NBD多肽治療實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎實(shí)驗(yàn)探究

1/1NBD多肽治療實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎實(shí)驗(yàn)探究1NBD多肽治療實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎實(shí)驗(yàn)探究作者：

楊劍,崔淑蘭,龍友明,陳墾,王暉,王念林,謝文瑞,劉君君【摘要】目的觀察核因子B必需分子(N((Bessentialmodulator，NEMO)結(jié)合的小分子多肽(micromoleculepolypeptidecombiningwithNEMO(bindingdomain，NBD多肽)對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用。

方法60只SD大鼠隨機(jī)分成治療組、對(duì)照組各30只，采用三硝基苯磺酸(TNBS)灌腸法制作潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型，治療組予腹腔注射1.3mg/100g體質(zhì)量的NBD多肽，對(duì)照組予等量生理鹽水，評(píng)估炎癥活動(dòng)指數(shù)（IAI），給藥后7d處死相應(yīng)組的動(dòng)物取結(jié)腸，肉眼觀察結(jié)腸黏膜病變且按損傷情況積分，行病理切片、蘇木素伊紅(hematoxylineosin，HE)染色，光鏡下評(píng)估組織損傷；取病變結(jié)腸組織切片行免疫組化檢測(cè)核因子B(N((B)表達(dá)，檢測(cè)髓過氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)。

結(jié)果治療組大體形態(tài)損傷、組織學(xué)損傷評(píng)分、IAI評(píng)分分別為2.410.43、4.800.82、6.020.59，明顯低于對(duì)照組(3.500.51、6.901.13、3.050.51)(Plt;0.05)；治療組MDA、MPO及N((B表達(dá)均低于對(duì)照組(Plt;0.05)。

2結(jié)論NBD多肽對(duì)于潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型有較好的治療作用，其作用與其抑制N((B表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】NBD多肽潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型N(B免疫組化Abstract:ObjectiveToobservetheTime(activity(curveoTthetherapeuticeTTectoTmicromoleculepolypeptidecombiningwithNEMO(bindingdomainonexperimentalulcerativecolitisrat.MethodssixtySDratswererandomlydividedintotreatedandcontrolgroup.Ulcerativecolitisratmodelwasinducedbyenteroclysiswithtrinitro(bentene(sulTonicacid(TNBS)，micromoleculepolypeptidecombiningwithNEMO(bindingdomainwereadministeredbyintraperitonealintreatedgroup，andejustdose(sliquornatriichloridiisotonicuswereadministeredlikelyincontrolgroup.IAIscorewereevaluated.assay．Thentheratswerekilledaccordingtogroupsin7daysaTterthatthemodelwasmadeTortheobservationoTthecolonicpathologicchangesbynakedeyeandTortheestimationoTthedamagescoresoTcolonmucosa.(inally，thecolontissuewasTixedtomake3pathologicalsectionandthedamagescoreoTtissuewasobservedundermicroscope.Andthendamagedcolontissue(spathologicalsectiontestexpressionoTN((Bbyimmunitinghistochemistry.ThenthevalueoTMDA、MPOinsupernatantoTsamples(sdamagedcolontissue(sdivideevenlyanoarweretestedaccordingtotheinstructionoTthecorrespkit.Resultthetreatedgroup(sbrieTlyTormdamagescores、damagescoresoTtissue、IAIscoreare2.410.43、4.80.82、6.20.59，andtheyallarelowerthanthatoTthecontrolgroup(3.50.51、6.91.13、3.050.51)(Plt;0.05).AndthevalueoTthethetreatedgroup(sMPO、MDA、N((BarelowerthanthatoTthecontrolgroup(Plt;0.05).ConclusionmicromoleculepolypeptidecombiningwithNEMO(bindingdomainhasprotectiveeTTectagainstratulcerativecolitis，anditsmechanismrelatwiththeinhibitjionoTnuclearTactorB.Keywords:N((Bessentialmodulator(bindingdomain(NBD)peptide;ulcerativecolitis;animalmodel;N((B;immunohistochemistry4潰瘍性結(jié)腸炎(UC)即慢性非特異性潰瘍性結(jié)腸炎，是一種病因尚未完全明確的直腸和結(jié)腸的慢性炎癥性疾病，病程遷延，有癌變趨勢(shì)，近年來患病率呈上升趨勢(shì)。

目前研究發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子(B（nuclearTactorB，N((B）參與了炎癥性腸病(inTlammatoryboweldisease，IBD)的發(fā)病機(jī)制和病理生理過程，并在IBD發(fā)病過程中起著核心作用，是IBD炎癥級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)及瀑布樣效應(yīng)的開關(guān)［1］。

目前治療本病的藥物主要為氨基水楊酸類、腎上腺皮質(zhì)激素類、免疫調(diào)節(jié)劑等，取得了一定的治療效果，但毒副作用較大。

NBD多肽可以選擇性抑制N((B基因的表達(dá)，抑制促炎癥基因的表達(dá)，抑制自身炎癥反應(yīng)，有很好的應(yīng)用前景，而目前國(guó)內(nèi)、外尚未有應(yīng)用NBD治療實(shí)驗(yàn)性IBD的研究，故利用TNBS誘導(dǎo)的大鼠UC模型進(jìn)行了NBD多肽治療的實(shí)驗(yàn)研究。

1材料與方法1.1材料1.1.1動(dòng)物SD大鼠60只，SP(級(jí)，雄性，體質(zhì)量180～220g，由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：

粵監(jiān)證字2005A010。

1.1.2藥物NBD多肽，美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)。

1.1.3試劑三硝基苯磺酸(TNBS)：

美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，批號(hào)：

P2297；髓過氧化物酶（MPO）測(cè)試盒及丙二醛5(MDA)測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)均為040722；考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供，批號(hào)20060814。

兔抗N((B多克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司提供。

SP試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(diaminoben(tidine，DAB)試劑盒均購(gòu)自上海西唐生物工程有限公司；無(wú)水乙醇、乙醚甲醛均為分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1結(jié)腸炎動(dòng)物模型的制備大鼠在試驗(yàn)前1d禁食，用10%（）氨基甲酸乙酯(烏拉坦)0.1mL/kg腹腔注射麻醉。

將2，4，6(TNBS溶于50%乙醇（）中至終濃度為100g/L，取聚丙烯導(dǎo)尿管1根，術(shù)前用液狀石蠟潤(rùn)滑后，從大鼠肛門中插入深度約8cm達(dá)結(jié)腸部位，緩慢灌注TNBS/乙醇溶液，每只大鼠約0.3mL，制成大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型。

1.2.2動(dòng)物分組與給藥方法60只雄性大鼠隨機(jī)分成治療組和對(duì)照組，每組各30只。

治療組在造模前給予腹腔注射1.3mg/100g體質(zhì)量的NBD多肽1次，對(duì)照組在造模前給予腹腔注射1.3mL/100g體質(zhì)量的蒸餾水1次，待大鼠清醒后給予正常飲食，于造模后7d處死兩組大鼠并取結(jié)腸標(biāo)本及血標(biāo)本。

1.2.3結(jié)腸炎癥的評(píng)價(jià)在各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行IAI評(píng)分，而后處死大鼠取病變結(jié)腸進(jìn)行大體形態(tài)損傷、組織學(xué)損傷評(píng)分、病理切片+HE染色及MPO、MDA活性測(cè)定。

感染活動(dòng)指數(shù)6（inTlamationactiveindex，IAI）評(píng)分，IAI=(體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù))/3；正常大便成干而小粒狀，半稀便為糊狀但不粘肛門，稀便為液狀而且粘肛門；大體形態(tài)損傷按Luk等［2］的標(biāo)準(zhǔn)；組織學(xué)損傷按韓英等［3］的標(biāo)準(zhǔn)；常規(guī)病理切片+HE染色；MPO、MPA活性測(cè)定按試劑盒說明書盤(南京建成生物工程程公司)說明書操作。

1.2.4N((kB表達(dá)的檢測(cè)及評(píng)分用免疫組化SP法檢測(cè)，取結(jié)腸病變部位組織，甲醛溶液固定后石蠟包埋，組織切片脫蠟；將玻片置檸檬酸緩沖液中用醫(yī)用微波爐進(jìn)行抗原修復(fù)，水洗；滴加30mL/L的H2O2室溫10min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液(phosphatebuTTersaline，PBS)沖洗；正常血清在室溫下封閉15min，清除多余血清；滴加兔抗N((BP65多克隆抗體37℃孵育1h，PBS液沖洗；滴加生物素化的兔抗羊Ig抗體室溫孵育15min，PBS液沖洗：

滴加過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素室溫孵育15min，PBS液沖洗；DAB顯色2～5min，蘇木素復(fù)染后，封片觀察。

PBS代替一抗作為空白對(duì)照，細(xì)胞染成黃色者為陽(yáng)性，定位于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核。

每張片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(400)，用美國(guó)NikonSpot圖像采集處理系統(tǒng)采圖后，采用Image(ProPlus5.0專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率（%）和平均吸光度（A）。

1.3統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，7實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以s表示，采用t檢驗(yàn)，Plt;0.05為差異有顯著性。

2結(jié)果2.1兩組大鼠大體形態(tài)與組織損傷TNBS誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型病變主要在近肛門段結(jié)腸及降結(jié)腸，對(duì)照組大鼠可見結(jié)腸黏膜充血水腫、糜爛及潰瘍形成，部分腸段腸壁增厚，且病變呈現(xiàn)連續(xù)分布；將病變組織切片經(jīng)HE染色后，鏡下可見結(jié)腸黏膜潰瘍及偽膜形成，隱窩和黏蛋白減少或消失，淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，部分小鼠腸段還有纖維化形成，浸潤(rùn)深度可達(dá)固有層或以下，而治療組病變則主要在黏膜層，病變明顯較輕。

兩組評(píng)分比較差異有顯著性(Plt;0.01)，提示NBD多肽對(duì)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥具有治療作用，見表1、圖1。

2.2兩組大鼠炎癥活動(dòng)指數(shù)(IAI)兩組大鼠在灌腸蘇醒后均逐漸出現(xiàn)懶動(dòng)、拱背、厭食、體質(zhì)量下降、大便次數(shù)增多，主要為稀便和膿血便，但治療組癥狀明顯輕于對(duì)照組，差異有顯著性(Plt;0.01)，說明NBD多肽對(duì)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥具有治療作用。

見表1。

2.3兩組大鼠MPO、MDA活性測(cè)定經(jīng)NBD多肽處理的大鼠MPO、MDA活性明顯下降，說明NBD多肽對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎局部組織細(xì)胞內(nèi)的過氧化狀態(tài)有抑制作用，減少氧化應(yīng)8激，對(duì)結(jié)腸炎癥進(jìn)展有抑制作用，見表1。

2.4兩組大鼠N((B的表達(dá)其主要表達(dá)于表皮、隱窩上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。

治療組胞質(zhì)中多呈棕黃色而胞核中為淡黃色，對(duì)照組胞質(zhì)多為深棕黃色，陽(yáng)性細(xì)胞百分率（%）和A值明顯降低，兩組比較差異有顯著性(Plt;0.01)，說明對(duì)照組的N((B表達(dá)較為活躍，前炎癥介質(zhì)生成活躍，炎癥比較嚴(yán)重。

見表1、圖2。

表1兩組各項(xiàng)指標(biāo)評(píng)分結(jié)果（略）Table1ScoresoTeveryindexoTtwogroups與對(duì)照組比較：

*Plt;0.01圖2免疫組化結(jié)果(S(P200)（略）(igure2Immunohistochemistry(S(P200)3討論目前認(rèn)為，潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制與現(xiàn)核旁型抗中性粒細(xì)胞抗體(antineutrophilcytoplasmicantibodies，pANCA)［4］、N((B基因編碼N((Bp105/p50異構(gòu)體的功能多態(tài)性、過氧化物酶體增生物激活受體(PPAR)、TN((T、IL(1，6，8等促炎轉(zhuǎn)錄及其相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、炎性因子［5］、氧化應(yīng)激損傷等多種因素多種機(jī)制的作用有關(guān)。

本課題組研究已證實(shí)TNBS/乙醇所誘導(dǎo)的大鼠IBD模型中N((B活性在炎癥的不同時(shí)間點(diǎn)均異常激活，調(diào)節(jié)黏附分9子等炎性基因的表達(dá)，參與疾病的發(fā)生發(fā)展［6］。

核因子N((B是由Sen等于1986年首次從B細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種能與免疫球蛋白k輕鏈基因的增強(qiáng)子B序列特異結(jié)合的蛋白因子。

現(xiàn)證實(shí)其廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，能與多種細(xì)胞基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列特定位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答以及細(xì)胞的增生、轉(zhuǎn)化和凋亡等重要的病理生理過程密切相關(guān)。

N((B是重要的促炎轉(zhuǎn)錄因子，正常情況下以非活性態(tài)存在于胞漿中，在TN((T等胞內(nèi)外因子作用下使IB激酶催化對(duì)IB磷酸化，N((B產(chǎn)生核易位而激活，并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合于基因啟動(dòng)子5(區(qū)含有B結(jié)合位點(diǎn)的TN((T、IL(2、IL(6、IL(8、TN((B、粒(巨噬集落刺激因子、B整合素、黏附分子等炎性因子的基因位點(diǎn)上，促進(jìn)相應(yīng)的基因表達(dá)、細(xì)胞因子釋放；釋放的細(xì)胞因子又可以反過來進(jìn)一步活化N((B［5，7］，形成正反饋調(diào)節(jié)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，引起組織損傷［8］；抑制N((B的表達(dá)可以減輕炎癥，打斷這種正反饋過程。

但體內(nèi)其他正常生理活動(dòng)必需的細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄也需要N((B的活化，盲目地阻斷N((B的功能可干擾體內(nèi)正常的生理過程，非特異性的N((B抑制劑會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重副作用。

10N((B的激活所需要的IKK復(fù)合物中，IKT和IK有相似的結(jié)構(gòu)與較高的同源性，C端調(diào)節(jié)酶活性的螺旋(環(huán)(螺旋結(jié)構(gòu)域(helix(loop(helix，HLH)結(jié)構(gòu)可使激酶發(fā)揮高效活性，但必須在其中的6個(gè)氨基酸的區(qū)域(NEMO(bindingdomain，NBD)與2種調(diào)節(jié)亞基IK(也稱NEMO，N((Bessentialmodulator，N((B必需調(diào)節(jié)物或IKAP，IKassociatedprotein，IK連接蛋白)結(jié)合方能發(fā)揮作用。

據(jù)此設(shè)計(jì)合成的只有6個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度(H2N(Leu(Asp(Trp(Ser(Trp(Leu(COOH)的NEMO結(jié)合的NBD多肽，可以選擇性阻斷兩者的結(jié)合，阻斷干擾IKKT、IKK與NEMO的相互作用，選擇性抑制N((B活性，抑制促炎癥基因的表達(dá)，從而改善IBD病情。

而且由于其作用具有選擇性，不至于影響N((B的所有功能，并避免完全抑制N((B的活性的毒副反應(yīng)，且還具有分子結(jié)構(gòu)小、活性極高、免疫原性低，進(jìn)入細(xì)胞后不易被降解、設(shè)計(jì)、合成簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，在具有良好的穿透性的透細(xì)胞性多肽載體幫助下可以順利地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。

本實(shí)驗(yàn)中治療組的N((B表達(dá)較對(duì)照組明顯下降，證實(shí)了NBD多肽能抑制N((B的表達(dá)。

治療組的組織損傷、組織學(xué)評(píng)分均較對(duì)照組明顯減輕，作為反映臨床癥狀的IAI評(píng)分也是如此，與N((B的變化規(guī)律相同。

MPO、MDA作為11反映組織氧化還原狀態(tài)和氧化應(yīng)激情況的指標(biāo)，治療組明顯低于對(duì)照組，說明組織內(nèi)過氧化壓力減輕，氧自由基生成和造成的損傷降低，推測(cè)與N((B表達(dá)受到抑制后炎癥介質(zhì)產(chǎn)生減少有關(guān)。

總之，NBD多肽對(duì)于潰瘍性結(jié)腸炎有較好的療效，有必要進(jìn)行更大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步證實(shí)。

【參考文獻(xiàn)】［1］龍友明,陳墾.核因子(B與炎癥性腸?。跩］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,2003,12(4):394(397.［2］LUKHH,KOJK,(UNGHS,etal.DelineationoTtheprotectiveactionoTtincsulTateonulcerativecolitisinrats［J］.EuropeanJPharmacol,2002,443(1-3):197-204.［3］韓英,村田有志,伊東重毫,等.長(zhǎng)期應(yīng)用尼古丁對(duì)噁唑酮誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性小鼠腸炎模型的影響及其機(jī)制探討［J］.中華消化雜志,2001,21(8):473-476.［4］PAPPM,N