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文檔簡(jiǎn)介
木瓜蛋白酶活力測(cè)定方法木瓜蛋白酶簡(jiǎn)介木瓜蛋白酶,來(lái)源于木瓜的一種蛋白水解酶。廣泛存在于番木瓜的根、莖、葉和果實(shí)內(nèi),其中在未成熟的乳汁中含量最豐富。木瓜蛋白酶簡(jiǎn)介木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸,屬于巰基蛋白酶具有酶活高、熱穩(wěn)定性好、天然、衛(wèi)生、安全等特點(diǎn)在食品、醫(yī)藥、飼料、日化、皮革及紡織等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用。在食品生產(chǎn)中,木瓜蛋白酶主要用于啤酒抗寒、肉類軟化、餅干松化。木瓜蛋白酶的應(yīng)用啤酒抗寒
木瓜蛋白酶在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用
木瓜蛋白酶能夠水解啤酒中的蛋白質(zhì),避免啤酒冷藏后引起的渾濁,通常用于啤酒抗寒。木瓜蛋白酶能夠水解肌肉蛋白和膠原蛋白,使肉類軟化,通常用于肉類產(chǎn)品的軟化,增加其食用品質(zhì)。肉類嫩化福林-酚法和紫外分光光度法其中紫外分光光度法因其操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好被廣泛使用。木瓜蛋白酶活力測(cè)定方法木瓜蛋白酶活力測(cè)定方法--紫外分光光度法測(cè)定原理蛋白酶在一定溫度、pH條件下,水解酪蛋白底物產(chǎn)生酪氨酸,一定時(shí)間后,加入三氯乙酸終止酶反應(yīng),將未水解的底物沉淀出來(lái),過(guò)濾去除,濾液中的絡(luò)氨酸對(duì)紫外光有吸收,用分光光度法在275nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度,以酪氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,依據(jù)濾液吸光度值計(jì)算酶活力。測(cè)定依據(jù):中國(guó)醫(yī)藥保健品進(jìn)出口商會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/CCCMHPIE1.18—2016,木瓜蛋白酶活力的測(cè)定儀器和設(shè)備分析天平,感量0.01mg恒溫水浴鍋(37±0.2°C)。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)超聲波清洗儀器移液器1mL、5mL溫度計(jì)(精度0.1°C)容量瓶,50ml具塞比色管,25ml試劑溶液配制0.1mol/L的鹽酸溶液酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5mg/ml)酶稀釋液(pH=5.5)1%的三氯乙酸溶液酪蛋白底物溶液(pH=7.0)磷酸氫二鈉溶液(0.05mol/L)依據(jù)T/CCCMHPIE1.18—2016,木瓜蛋白酶活力測(cè)定方法,在測(cè)定前完成試劑溶液的配制待測(cè)樣品溶液配制
減量法稱取試樣40mg(精確至0.01mg),加入50mL容量瓶中,加少量酶稀釋液,超聲溶解,再加酶稀釋液定容至刻度,搖勻;以酶稀釋液為對(duì)照,在波長(zhǎng)275nm下,測(cè)定其吸光度值;根據(jù)不同品種酶活力高低,吸取適量試樣溶液加入容量瓶中,加酶稀釋液稀釋至適當(dāng)濃度,使其測(cè)定的吸光度值在0.2~0.6范圍內(nèi),充分搖勻,供測(cè)試用。待測(cè)酶樣品溶液需要現(xiàn)配現(xiàn)用,并且在60min內(nèi)使用。先準(zhǔn)備好4支25mL的具塞比色管,其中三支作為平行樣品測(cè)定,1支作空白樣品測(cè)定。測(cè)定前做好標(biāo)號(hào)-“0”、“1”、“2”、“3”酶樣品測(cè)定步驟先將酪蛋白溶液放入37°C±0.2°C水浴鍋預(yù)熱5min,按下列程序分五步完成操作。試樣測(cè)定需要做三個(gè)平行樣,同時(shí)做酶空白。酶樣品測(cè)定測(cè)定流程酶樣品測(cè)定第一步,分別取待測(cè)酶樣品溶液1.0mL,加入4支25ml的比色管中,放入水浴鍋,37°C水浴,保溫10min;第二步,在“1、2、3”號(hào)樣品具塞比色管中加入預(yù)熱后的酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00mL;同時(shí)在“0”號(hào)酶空白比色管中加入5.00mL三氯乙酸溶液;同時(shí)將4支比色管放入水浴鍋,37°C水浴,記錄酶反應(yīng)開(kāi)始時(shí)間。酶樣品測(cè)定第三步,酶精確分解反應(yīng)10min后,立即向三支樣品比色管中加入5.00mL三氯乙酸溶液,使其反應(yīng)終止,搖勻;同時(shí)在“0”號(hào)酶空白比色管中加入預(yù)熱后的酪蛋白溶液5.00mL,將4支比色管再次放入水浴鍋,37°C水浴,保持40min酶樣品測(cè)定第四步40min后,取出比色管,在室溫下用干燥的濾紙過(guò)濾。收集濾液到50mL的燒杯中;酶樣品測(cè)定第五步,上機(jī)測(cè)定吸光度。打開(kāi)紫外分光光度計(jì)預(yù)熱,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)為275nm;取濾液,用蒸餾水作參比,在275nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品溶液吸光度值和酶空白溶液的吸光度值。其酶樣品實(shí)際吸光度值為樣品測(cè)定吸光度值減去酶空白吸光度值。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制表1:酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制管號(hào)酪氨酸標(biāo)液的濃度(ug/ml)0.5mg/ml酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積(ml)0.1mol/L的鹽酸溶液體積/ml0005011014922024833034745054551001040按下表配制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線系列濃度溶液,通過(guò)上機(jī)測(cè)定吸光度值,完成酪氨酸測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別吸取酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(C=0.5mg/ml)1、2、3、5、10mL于50mL容量瓶中,以鹽酸溶液定容,配制成濃度分別為10、20、30、50、100μg/mL的酪氨酸標(biāo)品溶液,于275nm處測(cè)定其吸光度,以標(biāo)品吸光度A為縱坐標(biāo),濃度C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。AC結(jié)果計(jì)算
從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出酶樣品吸光度值,按以下公式計(jì)算樣品吸光度計(jì)算公式式中:A——酶樣品吸光度A樣——酶樣品直測(cè)吸光度A空白——酶樣品空白吸光度結(jié)果計(jì)算從標(biāo)準(zhǔn)曲線圖上讀出酶樣品吸光度值所對(duì)應(yīng)的酪氨酸溶液的濃度,計(jì)算公式
式中:Ci—由標(biāo)準(zhǔn)曲線得吸光度A所對(duì)應(yīng)的酪氨
酸的濃度,μg/mLK—酶溶液稀釋倍數(shù)m—酶樣品稱樣量,mg11—比色管中溶液總體積,mL
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