(高清版)GB∕T 38568-2020 工業(yè)微生物菌株生長表型測定 微液滴濁度法

ICS07.080A21中華人民共和國國家標準工業(yè)微生物菌株生長表型測定微液滴濁度法M國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會ⅠGB／T38568—2020本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由中國標準化研究院提出并歸口。本標準起草單位：中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所、中國標準化研究院。1GB／T38568—2020工業(yè)微生物菌株生長表型測定微液滴濁度法本標準規(guī)定了用微液滴濁度法測定工業(yè)微生物菌株生長表型的方法。本標準適用于工業(yè)發(fā)酵用細菌、真菌和微藻菌株生長表型測定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T14926.43實驗動物細菌學(xué)檢測染色法、培養(yǎng)基和試劑3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1參考菌株發(fā)酵性能明確，用于發(fā)酵生產(chǎn)的經(jīng)過鑒定的保存菌株。通過微流控芯片產(chǎn)生單細胞包裹液滴，并培養(yǎng)，根據(jù)液滴中的菌體面積，進行生長速率的計算。5試劑或材料除非另有規(guī)定，所用試劑均為分析純。符合GB/T6682規(guī)定的二級水。5.2基礎(chǔ)培養(yǎng)基按GB/T14926.43給出的方法配制。或選用商品化的預(yù)制培養(yǎng)基，嚴格按照商品說明書加水配制。緩沖液磷酸氫二鈉(氯化鈉(氯化鉀(KCl)0.2g,將上述各成分加去離子水約800mL充分攪拌溶解，然后加入濃鹽酸調(diào)pH至7.4,最后定2GB／T38568—2020容到1L。5.4超低融點瓊脂糖凝膠點為8℃~17℃。含有表面活性劑。6儀器設(shè)備恒溫箱離心機6.3倒置顯微鏡：帶成像模塊。微流控芯片：高度為100μm,后面連接有至少50個培養(yǎng)腔室結(jié)構(gòu)，每個腔室尺寸為1.5mm寬度為6.6分光光度計。7測定步驟7.1.1按GB/T14926.43給出的方法配制工業(yè)微生物相應(yīng)的固體平板和液體培養(yǎng)基，用無菌接種環(huán)分別蘸取參考菌株和待評價菌株保種菌液，在固體平板上劃線，根據(jù)生產(chǎn)工藝參數(shù)選擇相應(yīng)的溫度和pH值，進行培養(yǎng)，直至長出單菌落；分別挑取3個參考菌株和3個待評價菌株單菌落，接種至含有5mL液體培養(yǎng)基的試管中，根據(jù)生產(chǎn)工藝參數(shù)選擇相應(yīng)的溫度和轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)至對數(shù)期。7.1.2從活化的平板培養(yǎng)皿挑取微生物菌株單克隆于5mL液體培養(yǎng)基的容器中，根據(jù)生產(chǎn)工藝參數(shù)選擇相應(yīng)的溫度和轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)至穩(wěn)定期，去除上清后加入PBS溶液，重復(fù)清洗3次。7.2微生物菌液濃度選取用基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋得到細胞懸液濃度約為6×105CFU/mL。7.3瓊脂糖溶液制備用分析天平稱取0.02g超低熔點瓊脂糖置于無菌EP管中，并向其中加入1mL已滅菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加熱溶解，配制成2%（質(zhì)量濃度）的溶液。趁熱用0.22μm的無菌濾頭過濾，現(xiàn)用現(xiàn)配。7.4單細胞液滴發(fā)生各取500μL微生物菌液和瓊脂糖溶液等體積混勻。取一塊芯片，分別在芯片的油相入口加入200μL氟碳油和水相入口加入100μL低熔點瓊脂糖菌液，將注射器與芯片出口相連。7.4.3將芯片放在熱板上（溫度穩(wěn)定性±1℃,范圍在30℃~37℃),將注射器的活塞固定在2mL刻GB／T38568—2020度處，通過注射器內(nèi)的負壓使液體進入芯片，開始發(fā)生液滴。液滴發(fā)生需要2min左右。7.4.4取另一塊芯片重復(fù)上述步驟，一為待鑒定菌株，另一為參考菌株。此步驟重復(fù)三次。7.5單細胞液滴培養(yǎng)液滴發(fā)生結(jié)束后，移除芯片上的槍頭和聚四氟乙烯管，將兩芯片放入4℃冰箱凝固20min后再置入盛有水的培養(yǎng)皿中于37℃恒溫箱進行培養(yǎng)6h。將芯片置于倒置顯微鏡，在10×物鏡下進行成像，獲取至少20個圖片，不少于2000個液滴，并保存為bmp格式。7.7數(shù)據(jù)處理用軟件進行圖片處理，統(tǒng)計每張圖片內(nèi)液滴的個數(shù)以及每個液滴的直徑，并計算圖片中菌斑的平面面積。8結(jié)果分析菌斑面積相對差值按式(1)計算：式中：d—菌斑面積相對差值；x—圖像中單個液滴內(nèi)細菌的面積；R—單個液滴的直徑；n—凝膠液滴的個數(shù)。根據(jù)菌斑面積相對差值評價待選菌株與參考菌株相似