GBT 34750-2017 副豬嗜血桿菌檢測方法

中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局I1TE:Tris-EDTA緩沖液(Tris-ED24.20.2mLPCR薄壁管或八聯(lián)管。5.1TSA培養(yǎng)基和TSB培養(yǎng)基(見附錄A)。5.2NAD貯存液(見附錄A),2℃~8℃條件下保存。5.3革蘭氏染色試劑：含草酸銨結(jié)晶紫染液、盧戈氏(Lugol)碘液、95%乙醇和沙黃(蕃紅)染液，常溫條件下保存。5.4葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖5.53%過氧化氫、0.8%磺胺酸冰醋酸溶液、0.5%α-萘胺乙醇溶液、0.1%鹽酸二甲基對苯二胺(見附錄A),常溫條件下保存。5.6消化液I和TE緩沖液(見附錄B),常溫條件下保存。5.71×TAE核酸電泳緩沖液、酚-氯仿-異戊醇混合液(25+24+1)、0.01mol/L(pH7.2)的PBS、液等試劑(見附錄B),6×電泳上樣緩沖液，75%乙醇，以上試劑2℃~8℃條件下保存。5.8組織懸液、消化液Ⅱ(見附錄B),異丙醇，DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，置-20℃保存。5.9陽性對照、陰性對照(見附錄B)。5.11副豬嗜血桿菌巢式PCR檢測反應(yīng)體系(見附錄D)。5.12副豬嗜血桿菌實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增用上、下游引物及探針序列(見附錄C。5.13副豬嗜血桿菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測反應(yīng)體系(參見附錄E)。6細(xì)菌分離與鑒定6.1樣品的采集無菌采集疑似副豬嗜血桿菌感染病死豬的肺臟心臟、腦等新鮮組織，胸腔、腹腔、心包積液或關(guān)節(jié)液，抗凝血等樣品。采集或處理的樣品在2℃~8C條件下保存應(yīng)不超過24h。采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。6.2分離培養(yǎng)6.2.1在生物安全柜中用接種環(huán)無菌蘸取樣品劃線接種于TSA固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h~48h,使之形成菌落，以供鑒定用。的小菌落，在TSA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線接種純培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24h~48h后，出現(xiàn)上述小菌落。6.3涂片染色鏡檢6.3.1涂片在載玻片上滴加1～2滴滅菌蒸餾水后，挑取純培養(yǎng)的小菌落與滅菌蒸餾水混勻并涂成薄菌膜。6.3.2干燥將涂片于空氣中自然晾干。6.3.3固定將已干燥的載玻片涂面朝上，在酒精燈火焰上通過5次～6次進(jìn)行固定。6.3.4染色采用革蘭氏染色法進(jìn)行染色，具體操作按照革蘭氏染色試劑盒說明書進(jìn)行，置1000倍(10×100)光學(xué)顯微鏡下觀察。6.3.5鏡檢副豬嗜血桿菌為革蘭氏染色陰性短桿狀或球桿狀小桿菌，菌體大小不等，約0.5μm×347副豬嗜血桿菌巢式PCR檢測7.1.1樣品的采集和處理采取有明顯病變的肺臟、心臟、腦等新鮮組織樣品。用無菌剪刀和鑷子剪取待檢樣品0.5g左右于組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨，加入0.3mL～0.5mLPBS混勻，將組織懸液轉(zhuǎn)入無菌離心管用無菌注射器采集胸腔、腹腔積液或關(guān)節(jié)液2mL～3mL,轉(zhuǎn)至無菌離心管中，編號備用。用無菌注射器先吸人抗凝劑(阿氏液)2mL～3mL,自耳靜脈或前腔靜脈采集等量血液，快速混勻用無菌滴頭吸取增菌培養(yǎng)物500μL于無菌離心管中)編號備用。采集或處理的樣品在2C=8℃條件下保存應(yīng)不超過24h。采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。7.2.1取1.5mL無菌離心管，于各管中分別加入待測樣品、陰性對照、陽性對照各100pL,再加入500μL消化液I和10yL消化液Ⅱ,吸頭反復(fù)吸打混勻(一份樣品換用一個(gè)吸頭);置55℃水浴7.2.2分別加入500μL酚-氯仿異戊醇混合液，混勻，于4℃條件下12000r/min離心10min。7.2.3分別吸取離心后的上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5mL無菌離心管中(注意不要碰到中間層),加入等體積-20℃預(yù)冷的異丙醇，混勻，室溫放置15min。7.2.44℃條件下12000r/min離心15min(離心管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置)。輕輕倒去上清液，倒置于吸水紙上，吸干液體，不同樣品應(yīng)在吸水紙不同地方吸干。加入700μL75%乙醇，輕輕7.2.54℃條件下12000r/min離心5min(離心管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置)。輕輕倒去上清7.2.64℃條件下12000r/min離心30s,將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量將其吸干，一份樣品換用一個(gè)吸頭，吸頭不要碰到有沉淀一面，真空抽干3min~5min或室溫干燥10min。7.2.7加入10μLTE緩沖液，輕輕混勻，溶解DNA,2000r/min離心5s,置-20℃凍存?zhèn)溆谩?.2.8樣品DNA的制備可采用上述提取方法也可采用商品化的試劑盒提取。572℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后取出置于2℃~8℃條件下保存。8.2樣品DNA的制備68.3.1在檢測區(qū)配制與8.2中相同數(shù)量的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系，向每管中加入8.2中相應(yīng)DNA7A.1.1稱取TSA40g,加入940mL蒸餾水，充分搖勻后加熱至充分溶解，121℃高壓蒸汽滅菌2℃~8℃條件下保存。8NaCl終濃度100mmol/L。9引物名稱濃度/(μmol/L)引物序列擴(kuò)增片段大小第一輪PCR擴(kuò)增上游引物P1第一輪PCR擴(kuò)增下游引物P2第二輪PCR擴(kuò)增上游引物P3引物名稱濃度/(μmol/L)引物序列擴(kuò)增片段大小實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增上游引物實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增下游引物實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增MGB探針FAM-5'-AGGGTGCGAGCGT-檢測反應(yīng)體系組成見表D.1。PCR反應(yīng)體系I20管(23pL/管)PCR反應(yīng)體系Ⅱ陽性對照陰性對照消化液I消化液ⅡD.2.1PCR反應(yīng)體系I成分：10×PCR緩沖液(含Mg2+),2.5pL;2.5mmol/LdNTPs,2pL;P1,D.2.2PCR反應(yīng)體系Ⅱ成分：10×PCR緩沖液(含Mg2+),2.5pL;2.5mmol/LdNTPs,2μL;P3,D.3.3請按照說明書要求分別在4℃、-20℃保存不同的試劑，試劑盒有效期為6個(gè)月。使用時(shí)在室消化液I消化液Ⅱ陰性對照陽性對照E.3.3按照說明書要求分別在2℃~8℃、-20℃保