(高清版)GB∕T 37873-2019 合成基因質(zhì)量評(píng)價(jià)通則

G30中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)合成基因質(zhì)量評(píng)價(jià)通則Gv2019-08-30發(fā)布2019-08-30實(shí)施國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局GB／T37873—2019前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語(yǔ)和定義 4質(zhì)量要求 4.5序列一致性 5評(píng)價(jià)方法 5.1樣品與試劑 5.4完整性檢測(cè) 5.5序列一致性檢測(cè) 附錄A（資料性附錄）合成基因電泳圖 附錄B（資料性附錄）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)方法 ⅠⅢGB／T37873—2019本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：深圳華大生命科學(xué)研究院（原深圳華大基因研究院）、中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院、深圳華大基因科技有限公司、青島華大基因研究院。1GB／T37873—2019合成基因質(zhì)量評(píng)價(jià)通則本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了合成基因的術(shù)語(yǔ)和定義、質(zhì)量要求、評(píng)價(jià)方法。的質(zhì)量評(píng)價(jià)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T34796—2017水溶液中核酸的濃度和純度檢測(cè)紫外分光光度法3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1合成基因用生物化學(xué)方法，按照設(shè)定的核苷酸序列人工合成的雙鏈DNA。3.2測(cè)序?qū)NA分子的核苷酸排列順序的測(cè)定，也就是測(cè)定組成DNA分子的A、T、G、C的排列順序。常用的方法有桑格-庫(kù)森法和馬克薩姆-吉爾伯特法等。,定義3.3序列比對(duì)比較兩個(gè)或兩個(gè)以上核苷酸或者氨基酸序列間相似性的過程。[GB/T29859—2013,定義2.2.1]4質(zhì)量要求合成基因的DNA序列，在符合國(guó)際基因合成聯(lián)盟(IGSC)生物安全要求條件下，其質(zhì)量要求，包括DNA純度、總量、完整性與序列一致性。值為條件下之間且符合合成基因2GB／T37873—2019合成基因DNA完整性，反映了合成基因DNA的降解情況。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳圖中明亮條帶大小與目標(biāo)條帶一致，且亮度集中程度高，明亮條帶間的亮度低，表明DNA完整性高。合成基因主要包括線性的合成基因片段與環(huán)狀的合成基因質(zhì)粒兩種類型，要求如下：a)合成基因片段：條帶單一，無(wú)其他雜質(zhì)條帶；b)合成基因質(zhì)粒：存在目標(biāo)條帶且條帶明亮。酶切后，存在與合成基因DNA大小一致的條帶，參見附錄A。4.5序列一致性合成基因DNA的測(cè)序序列與設(shè)定序列完全匹配。5評(píng)價(jià)方法基于生物化學(xué)合成的合成基因樣品，應(yīng)于-20℃貯存。實(shí)驗(yàn)室使用的試劑為不含DNA酶的分析純化學(xué)試劑或生化試劑。實(shí)驗(yàn)室配制的試劑應(yīng)有明晰標(biāo)識(shí)，包括試劑名稱、濃度、配制時(shí)間等。5.2純度檢測(cè)不在此范圍時(shí)，應(yīng)對(duì)合成基因DNA溶液進(jìn)行稀釋或濃縮，以達(dá)到檢測(cè)值范圍。首先用溶解合成基因樣品相同的緩沖液（如去離子水、TE緩沖液）校正紫外分光光度計(jì)，分別在和樣品測(cè)定和波長(zhǎng)下吸光值。在分光光度純度分析中，核酸在260nm處達(dá)到最大吸收峰，蛋白質(zhì)、其他多糖雜質(zhì)分別在280nm根據(jù)分光光度計(jì)測(cè)得的OD260,按照式(1)計(jì)算樣本中DNA的質(zhì)量濃度(ρ),按照式(2)計(jì)算樣本中式中：的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/mL);N—樣本稀釋倍數(shù)；F—轉(zhuǎn)換因子，雙鏈DNA轉(zhuǎn)換因子為50μg/mL。3GB／T37873—2019式中：總質(zhì)量，單位為微克(μg);的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/5.4完整性檢測(cè)對(duì)合成基因DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析，參見附錄B。利用限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)合成基因DNA進(jìn)行酶切鑒定。5.5序列一致性檢測(cè)對(duì)合成基因DNA樣品進(jìn)行測(cè)序分析，得到合成基因的序列信息，并與設(shè)定序列進(jìn)行序列比對(duì)，形成測(cè)序結(jié)果比對(duì)圖。4GB／T37873—2019附錄A（資料性附錄）合成基因電泳圖合成基因電泳圖見圖A.1~圖A.2。圖中所示為不同長(zhǎng)度質(zhì)粒DNA的電泳圖，其中a)圖中樣品為載有~2kb長(zhǎng)度合成基因的圖中樣品為載有~5kb長(zhǎng)度合成基因的質(zhì)粒DNA;c)圖中樣品為載有長(zhǎng)度合成基因的質(zhì)粒DNA;d)圖中樣品為載有~13kb長(zhǎng)度合成基因的質(zhì)粒DNA。圖中注：在質(zhì)粒提取過程中，由于機(jī)械力、酸堿度、試劑等原因，可能使質(zhì)粒DNA鏈發(fā)生斷裂，所提取的質(zhì)粒通常呈現(xiàn)三種構(gòu)型，包括超螺旋質(zhì)粒DNA、線性質(zhì)粒DNA、開環(huán)質(zhì)粒DNA。a)圖中明亮的條帶為超螺旋質(zhì)粒DNA,較暗條帶為開環(huán)質(zhì)粒DNA;b)圖中明亮條帶為開環(huán)質(zhì)粒DNA;和d)圖中明亮條帶為開環(huán)質(zhì)粒DNA,較暗條帶為線性質(zhì)粒DNA。圖A.1質(zhì)粒DNA電泳圖(1%瓊脂糖凝膠）圖中所示為載有不同長(zhǎng)度合成基因的質(zhì)粒酶切電泳圖，其中a)圖中樣品為合成基因DNA長(zhǎng)約246bp,載體長(zhǎng)約的質(zhì)粒酶切圖中樣品為合成基因長(zhǎng)約載體長(zhǎng)約的質(zhì)粒酶切圖中樣品為合成基因長(zhǎng)約載體長(zhǎng)約的質(zhì)粒酶切圖中的A其中圖中為圖中為圖A.2合成基因酶切電泳圖(1%瓊脂糖凝膠）GB／T37873—2019附錄B（資料性附錄）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)方法按表B.1選擇凝膠濃度，計(jì)算后稱取相應(yīng)質(zhì)量的瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入適量的1×TAE電泳緩沖液。置于微波爐中加熱至完全溶化，加入核酸染料（如溴化乙錠等）。水平放置托盤于制膠模具內(nèi)，在一端插好梳子，緩慢倒入已冷至60℃左右的膠液，使之形成均勻水平的膠面。凝膠凝固后，緩慢拔起梳子，放進(jìn)電泳槽內(nèi)，使加樣孔端置于陰極端。在槽內(nèi)加入1×TAE電泳緩沖液直至液面覆蓋過膠面。表B.1瓊脂糖凝膠電泳分離范圍瓊脂糖凝膠濃度/%可分辨的線性DNA大小范圍/kb045~60070.8~1000.4~650.2~40.2~3200.1~3把待檢測(cè)樣品，按以下量混勻，用移液槍加至凝膠的加樣孔中。1μL加樣緩沖液(6×)+5μL待測(cè)樣品總量B.2凝膠電泳接通電泳儀和電泳槽并接通電源