蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究方法

關(guān)于蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究方法一、蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)概念

蛋白質(zhì)組澳大利亞學(xué)者Williams和Wilkins于1994年首先提出protein+genome=proteome一個(gè)基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)機(jī)體的基因所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)第2頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)組是：對(duì)應(yīng)于基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體，不是局限于一個(gè)或幾個(gè)蛋白質(zhì)。同一基因組在不同細(xì)胞、不同組織中的表達(dá)情況各不相同。在空間和時(shí)間上動(dòng)態(tài)變化著的整體。第3頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月

蛋白質(zhì)組學(xué)

旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式與功能模式從整體的角度分析、鑒定細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、表達(dá)水平與修飾狀態(tài),了解蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與大分子之間的相互作用與聯(lián)系,揭示蛋白質(zhì)的功能與細(xì)胞生命活動(dòng)的規(guī)律第4頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月二、蛋白組學(xué)的研究?jī)?nèi)容蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容主要有兩個(gè)方面：

結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)和功能蛋白質(zhì)組學(xué)

結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)(Structuralproteomics)主要是蛋白質(zhì)表達(dá)模式的研究，包括蛋白質(zhì)氨基酸序列分析及空間結(jié)構(gòu)的解析、種類(lèi)分析及數(shù)量確定；

功能蛋白質(zhì)組學(xué)(functionalproteomics)主要是蛋白質(zhì)功能模式的研究，

包括蛋白質(zhì)的功能及蛋白質(zhì)間的相互作用。第5頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)的各級(jí)結(jié)構(gòu)第6頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月0.50nm0.54nm氫鍵α-碳原子側(cè)鏈反平行俯視側(cè)視第7頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月所以，蛋白質(zhì)組學(xué)研究是對(duì)不同時(shí)間和空間發(fā)揮功能的特定蛋白質(zhì)群體的研究,從蛋白質(zhì)水平上探索蛋白質(zhì)作用模式、功能機(jī)理、調(diào)節(jié)控制以及蛋白質(zhì)群體內(nèi)相互作用,為臨床診斷、病理研究、藥物篩選、新藥開(kāi)發(fā)、新陳代謝途徑研究等提供理論依據(jù)和基礎(chǔ).第8頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月三、蛋白質(zhì)組研究的理論基礎(chǔ)從mRNA表達(dá)水平并不能預(yù)測(cè)蛋白表達(dá)水平。用基因表達(dá)連續(xù)分析法(SAGE)研究對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期啤酒酵母的80個(gè)基因，結(jié)果沒(méi)有發(fā)現(xiàn)翻譯和轉(zhuǎn)錄豐度有明顯相關(guān)；對(duì)某些基因，相同的mRNA豐度翻譯成蛋白的量的差異可達(dá)50倍；而相等的蛋白量可由豐度相差40倍的mRNA轉(zhuǎn)錄而來(lái)。這說(shuō)明轉(zhuǎn)錄和翻譯水平對(duì)蛋白的含量有幾乎相同的重要性。第9頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)修飾和加工并非必須來(lái)自基因序列。蛋白質(zhì)在翻譯后可有多種調(diào)節(jié)方式，如糖基化、磷酸化、異戊二烯化、?；饔玫取４送?，許多蛋白質(zhì)只有與其它分子結(jié)合后才有功能，這種修飾是動(dòng)態(tài)的、可逆的。第10頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)組動(dòng)態(tài)地反映生物系統(tǒng)所處的狀態(tài)。細(xì)胞周期的特定時(shí)期、分化的不同階段、對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)狀況、溫度、應(yīng)激和病理狀態(tài)等其相應(yīng)的蛋白質(zhì)組之間存在差異。對(duì)其中蛋白質(zhì)合成、降解、加工、修飾的調(diào)控過(guò)程,只有通過(guò)蛋白質(zhì)的直接分析才能提示。第11頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)組研究的理論基礎(chǔ)DNAmRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯基因蛋白質(zhì)細(xì)胞特異性基因表達(dá)生理狀態(tài)溫度應(yīng)激狀態(tài)培養(yǎng)條件藥物作用數(shù)量有限結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定復(fù)雜性多變性直接反應(yīng)生命現(xiàn)象復(fù)雜的調(diào)控第12頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月四、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究方法蛋白質(zhì)組表達(dá)模式（expressionprofile）：研究蛋白質(zhì)組的組成成分支撐技術(shù)主要有：雙向凝膠電泳(2Delectrophoresis)、以質(zhì)譜(massspectrograph)為代表的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù),以及生物信息學(xué)(Bioinformatics)分析。第13頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月ProteinsampleImageanalysisProteiningelProteinonmembraneProteininsolution2-DPAGEExcisionBlottingElutionPartialdegradationPeptidemixtureMassofproteinN-terminalsequenceMSEdmandegradationPeptidemassfingerprintPeptidesequenceMS/MSdataDatabasesearchingNovelorpreviouslystudiedproteinCharacterizationofpost-translocationmodifications蛋白質(zhì)組的分析流程第14頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月（一）蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備通常可采用細(xì)胞或組織中的全蛋白質(zhì)組分進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。也可以進(jìn)行樣品預(yù)分級(jí)，即將細(xì)胞或組織中的全體蛋白質(zhì)分成不同部分，分別進(jìn)行研究。樣品預(yù)分級(jí)主要作用在于提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量和檢測(cè)靈敏度。

第15頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月樣品預(yù)分級(jí)的主要方法蛋白質(zhì)溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白質(zhì)定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白質(zhì)細(xì)胞器定位：線粒體、高爾基體、葉綠體等第16頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月三

種

常

用

的

植

物

蛋

白

提

取

方

法第17頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月（二）蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離雙向凝膠電泳(two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)，是目前蛋白質(zhì)組研究中最有效的分析鑒定技術(shù)之一。由兩相組成：

第一相：等電聚焦凝膠電泳根據(jù)蛋白質(zhì)電荷差異

第二相：SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)蛋白質(zhì)分子量差異第18頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月二維雙向電泳(2Delectrophoresis)

基本原理第一向在高壓電場(chǎng)下對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行等電聚焦(IEF),再在第一向垂直方向上進(jìn)行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)。IEF-focusedproteinsSDS-chargedproteinsinIPGstripSDS-chargedproteinsresolvedaccordingtosizesinSDSgel第19頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月2-DE原理示意圖

第20頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月2-DE分析的基本步驟蛋白質(zhì)溶解變性還原去除蛋白質(zhì)雜志利用不同pK固定化電解質(zhì)可配置不同pH范圍的凝膠或利用商業(yè)化軟件設(shè)計(jì)

第一相電泳：IPG－IFE平衡第二相電泳：SDS－PAGE考馬斯亮藍(lán)染色、銀染色、銅染色樣品制備IPG膠制備雙相電泳染色第21頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月2-DE的操作SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS

SDSpolyacrylamidegelelectrophoresisSDS帶負(fù)電荷，破壞蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵，使之形成單個(gè)亞基。SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物為雪茄形的長(zhǎng)橢圓棒，消除或掩蓋了不同種類(lèi)蛋白質(zhì)間原有電荷的差異。SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳中的遷移率只是蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)有關(guān)。第22頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月

制膠：試劑分離膠（ml）濃縮膠（ml）1.5MTris-HCl（pH8.9）2.50——30%單體3.501.0010%SDS0.100.10蒸餾水3.846.340.5MTris-HCl（pH6.8）——2.5010%過(guò)硫酸銨AP0.050.05四甲基乙二胺TEMED0.010.01第23頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月

樣品處理：Loadingbuffer40%甘油溴酚蘭SDSβ-巰基乙醇0.5MTris-HCl（pH6.8）50ul樣品50ul(2×)LoadingbufferMix950C/5min第24頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月電泳槽上電極緩沖液下電極緩沖液樣品槽上樣器陰極陽(yáng)極電泳方向聚丙烯酰胺凝膠板第25頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月第26頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)點(diǎn)的染色凝膠上的蛋白質(zhì)點(diǎn)染色常用方法有銀染法、考馬斯亮藍(lán)染色法,另外還采用以下染色試劑:麗春紅S、氨基黑、印度墨、35S硫脲銀、膠態(tài)金、咪唑鋅等.銀染法廣泛用于雙向凝膠電泳分離后蛋白質(zhì)點(diǎn)的染色,該法靈敏度為4ng,但對(duì)質(zhì)譜測(cè)定有干擾,必須先脫銀.考馬斯亮藍(lán)染色法可用于膠上或膜上蛋白質(zhì)點(diǎn)染色,該法操作方便、重現(xiàn)性好,同銀染法一樣,質(zhì)譜測(cè)定時(shí)也必須先脫色.第27頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月2-DE圖像分析技術(shù)通過(guò)2-DE得到的蛋白質(zhì)分離圖譜，需要經(jīng)過(guò)攝像或掃描轉(zhuǎn)換為以像素為基礎(chǔ)的、具有不同灰度強(qiáng)弱和一定邊界方向的斑點(diǎn)電腦信號(hào)。2-DE獲得的蛋白質(zhì)圖譜第28頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月圖像采集斑點(diǎn)檢測(cè)背景消減獲得蛋白質(zhì)相關(guān)信息圖像內(nèi)及圖像間的比較2-DE圖像分析軟件包操作過(guò)程：第29頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月2-DE技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：可以同時(shí)直觀顯示數(shù)千個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)；缺點(diǎn)：

極酸、極堿性蛋白質(zhì)，疏水性蛋白質(zhì)，極大蛋白質(zhì)、極小蛋白質(zhì)以及低豐度蛋白質(zhì)用此種技術(shù)難于有效分離；

膠內(nèi)酶解過(guò)程費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，難于與質(zhì)譜聯(lián)用實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化；丙烯酰胺有神經(jīng)毒作用。第30頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月新型非凝膠技術(shù)液相色譜法(liquidchromatography，LC)毛細(xì)管電泳(capillaryelectrophoresis，CE)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）蛋白質(zhì)混合物直接通過(guò)液相色譜分離以代替2-DE的分離，然后進(jìn)入MS系統(tǒng)獲得肽段分子量，再通過(guò)串聯(lián)MS技術(shù)，得到部分序列信息，最后通過(guò)計(jì)算機(jī)聯(lián)網(wǎng)查詢、鑒定蛋白質(zhì)。多維色譜技術(shù)（LC/LC-MS/MS）多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)第31頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月（三）蛋白質(zhì)組研究中的樣品分析鑒定傳統(tǒng)方法：蛋白質(zhì)微量測(cè)序氨基酸組成分析新型蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)

——質(zhì)譜（MS）法基本原理：樣品分子離子化后，根據(jù)離子間質(zhì)荷比（m/z）的差異來(lái)分離并確定樣品的分子量。

第32頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月主要質(zhì)譜類(lèi)型基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI-TOFMS）電噴霧質(zhì)譜（electrosprayionizationmassspectrometry，ESI-MS）質(zhì)譜分析目前是經(jīng)2D分離的蛋白質(zhì)鑒定的核心技術(shù)第33頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月第34頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月第35頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月（四）蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué)2D-PAGE分離的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)識(shí)別與鑒定后，用圖像掃描儀數(shù)字化2D-PAGE膠上分離的蛋白質(zhì)，在蛋白圖形工作站上，應(yīng)用軟件，對(duì)數(shù)字化的蛋白點(diǎn)的分布部位，斑點(diǎn)面積和灰階、背景過(guò)濾、2-DE匹配與比較，建立參考圖譜；對(duì)蛋白質(zhì)鑒定的數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索是蛋白質(zhì)組信息學(xué)的一大特點(diǎn)；第36頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月當(dāng)用2D-PAGE分離一個(gè)蛋白質(zhì)組后,應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定能夠刻劃蛋白質(zhì)屬性的各種屬性參數(shù)(attributeparameter),同時(shí)把已有數(shù)據(jù)庫(kù)(如OWL或dbEST)中的每一個(gè)序列轉(zhuǎn)換成相應(yīng)屬性參數(shù),形成屬性化的數(shù)據(jù)庫(kù)。然后以此屬性參數(shù),形成屬性化的蛋白質(zhì)或核酸數(shù)據(jù)庫(kù)。若搜索不到,那可能是新的蛋白質(zhì),就須采用傳統(tǒng)的生化鑒定。第37頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（一）蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)（二）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（三）蛋白質(zhì)直系同源簇?cái)?shù)據(jù)庫(kù)（四）DIP數(shù)據(jù)庫(kù)瑞士的SWISS-PROT擁有目前世界上最大、種類(lèi)最多的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)目前應(yīng)用最普遍的數(shù)據(jù)庫(kù)是NRDB和dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)是蛋白質(zhì)組研究水平的標(biāo)志和基礎(chǔ)第38頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的應(yīng)用（一）序列比較序列兩兩對(duì)比多序列對(duì)比（二）臨床診斷（三）腫瘤治療藥物的開(kāi)發(fā)

第39頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月第40頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月五、蛋白質(zhì)組功能模式的研究方法（一）蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究（二）蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)－核酸間相互作用研究第41頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的形式

1、蛋白質(zhì)亞基的聚合

2、交叉聚合

3、分子識(shí)別

4、分子的自我裝配

5、多酶復(fù)合體第42頁(yè),共47頁(yè)，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)之間的相互作用力