批次平行測定，

次方法符合變異系數(shù)要求，批間穩(wěn)定性良好，結(jié)果見表4。

表4飼料樣品赭曲霉毒素A批間穩(wěn)定性測定數(shù)據(jù)分析表（濃度：μg/kg）

測定結(jié)果批次內(nèi)平均參考濃度批次間平均變異系數(shù)

批次號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差

（μg/kg）值（μg/kg）（μg/kg）值（μg/kg）（%）

4

14.5

5

5

24.5

4

5

35.5

6

55.170.7614.57

6

46

6

5

54.5

4

6

66

6

（七）HPLC和膠體金定量檢測條結(jié)果比對

隨機(jī)抽取小麥、大米、黃豆、玉米、豆粕、花生粕、DDGS樣品，用本方法和儀器方法分

7

別進(jìn)行檢測。儀器方法參考GB/T30955-2014《飼料中赭曲霉毒素A、B2、G1、G2的測定免

疫親和柱凈化-高效液相色譜》，對赭曲霉毒素A的檢測限為0.2μg/kg，定量限為1.0μg/kg。

本方法的檢測限為10μg/kg。結(jié)果見表5。

表5儀器比對測定結(jié)果

HPLC檢測結(jié)果膠體金定量檢測條結(jié)果

樣品編號(hào)樣品類型

（μg/kg）（μg/kg）

15.877

2小麥0.050

3