藥敏試驗方法簡介

關于藥敏試驗方法簡介抗微生物治療面臨的困境抗藥性問題始終存在細菌不斷獲得新的耐藥機制以往對付耐藥性的策略收效不顯第2頁,共70頁，星期六，2024年，5月第3頁,共70頁，星期六，2024年，5月一、

抗菌藥物敏感試驗（AST）預測抗菌治療的效果；指導抗菌藥物的臨床應用；發(fā)現(xiàn)或提示細菌耐藥機制的存在，指導合理用藥，避免產(chǎn)生或加重細菌的耐藥；監(jiān)測細菌耐藥性，分析耐藥菌的變遷，掌握耐藥菌感染的流行病學，以控制和預防耐藥菌感染的發(fā)生和流行。第4頁,共70頁，星期六，2024年，5月（1）抗菌藥物的選擇在我國主要遵循臨床實驗室標準化委員會（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI）制定的抗菌藥物選擇原則A組：對特定菌群常規(guī)測試并報告的藥物B組：可常規(guī)測試、選擇性報告的藥物C組：替代性或補充性藥物U組：僅用于泌尿道感染的抗菌藥物第5頁,共70頁，星期六，2024年，5月葡萄球菌屬抗菌藥物藥敏試驗推薦分組第6頁,共70頁，星期六，2024年，5月腸桿菌科抗菌藥物敏感試驗推薦分組第7頁,共70頁，星期六，2024年，5月假單胞菌屬的抗菌藥物藥物敏感推薦分組第8頁,共70頁，星期六，2024年，5月不動桿菌屬的抗菌藥物藥敏試驗推薦分組第9頁,共70頁，星期六，2024年，5月

腸球菌屬抗菌藥物藥敏試驗推薦分組

第10頁,共70頁，星期六，2024年，5月肺炎鏈球菌抗菌藥物藥敏試驗推薦分組第11頁,共70頁，星期六，2024年，5月藥敏試驗的折點亦遵照每年最新公布的CLSI標準進行，分為敏感（S）、耐藥（R）和中介（I）。第12頁,共70頁，星期六，2024年，5月敏感：分離菌株能被測試藥物使用推薦劑量時在感染部位通?？蛇_到的抗菌藥物濃度所抑制耐藥：分離菌株不能被測試藥物常規(guī)劑量可達到的藥物濃度所抑制；分離菌株可能存在某些特定的耐藥機制；治療研究顯示藥物對分離菌株的臨床療效不可靠耐藥＝治療無效；敏感≠治療有效第13頁,共70頁，星期六，2024年，5月二、抗菌藥物的種類及作用機制第14頁,共70頁，星期六，2024年，5月三、藥敏試驗方法學紙片擴散法（K-B法）稀釋法（MIC法）肉湯稀釋法常量稀釋法微量稀釋法瓊脂稀釋法E-test法1.手工試驗第15頁,共70頁，星期六，2024年，5月2.自動儀器藥敏系統(tǒng)

第16頁,共70頁，星期六，2024年，5月紙片擴散法（K-B法）原理：抑菌圈的大小反映受試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的MIC呈負相關。第17頁,共70頁，星期六，2024年，5月耐藥中介敏感RISLog2.MICd1d2抑菌圈直徑（mm)MIC與抑菌圈直徑的線性關系第18頁,共70頁，星期六，2024年，5月準備抗菌藥物紙片和水解酪蛋白（M-H）培養(yǎng)基；挑取孵育16～24小時已分純菌落，置于生理鹽水管中，振蕩混勻后校正濃度至0.5麥氏標準；第19頁,共70頁，星期六，2024年，5月用無菌棉拭子蘸取菌液，在試管內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)擠去多余菌液，然后在MH瓊脂表面均勻涂布接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60度，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周；平板在室溫下干燥3～5min，用無菌鑷子或商品化的紙片分配器將含藥紙片緊貼于瓊脂表面；第20頁,共70頁，星期六，2024年，5月35℃孵育16～24小時，量取抑菌圈直徑；根據(jù)抑菌環(huán)的直徑，按照CLSI標準判讀，報告敏感、中介、耐藥。第21頁,共70頁，星期六，2024年，5月2024/8/162024/8/1622CLSI對K-B法的標準化規(guī)定紙片藥物含量、細菌接種濃度、培養(yǎng)基、平皿厚度、孵育時間、環(huán)境、判定標準、質(zhì)控方法等；常規(guī)測試、報告的抗生素。不同的藥判定標準不同；不同的菌判定標準也不同。第22頁,共70頁，星期六，2024年，5月擴散法藥敏影響因素培養(yǎng)基pH值7.2-7.4營養(yǎng)程度（腸球菌能生長）厚度抗生素拮抗劑含量（用29212監(jiān)控）鈣鎂離子含量、鋅離子含量（用27853氨基糖苷類和亞胺配能結(jié)果監(jiān)控）菌懸液濃度高抑菌環(huán)縮小（假耐藥）濃度低則擴大（假敏感）細菌純度氣體環(huán)境普通細菌放CO2時由于碳酸的影響，藥物活性受到影響，形成假敏感或假耐藥苛養(yǎng)菌放普通環(huán)境生長不良，導致假敏感培養(yǎng)時間粘液性銅綠需48小時測量方法第23頁,共70頁，星期六，2024年，5月2024/8/16稀釋法以一定濃度的抗菌藥物與含有受試菌的培養(yǎng)基進行一系列不同倍數(shù)稀釋（通常為雙倍稀釋），培養(yǎng)16～24h后，通過觀察細菌生長現(xiàn)象來測得藥物對受試菌的最低抑菌濃度（MIC）。第24頁,共70頁，星期六，2024年，5月稀釋法（MIC法）MIC法：分為常量法和微量法常量法：肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法微量法：微量肉湯稀釋法簡化雙濃度折點法ATB藥敏簡化常規(guī)濃度分布MIC法BD、德靈藥敏動力學計算MIC法VITEK32、VITEK2藥敏第25頁,共70頁，星期六，2024年，5月肉湯稀釋法不生長=抗生素抑制細菌生長生長=抗生素無法抑制細菌生長MIC(最小抑菌濃度)=抗生素可抑制細菌生長的最小濃度。.250.512481632MIC=8IncreasingAntibioticConc.第26頁,共70頁，星期六，2024年，5月常量稀釋法藥敏試驗的參考方法：

將標準接種物加入含対倍稀釋抗生素的MH肉湯管中.過夜培養(yǎng).MIC即是能抑制細菌生長的含最低抗生素的濃度的那一管所標示的濃度值(瓊脂稀釋法是將対倍稀釋后的抗生素加入融化后平衡到50℃的MHA中再傾制平皿，接種物為一定大小的斑點，濃度也為104CFU/ml).解釋標準(SorR)是建立在體內(nèi)可達到的抗生素濃度水平上104cfu/ml4210.50.250.120mg/ml第27頁,共70頁，星期六，2024年，5月微量肉湯稀釋法第28頁,共70頁，星期六，2024年，5月第29頁,共70頁，星期六，2024年，5月第30頁,共70頁，星期六，2024年，5月接種后應充分混勻，但不能有氣泡產(chǎn)生靜置培養(yǎng)培養(yǎng)溫度；35℃氣體環(huán)境：所有細菌（包括苛養(yǎng)菌）均置大氣環(huán)境；厭氧菌置厭氧環(huán)境；微需氧菌置微需氧環(huán)境；淋菌瓊脂稀釋法置CO2培養(yǎng)時間：18小時第31頁,共70頁，星期六，2024年，5月2024/8/16藥敏結(jié)果報告可用MIC（μg/ml）或?qū)φ誄LSI標準用S、R和I報告。對于稀釋法的批量試驗，有時需要報告MIC50、MIC90。第32頁,共70頁，星期六，2024年，5月稀釋法藥敏影響因素培養(yǎng)基pH值7.2-7.4營養(yǎng)程度抗生素拮抗劑含量鈣鎂離子含量（鈣10-25；鎂10-12.5μg/ml）菌懸液（5×104CFU/ml）接種效應濃度高MIC抬高濃度低MIC壓低細菌純度氣體環(huán)境所有需氧細菌均放普通大氣環(huán)境。如果放CO2，由于碳酸的影響，藥物活性受到影響，形成假敏感或假耐藥培養(yǎng)時間真菌需48小時奴卡菌需5天第33頁,共70頁，星期六，2024年，5月2024/8/16E-test法將稀釋法和擴散法的原理結(jié)合起來，直接測定藥物對受試菌的MIC。第34頁,共70頁，星期六，2024年，5月MIC值標注于試條的光面Etest試條毛面貼于MHA上第35頁,共70頁，星期六，2024年，5月Etest操作程序按照擴散法標準操作涂布接種貼上試條并培養(yǎng)15-18小時讀取抑菌濃度并按標準解釋第36頁,共70頁，星期六，2024年，5月2024/8/16

細菌生長區(qū)E試條細菌生長抑制區(qū)

25612880.16判讀MIC第37頁,共70頁，星期六，2024年，5月

肺炎鏈球菌

青霉素MIC=3

g/ml結(jié)果讀取第38頁,共70頁，星期六，2024年，5月第39頁,共70頁，星期六，2024年，5月BDPhoenixTM-100鳳凰全自動細菌鑒定/藥敏檢測系統(tǒng)最大的標本容量：對100個標本同時進行鑒定與藥敏測試！第40頁,共70頁，星期六，2024年，5月第41頁,共70頁，星期六，2024年，5月第42頁,共70頁，星期六，2024年，5月鑒定部分：51孔鑒定實驗改良經(jīng)典實驗顯色＋熒光檢測無需附加實驗與試劑藥敏部分：85孔藥敏實驗比濁＋氧化還原（專利）實測倍比稀釋MIC值藥物種類與濃度梯度最多耐藥機制檢測同步進行封閉式設計，安全無泄漏先進的鑒定/藥敏復合板設計第43頁,共70頁，星期六，2024年，5月PhoenixTM100鑒定板

革蘭氏陽性板、革蘭氏陰性板生化反應組合革蘭氏陽性菌鑒定板革蘭氏陰性菌鑒定板鑒定部分：51孔鑒定實驗,改良經(jīng)典實驗顯色＋熒光檢測,無需附加實驗與試劑第44頁,共70頁，星期六，2024年，5月第45頁,共70頁，星期六，2024年，5月第46頁,共70頁，星期六，2024年，5月鑒定實驗方法在研究了上百種反應底物基礎上，選擇了45種反應底物。檢測板每20分鐘檢測一次Green,blue

andred檢測顯色反應UVlight檢測熒光反應panel第47頁,共70頁，星期六，2024年，5月Phoenix工作流程

從經(jīng)過夜純培養(yǎng)的新鮮平板上挑取菌落第48頁,共70頁，星期六，2024年，5月Phoenix工作流程

在ID肉湯中制成標準濁度（0.5~0.6麥氏單位）的菌懸液第49頁,共70頁，星期六，2024年，5月

加一滴AST指示劑到AST肉湯中

Phoenix工作流程第50頁,共70頁，星期六，2024年，5月

從ID肉湯管中準確吸取25

L菌懸液，加入到AST肉湯中Phoenix工作流程第51頁,共70頁，星期六，2024年，5月

將肉湯倒入檢測板，蓋蓋子。檢測板已準備好，可以上機檢測。Phoenix工作流程巧妙的重力加樣技術第52頁,共70頁，星期六，2024年，5月

掃描板條，輸入資料Phoenix工作流程第53頁,共70頁，星期六，2024年，5月

將檢測板放入儀器（隨意位置）Phoenix工作流程第54頁,共70頁，星期六，2024年，5月僅需區(qū)別革蘭氏染色即可選板板條種類齊全：

鑒定板、藥敏板、鑒定藥敏復合板同時提供獨立密封包裝的鑒定肉湯和藥敏肉湯，無需用戶配制。試劑常溫保存配套試劑第55頁,共70頁，星期六，2024年，5月強大軟件支持：

BDXpert微生物專家系統(tǒng)幫助解釋和監(jiān)測檢測結(jié)果檢測結(jié)果分別可分別傳入LIS系統(tǒng)或BDEpicenter數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)或打印機，并能進行各種統(tǒng)計學分析強大的軟件系統(tǒng)第56頁,共70頁，星期六，2024年，5月鑒定能力

革蘭氏陽性菌鑒定>180種革蘭氏陽性球菌革蘭氏陽性桿菌

革蘭氏陰性菌鑒定>200種革蘭氏陰性發(fā)酵桿菌革蘭氏陰性非發(fā)酵桿菌無需附加實驗95-96%準確性鑒定時間

minimum 1:26hr maximum12:25hr average 3:24hr

median 2:26hr 95th% 6:26hr優(yōu)異的鑒定性能第57頁,共70頁，星期六，2024年，5月檢測反應孔內(nèi)微生物生長情況濁度（傳統(tǒng)方法）：微生物生長形成小顆粒和聚集成團塊

氧化還原作用（BD專利技術）：通過藥敏實驗指示劑顏色變化檢測微生物的新陳代謝濁度與氧化還原的變化通過紅、藍、綠光每20分鐘檢測一次

藥敏實驗方法第58頁,共70頁，星期六，2024年，5月藥敏種類與時間葡萄球菌屬鏈球菌腸球菌屬腸桿菌屬其他革蘭氏陰性桿菌GN-90%in5HrsGP-80%in6Hrs藥敏特點對倍稀釋藥物濃度真正的MIC檢測延遲耐藥檢測急診報告快速完成功能

耐藥檢測無需附加板條自動檢測18種耐藥機制產(chǎn)超廣譜Beta內(nèi)酰胺酶檢測(ESBL)耐甲氧西林葡萄球菌檢測(MRS)鏈霉素高耐株檢測(HLSR)慶大霉素高耐株檢測(HLGR)耐萬古霉素腸球菌檢測(VRE)產(chǎn)Beta內(nèi)酰胺酶革蘭氏陽性菌檢測優(yōu)異的藥敏性能第59頁,共70頁，星期六，2024年，5月儀器判讀結(jié)果儀器自動記錄每次判讀的每個反應孔的結(jié)果。將反應結(jié)果與上一次判讀結(jié)果進行比較。當兩次結(jié)果沒有差別，則該反應結(jié)束。內(nèi)置的運算法則：顏色比率的變化依時間而變的數(shù)據(jù)庫：2、3、4、6、12小時，依據(jù)每個測試周期的判讀結(jié)果產(chǎn)生“百分比圖”，如獲得足夠的信息，則給出鑒定結(jié)果。標準菌量,可信度＞90％，給出結(jié)果。第60頁,共70頁，星期六，2024年，5月BDXpert微生物專家系統(tǒng)鑒定實驗BDXpert專家系統(tǒng)

-NCCLS-DIN-SFM-BDRules報告

-ID-MI-RulesetSIR-BDXpertSIR-特殊信息

藥敏實驗

第61頁,共70頁，星期六，2024年，5月BDXpert微生物專家系統(tǒng)目的對藥敏結(jié)果進行解釋與修正，保證藥敏實驗結(jié)果準確可靠，從而指導臨床正確進行抗感染治療專家規(guī)則來自于：已確定的標準（NCCLS,DIN,SFM)藥物研發(fā)單位的文獻資料已廣為接受的文獻資料和經(jīng)驗持續(xù)更新第62頁,共70頁，星期六，2024年，5月BDXpert微生物專家系統(tǒng)規(guī)則的應用SIR結(jié)果的解釋來自于專家系統(tǒng)規(guī)則的設置NCCLS,DIN,SFM,Custom藥物分級規(guī)則天然耐藥和天然敏感規(guī)則耐藥標記規(guī)則腸桿菌科：ESBL葡萄球菌：MRS,beta-內(nèi)酰胺酶(GPBL)腸球菌：VRE,HLGR,HLSR第63頁,共70頁，星期六，2024年，5月舉例：SIR解釋

規(guī)則規(guī)定腸桿菌科細菌Ampicillinbreakpoints: S8(I=16)R32Ref:Table2A(NCCLSM100-S12,2002)Phoenix顯示如果待檢菌是腸桿菌科細菌，且藥物為ampicillin，MIC=2那么結(jié)果顯示為“S”BDXpert微生物專家系統(tǒng)規(guī)則的應用第64頁,共70頁，星期六，2024年，5月舉例：天然耐藥規(guī)則規(guī)定規(guī)則：C.freundii

在體內(nèi)對ampicillin和amoxicillin天然耐藥Ref:Br