《生物產(chǎn)品分析與檢驗(yàn)技術(shù)》課件-木瓜蛋白酶活力測(cè)定

木瓜蛋白酶活力測(cè)定方法木瓜蛋白酶簡(jiǎn)介木瓜蛋白酶，來(lái)源于木瓜的一種蛋白水解酶。廣泛存在于番木瓜的根、莖、葉和果實(shí)內(nèi)，其中在未成熟的乳汁中含量最豐富。木瓜蛋白酶簡(jiǎn)介木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，屬于巰基蛋白酶具有酶活高、熱穩(wěn)定性好、天然、衛(wèi)生、安全等特點(diǎn)在食品、醫(yī)藥、飼料、日化、皮革及紡織等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用。在食品生產(chǎn)中，木瓜蛋白酶主要用于啤酒抗寒、肉類軟化、餅干松化。木瓜蛋白酶的應(yīng)用啤酒抗寒

木瓜蛋白酶在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用

木瓜蛋白酶能夠水解啤酒中的蛋白質(zhì)，避免啤酒冷藏后引起的渾濁，通常用于啤酒抗寒。木瓜蛋白酶能夠水解肌肉蛋白和膠原蛋白，使肉類軟化，通常用于肉類產(chǎn)品的軟化，增加其食用品質(zhì)。肉類嫩化福林-酚法和紫外分光光度法其中紫外分光光度法因其操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好被廣泛使用。木瓜蛋白酶活力測(cè)定方法木瓜蛋白酶活力測(cè)定方法--紫外分光光度法測(cè)定原理蛋白酶在一定溫度、pH條件下，水解酪蛋白底物產(chǎn)生酪氨酸，一定時(shí)間后，加入三氯乙酸終止酶反應(yīng)，將未水解的底物沉淀出來(lái)，過(guò)濾去除，濾液中的絡(luò)氨酸對(duì)紫外光有吸收，用分光光度法在275nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度，以酪氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)濾液吸光度值計(jì)算酶活力。測(cè)定依據(jù)：中國(guó)醫(yī)藥保健品進(jìn)出口商會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/CCCMHPIE1.18—2016，木瓜蛋白酶活力的測(cè)定儀器和設(shè)備分析天平，感量0.01mg恒溫水浴鍋（37±0.2°C）。紫外可見分光光度計(jì)超聲波清洗儀器移液器1mL、5mL溫度計(jì)（精度0.1°C）容量瓶，50ml具塞比色管，25ml試劑溶液配制0.1mol/L的鹽酸溶液酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.5mg/ml）酶稀釋液（pH=5.5）1%的三氯乙酸溶液酪蛋白底物溶液（pH=7.0）磷酸氫二鈉溶液（0.05mol/L）依據(jù)T/CCCMHPIE1.18—2016，木瓜蛋白酶活力測(cè)定方法，在測(cè)定前完成試劑溶液的配制待測(cè)樣品溶液配制

減量法稱取試樣40mg（精確至0.01mg），加入50mL容量瓶中，加少量酶稀釋液，超聲溶解，再加酶稀釋液定容至刻度，搖勻；以酶稀釋液為對(duì)照，在波長(zhǎng)275nm下，測(cè)定其吸光度值；根據(jù)不同品種酶活力高低，吸取適量試樣溶液加入容量瓶中，加酶稀釋液稀釋至適當(dāng)濃度，使其測(cè)定的吸光度值在0.2～0.6范圍內(nèi)，充分搖勻，供測(cè)試用。待測(cè)酶樣品溶液需要現(xiàn)配現(xiàn)用，并且在60min內(nèi)使用。先準(zhǔn)備好4支25mL的具塞比色管，其中三支作為平行樣品測(cè)定，1支作空白樣品測(cè)定。測(cè)定前做好標(biāo)號(hào)-“0”、“1”、“2”、“3”酶樣品測(cè)定步驟先將酪蛋白溶液放入37°C±0.2°C水浴鍋預(yù)熱5min，按下列程序分五步完成操作。試樣測(cè)定需要做三個(gè)平行樣，同時(shí)做酶空白。酶樣品測(cè)定測(cè)定流程酶樣品測(cè)定第一步，分別取待測(cè)酶樣品溶液1.0mL，加入4支25ml的比色管中，放入水浴鍋，37°C水浴，保溫10min；第二步，在“1、2、3”號(hào)樣品具塞比色管中加入預(yù)熱后的酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00mL；同時(shí)在“0”號(hào)酶空白比色管中加入5.00mL三氯乙酸溶液；同時(shí)將4支比色管放入水浴鍋，37°C水浴，記錄酶反應(yīng)開始時(shí)間。酶樣品測(cè)定第三步，酶精確分解反應(yīng)10min后，立即向三支樣品比色管中加入5.00mL三氯乙酸溶液，使其反應(yīng)終止，搖勻；同時(shí)在“0”號(hào)酶空白比色管中加入預(yù)熱后的酪蛋白溶液5.00mL，將4支比色管再次放入水浴鍋，37°C水浴，保持40min酶樣品測(cè)定第四步40min后，取出比色管，在室溫下用干燥的濾紙過(guò)濾。收集濾液到50mL的燒杯中；酶樣品測(cè)定第五步，上機(jī)測(cè)定吸光度。打開紫外分光光度計(jì)預(yù)熱，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)為275nm；取濾液，用蒸餾水作參比，在275nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品溶液吸光度值和酶空白溶液的吸光度值。其酶樣品實(shí)際吸光度值為樣品測(cè)定吸光度值減去酶空白吸光度值。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制表1：酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制管號(hào)酪氨酸標(biāo)液的濃度（ug/ml）0.5mg/ml酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（ml）0.1mol/L的鹽酸溶液體積/ml0005011014922024833034745054551001040按下表配制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線系列濃度溶液，通過(guò)上機(jī)測(cè)定吸光度值，完成酪氨酸測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別吸取酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（C=0.5mg/ml）1、2、3、5、10mL于50mL容量瓶中，以鹽酸溶液定容，配制成濃度分別為10、20、30、50、100μg/mL的酪氨酸標(biāo)品溶液，于275nm處測(cè)定其吸光度，以標(biāo)品吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。AC結(jié)果計(jì)算

從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出酶樣品吸光度值，按以下公式計(jì)算樣品吸光度計(jì)算公式式中：A——酶樣品吸光度A樣——酶樣品直測(cè)吸光度A空白——酶樣品空白吸光度結(jié)果計(jì)算從標(biāo)準(zhǔn)曲線圖上讀出酶樣品吸光度值所對(duì)應(yīng)的酪氨酸溶液的濃度，計(jì)算公式

式中：Ci—由標(biāo)準(zhǔn)曲線得吸光度A所對(duì)應(yīng)的酪氨

酸的濃度，μg/mLK—酶溶液稀釋倍數(shù)m—酶樣品稱樣量，mg11—比色管中溶液總體積，mL