(高清版)GB∕T 30987-2020 植物中游離氨基酸的測(cè)定

ICS07.080A40中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T30987—2014植物中游離氨基酸的測(cè)定國家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)GB／T30987—2020前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4全自動(dòng)氨基酸分析儀法（第一法） 5高效液相色譜法（第二法） 6液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（第三法） 附錄A（資料性附錄）氨基酸化合物信息及定量限 附錄B（資料性附錄）21種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜圖 附錄C（資料性附錄）液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)參考條件 ⅠGB／T30987—2020本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T30987—2014《植物中游離氨基酸的測(cè)定》。本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T30987—2014相比，主要技術(shù)變化如下：—增加了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（見第6章本標(biāo)準(zhǔn)由全國生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC387)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國測(cè)試技術(shù)研究院生物研究所、中國測(cè)試技術(shù)研究院、河北省食品檢驗(yàn)研究院。本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：—GB/T30987—2014。1GB／T30987—2020植物中游離氨基酸的測(cè)定本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了植物中游離氨基酸含量的測(cè)定方法，包括全自動(dòng)氨基酸分析儀法（第一法）、高效液相色譜儀法（第二法）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（第三法）三種方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于茶葉、中藥材、煙葉等植物樣品中21種游離氨基酸（丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T8303—2013茶磨碎試樣的制備及其干物質(zhì)含量測(cè)定3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1游離氨基酸植物中未與其他化學(xué)物質(zhì)結(jié)合，以單個(gè)分子或離子形式存在，可被水溶液或其他溶劑直接浸提出來的氨基酸。4全自動(dòng)氨基酸分析儀法（第一法）樣品中游離氨基酸經(jīng)沸水提取后，經(jīng)氨基酸分析儀的磺酸型陽離子交換柱分離后，在135℃下加熱，氨基酸與茆三酮混合反應(yīng)，伯胺與茆三酮生成藍(lán)紫色化合物，仲胺與茆三酮生成黃色化合物，分別在570nm和440nm波長下通過可見光分光光度檢測(cè)器檢測(cè)兩種衍生產(chǎn)物，保留時(shí)間定性，外標(biāo)工作曲線法定量。4.2試劑或材料除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為優(yōu)級(jí)純。水為符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。2GB／T30987—20204.2.10聚氧乙烯月桂醚。4.2.15氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品：丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、胱氨酸(Cys)、γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、茶氨酸(The)、蘇氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val),化合物信息參見附錄A中表A.1,純度均＞98%。水相濾膜。4.3.1氨基酸自動(dòng)分析儀：配備雙通道可見光檢測(cè)器、六元梯度分離系統(tǒng)和三元反應(yīng)液輸送系統(tǒng)。分析天平感量孔徑移液器量程分別為及樣品按GB/T8303—2013中6.1和6.2規(guī)定制樣，過40目篩。充分混勻，裝入潔凈的盛樣容器內(nèi)，作為試樣，標(biāo)明標(biāo)識(shí)。4.5試驗(yàn)步驟4.5.1.1混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制稱取各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品適量（精確到0.01mg),用水溶解，配制成混合溶液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液中的茶氨酸和其他20種氨基酸的濃度分別為5.00μmol/mL和1.25μmol/mL。儲(chǔ)備溶液冷凍保存有效期為4.5.1.2混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液配制準(zhǔn)確吸取2mL混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至5mL容量瓶中，用水稀釋定容至刻度，混勻，即得到第一份標(biāo)準(zhǔn)溶液。將第一份標(biāo)準(zhǔn)溶液用水逐級(jí)稀釋，制成總共7個(gè)不同濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。和和和和和現(xiàn)配現(xiàn)用。3GB／T30987—2020流動(dòng)相配制稱取檸檬酸鋰四水氯化鋰檸檬酸溶于水中加入無水硫代雙乙醇，4.0聚氧乙烯月桂醚，再加入0.1辛酸，轉(zhuǎn)移至1000容量瓶中，水相濾膜，備用。流動(dòng)相配制稱取檸檬酸鋰四水氯化鋰檸檬酸溶于水中加入無水硫代雙乙醇，4.0聚氧乙烯月桂醚，再加入0.1辛酸，轉(zhuǎn)移至1000容量瓶中，水相濾膜，備用。流動(dòng)相配制稱取檸檬酸鋰四水氯化鋰檸檬酸溶于水中加入無水辛酸，轉(zhuǎn)移至1000容量瓶中，用水水相濾膜，備用。流動(dòng)相配制稱取檸檬酸鋰四水氯化鋰檸檬酸溶于水中加入聚氧乙烯月桂醚，再加入辛酸，轉(zhuǎn)移至容量瓶中，用水定容，過水相濾膜，備用。流動(dòng)相水相濾膜過濾后的水。稱取氫氧化鋰8.40溶于700聚氧乙烯月桂醚，再加入辛酸，轉(zhuǎn)移至容量瓶中，用水定容，過水相濾膜，備用。4.5.3柱后衍生化反應(yīng)溶液配制稱取茆三酮溶于過有機(jī)相濾膜，加入硼氮?dú)夤呐?0放置過夜使用。注：反應(yīng)溶液R1制備好后宜盡快使用完畢，不宜長期儲(chǔ)存。,加入300冰乙酸，401乙二醇甲醚，超聲至溶解，轉(zhuǎn)移容量瓶中，用水定容，過有機(jī)相濾膜，氮?dú)夤呐輦溆?。?zhǔn)確移取無水乙醇于容量瓶中，用純水定容至1混勻后過有機(jī)相濾膜過濾，備用。4GB／T30987—202095℃水浴加熱，每隔5min混勻一次，提取10min后取出，趁熱抽濾，濾液冷卻至室溫后，用水定容至250mL,混勻后取適量樣品溶液，經(jīng)0.45μm水相濾膜過濾后待測(cè)?；撬嵝完栯x子交換柱，3μm,4.6mm×60mm,或同等性能的色譜柱。4.5.5.2儀器分離體系運(yùn)行參考條件流動(dòng)相配制見4.5.2,流動(dòng)相流速為0.35mL/min,流動(dòng)相及柱溫梯度參考條件見表1,儀器進(jìn)樣體積為20μL。表1氨基酸分析儀分離梯度條件程序時(shí)間/min流動(dòng)相柱溫/℃00000002000000500000600005000060000500005000060000050000060000040000050000060000000001000000000001000050000500006000005GB／T30987—2020時(shí)間/min流動(dòng)相柱溫/℃5000006000005000006000000000004.5.5.3氨基酸反應(yīng)檢測(cè)體系運(yùn)行參考條件反應(yīng)液配制見4.5.3,反應(yīng)柱溫度為135℃,反應(yīng)液流速為0.30mL/min,反應(yīng)液梯度參考條件見表2。表2氨基酸分析儀反應(yīng)體系條件程序時(shí)間/min反應(yīng)溶液0000010000010004.5.5.4繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線啟動(dòng)氨基酸自動(dòng)分析儀，設(shè)定工作參數(shù)，待基線穩(wěn)定后，分別吸取不同濃度的系列混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注入氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行測(cè)定，分別得到21種氨基酸的峰面積。分別以各氨基酸峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。通過保留時(shí)間識(shí)別各氨基酸出峰順序。在上述條件（見4.5.5.1~4.5.5.3)下，混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜圖參見附錄B中圖用氨基酸分析儀測(cè)定樣品溶液，分別得到樣品中各氨基酸色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算含量。以水作為空白樣品，在相同測(cè)定條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算空白樣品中各氨基酸本底值。樣品測(cè)定值扣除空白樣品中各氨基酸本底值，即得各樣品中氨基酸凈含量。方法定量限參見附錄A中表A.1。6GB／T30987—20204.6試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理樣品中各游離氨基酸含量的計(jì)算見式(1):式中：W1—試樣中各氨基酸組分的含量，單位為毫克每100克(mg/100g);c—試樣溶液中由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算出的氨基酸濃度，單位為納摩爾每毫升(nmol/mL);ck—空白試樣溶液中由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算出的氨基酸濃度，單位為納摩爾每毫升(nmol/mL);V—試樣總體積，單位為毫升(mL);M—氨基酸的摩爾質(zhì)量，單位為克每摩爾(g/mol);m—試樣質(zhì)量，單位為克(g);m1—試樣干物率，測(cè)定方法見GB/T8303。以兩次測(cè)定的算術(shù)平均值作為測(cè)定結(jié)果，結(jié)果精確至0.01mg/100g。在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的12%。5高效液相色譜法（第二法）樣品中游離氨基酸經(jīng)6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯衍生，使之生成具有熒光的衍生物，經(jīng)液相色譜分離，用熒光檢測(cè)器測(cè)定，保留時(shí)間定性，外標(biāo)工作曲線法定量。5.2試劑或材料除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為優(yōu)級(jí)純。水為符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。無水磷酸氫二鈉。5.2.3無水磷酸二氫鉀。號(hào)純度5.2.9快速定量濾紙。水相濾膜。5.3儀器設(shè)備5.3.1高效液相色譜儀(HPLC)：配備熒光檢測(cè)器。分析天平感量移液器量程分別為7GB／T30987—20205.5試驗(yàn)步驟5.5.1混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制5.5.2衍生試劑的配制5.5.2.16-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯溶液稱取6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯3.0mg,用1.0mL乙腈溶解，加蓋密封，渦旋混合10s,置于55℃烘箱中加熱，直到衍生試劑充分溶解，取出備用。5.5.2.2衍生用緩沖溶液配制稱取無水硼砂10.06g,加水溶解并定容至250mL,用磷酸調(diào)節(jié)pH至8.8,0.45μm水相濾膜過濾后，即得0.20mol/L的硼砂鹽緩沖液，備用。L磷酸氫二鈉儲(chǔ)備液配制L磷酸二氫鉀儲(chǔ)備液配制L的鹽酸三乙胺水溶液配制取137.650g鹽酸三乙胺，用水溶解并定容至1000mL,0.45μm水相濾膜過濾后備用。L磷酸鹽緩沖液）配制準(zhǔn)確移取的鹽酸三乙胺水溶液10mL,54mL乙腈，于1000mL容量瓶中，用水定容至1000mL,混勻，超聲脫氣10min后備用。L磷酸鹽緩沖液）配制準(zhǔn)確移取800mmol/L磷酸二氫鉀儲(chǔ)備液100mL到1000mL容量瓶中，加入水250mL,加入乙腈500mL,用水定容至1000mL,混勻，超聲脫氣10min后備用。8GB／T30987—2020移取制備好的樣品溶液或標(biāo)準(zhǔn)工作溶液10μL于潔凈的玻璃內(nèi)插管中，加入衍生用緩沖溶液70μL,然后加入衍生試劑20μL,渦旋混合10s,加蓋密封于進(jìn)樣瓶中，在室溫下靜置1min,轉(zhuǎn)移至55℃烘箱中加熱10min,取出待測(cè)。液相色譜參考條件如下：色譜柱或同等性能的色譜柱；b)流動(dòng)相：具體梯度洗脫程序見表3;c)熒光檢測(cè)器參數(shù)：激發(fā)波長250nm,發(fā)射波長395nm;流速f)進(jìn)樣體積：5μL。表3高效液相色譜法洗脫程序時(shí)間/min流動(dòng)相A/%B/%000050003272846280000000005.5.6.2繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線啟動(dòng)高效液相色譜儀，設(shè)定工作參數(shù)，待基線穩(wěn)定后，分別吸取不同濃度的系列混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照5.5.5規(guī)定進(jìn)行衍生化操作。衍生化完畢后，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，分別得到21種氨基酸的峰面積。分別以各氨基酸峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。通過保留時(shí)間識(shí)別各氨基酸出峰順序。在上述色譜條件（見5.5.6.1)下，混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜圖參見樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在相同條件下進(jìn)行衍生化和測(cè)定操作（衍生完畢的樣品建議在48h內(nèi)完成測(cè)定分別得到樣品中各氨基酸色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算含量。以水作為空白樣品，在相同測(cè)定條件下進(jìn)行衍生化和測(cè)定，計(jì)算空白樣品中各氨基酸本底值。樣品測(cè)定值扣除空白樣品中各氨基酸本底值，即得各樣品中氨基酸凈含量。9GB／T30987—2020方法定量限參見附錄A中表A.1。5.6試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理樣品中各游離氨基酸含量的計(jì)算見式(2):式中：c—試樣溶液中由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算出的氨基酸濃度，單位為納摩爾每毫升(ck—空白試樣溶液中由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算出的氨基酸濃度，單位為納摩爾每毫升(M—氨基酸的摩爾質(zhì)量，單位為克每摩爾(m1—試樣干物率，測(cè)定方法見GB/T8303。在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的6液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（第三法）樣品經(jīng)沸水浸泡提取后過濾，濾液經(jīng)稀釋后進(jìn)樣，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，外標(biāo)工作曲線法定量。6.2試劑或材料除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為優(yōu)級(jí)純。水為符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。水相濾膜。6.3.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-MS/MS)：配電噴霧離子源(ESI)。電子天平感量為和GB／T30987—20206.3.3高速離心機(jī)：最高轉(zhuǎn)速大于或等于15000r/min。移液器量程分別為6.5試驗(yàn)步驟L鹽酸溶液取濃鹽酸9.0mL,倒入預(yù)先盛有適量水的試劑瓶中，用水稀釋至1000mL,混勻。取乙腈加水混勻。6.5.1.3混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制稱取各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品適量（精確到0.01mg),用0.1mol/L鹽酸溶液溶解并配制成各氨基酸質(zhì)量濃度均為1000mg/L的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于0℃~4℃下保存，有效期為1個(gè)月。6.5.1.4混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)中間液配制準(zhǔn)確吸取1.0mL混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10mL容量瓶中，用0.1mol/L鹽酸溶液稀釋并定容至刻度，混勻，配制成質(zhì)量濃度均為100mg/L的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)中間液，現(xiàn)配現(xiàn)用。6.5.1.5混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制準(zhǔn)確吸取1.0mL混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)中間液于10mL容量瓶中，用50%乙腈溶液稀釋并定容至刻度，混勻，即得第一份標(biāo)準(zhǔn)溶液。將第一份標(biāo)準(zhǔn)溶液用50%乙腈溶液逐級(jí)稀釋，制成總共7個(gè)不同濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。7個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中21種氨基酸的質(zhì)量濃度均為10mg/L、現(xiàn)配現(xiàn)用。L甲酸銨溶液配制L甲酸銨-水溶液）配制準(zhǔn)確移取甲酸銨溶液加入水混勻L甲酸銨-乙腈溶液）配制準(zhǔn)確移取甲酸銨溶液加入乙腈試樣提取按4.5.4規(guī)定執(zhí)行。移取1mL提取液于10mL容量瓶中，用50%乙腈溶液稀釋并定容GB／T30987—2020至刻度，混勻，取2mL稀釋液于4℃14000r/min下離心10min,取適量上清液待測(cè)。液相色譜參考條件如下：色譜柱或同等性能的色譜柱；b)流動(dòng)相：具體梯度洗脫程序見表4;流速e)進(jìn)樣量：1μL。表4液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法洗脫程序時(shí)間/min流動(dòng)相A/%B/%00500質(zhì)譜參考條件如下：a)離子源：電噴霧離子源(ESI);b)掃描方式：正離子模式；c)檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);d)干燥氣、霧化氣、碰撞氣、鞘氣均為高純氮?dú)?；使用前?yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測(cè)要求，參考條件參見附錄C;e)噴霧電壓、碎裂電壓、碰撞氣能量等參數(shù)應(yīng)優(yōu)化至最佳靈敏度，參考條件參見附錄C。6.5.4.3繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線下，將系列混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液由低濃度到高濃度依次進(jìn)樣分析，以各氨基酸的定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。在上述色譜條種氨基酸的參考保留時(shí)間參見附錄C中表C.1,總離子流圖參見附錄B中圖B.3,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)圖參見附錄B中圖B.4~圖B.24。在相同儀器條件（見6.5.4.1、6.5.4.2)下，將待測(cè)液注入液相色譜-質(zhì)譜／質(zhì)譜儀，得到樣品溶液中各氨基酸的定量離子峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算含量。待測(cè)液中各氨基酸的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性范圍內(nèi)，如果含量超過標(biāo)準(zhǔn)工作曲線范圍，應(yīng)稀釋到合適濃度后再進(jìn)樣分析。下，如果樣品中待測(cè)物質(zhì)的色譜峰保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液GB／T30987—2020的相同，并且樣品譜圖中被測(cè)組分監(jiān)測(cè)離子的相對(duì)豐度和標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)豐度一致，允許偏差不超過表5規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在對(duì)應(yīng)的氨基酸。表5定性確定時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差相對(duì)離子豐度/%>50>20~50>10~20≤10允許的相對(duì)偏差/%±20±25±30±50方法定量限參見附錄A中表A.1。6.6試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理樣品中各游離氨基酸含量的計(jì)算見式(3):犿×犿1犿×犿1式中：犞—試樣總體積，單位為毫升(—試樣干物率，測(cè)定方法見GB/T8303。在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的GB／T30987—2020附錄A（資料性附錄）氨基酸化合物信息及定量限氨基酸化合物信息及定量限見表A.1。表A.1氨基酸化合物信息及定量限序號(hào)中文名稱英文簡(jiǎn)寫CAS號(hào)分子式相對(duì)分子質(zhì)量定量限/(μg第一法第二法第三法1丙氨酸Ala56-41-72精氨酸1119-34-23天冬酰胺Asn70-47-34天冬氨酸56-84-85胱氨酸56-89-36γ-氨基丁酸GABA56-12-27谷氨酰胺Gln56-85-98谷氨酸Glu56-86-09甘氨酸Gly56-40-6組氨酸His5934-29-2異亮氨酸Ile73-32-5亮氨酸Leu61-90-5賴氨酸Lys657-27-2蛋氨酸Met63-68-3苯丙氨酸Phe63-91-2脯氨酸Pro147-85-3絲氨酸56-45-1茶氨酸The3081-61-6蘇氨酸Thr72-19-5酪氨酸Tyr60-18-4纈氨酸Val72-18-4GB／T30987—2020附錄B（資料性附錄）21種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜圖21種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的第一法色譜圖見圖B.1,第二法色譜圖見圖B.2,第三法總離子流圖見圖B.3,各氨基酸的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)圖見圖B.4~圖B.24。L，其余氨基酸濃度均為100L）L，其余氨基酸濃度均為50L）GB／T30987—2020說明：1—Phe;2—Ile;3—Leu;4—Met;6—Val;7—Pro;8—GABA;9—The;10—Ala;11—Thr;13—Gln;14—Ser;15—Asn;16—Glu; 18—His; 圖B.4p的MRM圖圖B.5Ile的MRM