人教版選擇性必修三基因工程的基本操作程序課件（共66張）

第2節(jié)基因工程的基本操作程序目標(biāo)素養(yǎng)1.運(yùn)用歸納與概括、模型與建模等方法,分析基因工程操作的四個(gè)步驟。2.通過對(duì)基因工程案例的分析,理解基因工程基本操作程序的常用方法和基本原理,培養(yǎng)科學(xué)思維和科學(xué)探究能力。3.嘗試用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,并通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR產(chǎn)物,培養(yǎng)動(dòng)手能力。知識(shí)概覽一、目的基因的篩選與獲取1.目的基因在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中,用于改變受體細(xì)胞

性狀

或獲得

預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物

等的基因。目的基因主要是指

編碼蛋白質(zhì)

的基因。

2.篩選合適的目的基因從相關(guān)的已知

結(jié)構(gòu)

和

功能

清晰的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。

3.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因(1)原理:根據(jù)

DNA半保留復(fù)制

的原理,在體外提供參與DNA復(fù)制的

各種組分與反應(yīng)條件

,對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制。

(2)組分和條件:緩沖溶液、

DNA模板

、2種

引物

、4種

脫氧核苷酸

、耐高溫的

DNA聚合

酶,同時(shí)控制溫度。(3)過程:①

變性

:當(dāng)溫度超過90℃時(shí),雙鏈DNA解聚為

單鏈

。②

復(fù)性

:當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí),兩種

引物

通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。

③

延伸

:當(dāng)溫度上升到72℃左右時(shí),溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的

DNA聚合酶

的作用下,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。

如此重復(fù)循環(huán)多次。(4)特點(diǎn):成

指數(shù)

形式擴(kuò)增。

4.在獲得轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的過程中,還可以通過構(gòu)建基因

文庫

來獲取目的基因。

微點(diǎn)撥用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA不需要解旋酶;PCR技術(shù)需要的DNA聚合酶能耐高溫,具有熱穩(wěn)定性。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的(1)讓目的基因在受體細(xì)胞中

穩(wěn)定存在

,并且遺傳給下一代。

(2)使目的基因能夠

表達(dá)

和發(fā)揮作用。

2.基因表達(dá)載體的組成

3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程首先用一定的

限制酶

切割載體,使它出現(xiàn)一個(gè)切口;然后用同種限制酶或能產(chǎn)生

相同末端

的限制酶切割含有

目的基因

的DNA片段;再利用

DNA連接酶

將目的基因片段拼接到載體的切口處,形成一個(gè)

重組DNA

分子。

微思考1目的基因表達(dá)時(shí),RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位在哪里?提示:目的基因表達(dá)時(shí),RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位是啟動(dòng)子。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.導(dǎo)入植物細(xì)胞(1)常用:

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

法。

(2)我國獨(dú)創(chuàng):

花粉管通道

法。

2.導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞(1)方法:

顯微注射

技術(shù)。

(2)常用受體細(xì)胞:

受精卵

。

3.導(dǎo)入微生物細(xì)胞(1)常用方法:先用

Ca2+

處理受體細(xì)胞,使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),然后再將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中。

(2)常用受體細(xì)胞:原核細(xì)胞,最廣泛的是

大腸桿菌

細(xì)胞。微判斷1將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞最常用的方法是顯微注射技術(shù)。(

)√四、目的基因的檢測(cè)與鑒定1.分子水平的檢測(cè)(1)通過

PCR

等技術(shù)檢測(cè)生物體的染色體DNA上是否插入了目的基因或檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了

mRNA

。(2)從轉(zhuǎn)基因生物體中提取蛋白質(zhì),用相應(yīng)的抗體進(jìn)行

抗原—抗體雜交

,檢測(cè)目的基因是否翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)等。2.個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定例如,通過采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲來確定Bt基因是否賦予了棉花抗蟲特性以及抗性的程度。微思考2基因工程操作的四個(gè)步驟中,哪些步驟沒有發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)?提示:只有第三步“將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞”沒有發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)。第一步,堿基互補(bǔ)配對(duì)發(fā)生在PCR擴(kuò)增目的基因的過程中。第二步,堿基互補(bǔ)配對(duì)發(fā)生在目的基因片段相互拼接的過程中。第四步,堿基互補(bǔ)配對(duì)發(fā)生在目的基因的導(dǎo)入檢測(cè)和轉(zhuǎn)錄檢測(cè)過程中。微判斷2抗蟲基因即使成功地插入植物細(xì)胞染色體上,也未必能正常表達(dá)。(

)√五、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定1.原理(1)PCR利用了DNA的

熱變性

原理,通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的

解聚與結(jié)合

。PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)

調(diào)控溫度

的儀器。一次PCR一般要經(jīng)歷

30

次循環(huán)。

(2)DNA分子具有

可解離的基團(tuán)

,在一定的pH下,這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場(chǎng)的作用下,這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng),這個(gè)過程就是電泳。(3)PCR的產(chǎn)物一般通過

瓊脂糖凝膠電泳

來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的

濃度

、

DNA分子的大小

和構(gòu)象等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過

染色

,可以在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈下被檢測(cè)出來。

2.方法步驟

一

目的基因的篩選與獲取重難歸納1.目的基因的篩選是根據(jù)基因的有關(guān)信息,包括基因的核苷酸序列、基因的位置、基因的表達(dá)產(chǎn)物等,借助測(cè)序技術(shù)、序列對(duì)比工具以及序列數(shù)據(jù)庫的輔助進(jìn)行篩選。2.PCR反應(yīng)過程

特別提醒關(guān)于引物的三點(diǎn)提示(1)引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸,作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn),只能結(jié)合在DNA母鏈的3'端。(2)在細(xì)胞外的條件下,只有通過引物,DNA才可以開始進(jìn)行復(fù)制。(3)引物決定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和長(zhǎng)度。探針是指以放射性同位素、生物素或熒光染料等進(jìn)行標(biāo)記的已知核苷酸序列的核酸片段。在核酸分子雜交技術(shù)中,常常使用已知序列的單鏈核酸片段作為探針,用于檢測(cè)目標(biāo)核苷酸序列是否存在。為了獲得某DNA單鏈作探針,可應(yīng)用PCR進(jìn)行擴(kuò)增。PCR與生物體內(nèi)DNA復(fù)制有區(qū)別嗎?請(qǐng)列表格進(jìn)行比較。提示:典例剖析下列有關(guān)PCR的敘述,正確的是(

)A.作為模板的DNA序列不能在每次擴(kuò)增中重復(fù)使用B.作為引物的脫氧核苷酸序列不能在每次擴(kuò)增中重復(fù)使用C.反應(yīng)需要的DNA聚合酶不能在每次擴(kuò)增中重復(fù)使用D.反應(yīng)需要的DNA連接酶不能在每次擴(kuò)增中重復(fù)使用答案:B解析:PCR中作為模板的DNA序列可反復(fù)在每一次循環(huán)中用作模板,A項(xiàng)錯(cuò)誤。反應(yīng)過程中需要的DNA聚合酶可重復(fù)使用,C項(xiàng)錯(cuò)誤。反應(yīng)過程中不需要DNA連接酶,D項(xiàng)錯(cuò)誤。學(xué)以致用下列關(guān)于PCR的敘述,錯(cuò)誤的是(

)A.可在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因B.利用的是DNA半保留復(fù)制的原理C.目的基因的核苷酸序列需全部已知D.每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍答案:C解析:知道要擴(kuò)增的目的基因及其兩端的核苷酸序列,就可通過PCR擴(kuò)增目的基因。二

基因表達(dá)載體的構(gòu)建重難歸納1.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程特別提醒質(zhì)粒和重組質(zhì)粒是兩個(gè)不同的概念,插入目的基因的質(zhì)粒稱為重組質(zhì)粒。2.需要注意的問題(1)表達(dá)載體不等于載體:表達(dá)載體在載體的基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)。(2)啟動(dòng)子不等于起始密碼子,終止子不等于終止密碼子:啟動(dòng)子和終止子位于DNA片段上,分別控制轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)和終止;起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上,分別控制翻譯的啟動(dòng)和終止。(3)目的基因的插入位點(diǎn)不是隨意的:基因表達(dá)需要啟動(dòng)子與終止子的調(diào)控,所以目的基因應(yīng)插到啟動(dòng)子與終止子之間的部位。目的基因的插入不能破壞標(biāo)記基因。特別提醒(1)完成基因表達(dá)載體的構(gòu)建需要限制酶和DNA連接酶,由兩個(gè)DNA片段連接的產(chǎn)物有目的基因—目的基因、目的基因—載體、載體—載體三種。(2)切割質(zhì)粒和獲取目的基因的限制酶必須產(chǎn)生相同的末端。這樣形成的末端的堿基之間互補(bǔ),便于連接。(3)為了避免目的基因與目的基因連接、載體與載體連接以及目的基因自身環(huán)化,可以同時(shí)用不同的限制酶切割?？茖W(xué)家構(gòu)建了含有大洋鱈魚抗凍蛋白基因啟動(dòng)子和大鱗鮭魚生長(zhǎng)激素基因的表達(dá)載體,并將其導(dǎo)入了大西洋鮭的細(xì)胞中,獲得了生長(zhǎng)速度加快的轉(zhuǎn)基因大西洋鮭。(1)在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí),用限制酶切割載體和獲取目的基因時(shí)需注意哪些問題?提示:①獲取目的基因和切割載體時(shí),使用同一種限制酶(也可使用能切出相同末端的不同限制酶),目的是產(chǎn)生相同的黏性末端或平末端。②選擇限制酶切割位點(diǎn)時(shí),必須保證標(biāo)記基因的完整性。限制酶切割位點(diǎn)應(yīng)位于標(biāo)記基因之外,不能破壞標(biāo)記基因,以便于檢測(cè)。③獲取一個(gè)目的基因需要限制酶切割兩次,共產(chǎn)生四個(gè)黏性末端或平末端。(2)切割質(zhì)粒和獲取目的基因是不是只能用同一種限制酶?提示:不是。如果用兩種不同限制酶切割后形成的末端相同,在DNA連接酶的作用下,目的基因與載體也可以連接起來。典例剖析下列關(guān)于構(gòu)建基因表達(dá)載體的敘述,錯(cuò)誤的是(

)A.基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心B.基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因等部分C.目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因D.構(gòu)建的基因表達(dá)載體都是相同的

解析:由于受體細(xì)胞不同,基因表達(dá)載體的構(gòu)建也會(huì)有差別,不可能都是相同的。D學(xué)以致用下圖為基因表達(dá)載體的模式圖。若結(jié)構(gòu)X是表達(dá)載體所必需的,則X最可能是(

)A.氨芐青霉素抗性基因 B.啟動(dòng)子C.限制酶

D.DNA連接酶答案:B解析:啟動(dòng)子是該表達(dá)載體所必需的,其功能是驅(qū)動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄過程。三

將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞重難歸納1.目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的過程特別提醒(1)目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)能否穩(wěn)定維持并表達(dá)的關(guān)鍵是目的基因是否插入受體細(xì)胞的染色體DNA上。圖中過程b與過程a相比,過程b會(huì)使目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達(dá),而過程a細(xì)胞分裂時(shí),細(xì)胞質(zhì)是不均分的,子細(xì)胞中不一定含有目的基因。(2)目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi),并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程,稱為轉(zhuǎn)化。2.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法(1)常用方法:受體類型植物動(dòng)物大腸桿菌轉(zhuǎn)化過程將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上→轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→目的基因插入植物細(xì)胞中的染色體DNA中提純含目的基因的表達(dá)載體→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物先用Ca2+處理大腸桿菌細(xì)胞,使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),然后再將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中特別提醒(1)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞,常采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法。(2)用Ca2+處理細(xì)胞,使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法分析:①完成基因表達(dá)載體的構(gòu)建,需要限制性內(nèi)切核酸酶和DNA連接酶。②由棉株細(xì)胞形成抗蟲棉需要運(yùn)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)。特別提醒農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法適用于向雙子葉植物和裸子植物導(dǎo)入目的基因。向單子葉植物導(dǎo)入目的基因可用基因槍法。某研究所的研究人員將生長(zhǎng)激素基因通過質(zhì)粒介導(dǎo)進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi),使其表達(dá)產(chǎn)生大量生長(zhǎng)激素,應(yīng)用于侏儒癥的早期治療。而α1-抗胰蛋白酶缺乏癥是一種單基因遺傳病,患者成年后會(huì)出現(xiàn)肺氣腫及其他疾病,嚴(yán)重者甚至死亡。利用基因工程技術(shù)將控制該酶合成的基因?qū)胙虻氖芫?最終培育出能在乳腺細(xì)胞表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的轉(zhuǎn)基因羊,從而更容易獲得這種酶。基因工程技術(shù)中受體細(xì)胞的選擇有什么原則?提示:①植物:由于植物細(xì)胞具有全能性,植物體細(xì)胞經(jīng)過植物組織培養(yǎng)能夠形成生物體,所以植物基因工程的受體細(xì)胞一般是體細(xì)胞。②動(dòng)物:由于動(dòng)物細(xì)胞沒有全能性,所以動(dòng)物基因工程的受體細(xì)胞不是體細(xì)胞,而是受精卵。③微生物:常用原核生物,因?yàn)樵松锓敝晨?多為單細(xì)胞,遺傳物質(zhì)相對(duì)較少。④如果要合成有生物活性的蛋白質(zhì)如胰島素等,則必須用真核生物酵母菌(需內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的加工、分泌)作為受體細(xì)胞,不能用哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞,原因是無細(xì)胞核,也不能合成蛋白質(zhì)。典例剖析采用基因工程的方法培養(yǎng)抗蟲棉,下列導(dǎo)入目的基因的做法正確的是(

)①將Bt抗蟲蛋白注射到棉花受精卵中②將編碼Bt抗蟲蛋白的DNA序列注射到棉花受精卵中③將編碼Bt抗蟲蛋白的DNA序列與質(zhì)粒重組導(dǎo)入細(xì)菌,用該細(xì)菌感染棉花體細(xì)胞,再進(jìn)行組織培養(yǎng)④將編碼Bt抗蟲蛋白的DNA序列與質(zhì)粒重組,注射到棉花子房,并進(jìn)入受精卵A.①②

B.②③

C.③④

D.①④

C解析:將Bt抗蟲蛋白直接注射到棉花受精卵中,受精卵沒有獲得目的基因,子代細(xì)胞不會(huì)有抗蟲性狀,①錯(cuò)誤。將編碼Bt抗蟲蛋白的DNA序列直接注射到棉花受精卵中,而沒有將目的基因與載體結(jié)合,目的基因很容易被水解掉,②錯(cuò)誤。在植物基因工程中,利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,然后通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)將植物細(xì)胞培養(yǎng)成完整植株,③正確。在植物基因工程中,可以利用花粉管通道法將目的基因?qū)朊藁ㄊ芫阎?然后發(fā)育為轉(zhuǎn)基因植株,④正確。學(xué)以致用下列有關(guān)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的敘述,錯(cuò)誤的是(

)A.將目的基因?qū)朊藁?xì)胞內(nèi)常用花粉管通道法B.將目的基因?qū)胄∈笫芫褍?nèi)常用顯微注射技術(shù)C.將目的基因?qū)氪竽c桿菌內(nèi)常用Ca2+處理法D.將目的基因?qū)胄←溂?xì)胞內(nèi)常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法答案:D解析:小麥?zhǔn)菃巫尤~植物,農(nóng)桿菌對(duì)它沒有侵染能力。四

目的基因的檢測(cè)與鑒定重難歸納目的基因的檢測(cè)與鑒定類型步驟檢測(cè)內(nèi)容方法分子水平檢測(cè)第一步轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入了目的基因PCR等技術(shù)第二步目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAPCR等技術(shù)第三步目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原—抗體雜交技術(shù)1997年,我國政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年,我國已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個(gè),減少農(nóng)藥用量約40萬噸,增收節(jié)支社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益約450億元。(1)檢測(cè)棉花中導(dǎo)入的抗蟲基因是否表達(dá),最簡(jiǎn)便的方法是什么?提示:用棉花葉片飼養(yǎng)棉鈴蟲,觀察棉鈴蟲是否死亡。(2)用什么方法檢測(cè)棉花的染色體DNA上是否插入了Bt基因或檢測(cè)Bt基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA?提示:PCR等技術(shù)。(3)如果棉花中插入的Bt基因轉(zhuǎn)錄成功,是否就一定能夠翻譯出相應(yīng)的蛋白質(zhì)呢?如何從分子水平進(jìn)行檢測(cè)?提示:不一定翻譯出相應(yīng)的蛋白質(zhì)?？蓮霓D(zhuǎn)基因棉花中提取蛋白質(zhì),用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原—抗體雜交,檢測(cè)Bt基因是否翻譯成Bt抗蟲蛋白等。知識(shí)拓展DNA分子雜交技術(shù),即將轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA提取出來,在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作標(biāo)記,以此作為探針,使探針與基因組DNA雜交,如果顯示出雜交帶,就表明目的基因已插入染色體DNA中。典例剖析下列哪一種方法不能用于檢測(cè)目的基因是否成功導(dǎo)入或表達(dá)?(

)A.顯微鏡下直接觀察受體細(xì)胞中是否含有目的基因B.在含某種抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌C.利用相應(yīng)的DNA探針與受體細(xì)胞DNA分子進(jìn)行雜交D.提取受體細(xì)胞的蛋白質(zhì),利用抗原—抗體特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)

A解析:在顯微鏡下無法觀察到基因,因此該方法不能用于檢測(cè)目的基因是否成功導(dǎo)入或表達(dá)。學(xué)以致用將蘇云金桿菌的Bt基因?qū)朊藁ㄖ仓旰?從個(gè)體生物學(xué)水平進(jìn)行鑒定時(shí)應(yīng)鑒定其(

)A.是否有抗藥性B.是否有相應(yīng)的抗蟲性狀C.是否能檢測(cè)到標(biāo)記基因D.是否能分離到目的基因答案:B1.下面是基因工程的基本操作程序,正確的排序是(

)①使目的基因與載體相結(jié)合②將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞③檢測(cè)目的基因的表達(dá)是否符合特定性狀要求④提取目的基因A.③②④①

B.②④①③C.④①②③

D.③④①②答案:C2.PCR是一種DNA擴(kuò)增技術(shù),其基本原理和過程與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制類似。下列關(guān)于兩者共同點(diǎn)的敘述,正確的是(

)①邊解旋邊復(fù)制

②遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則③需要引物

④過程可分為變性、復(fù)性、延伸等步驟A.①②

B.②③C.③④

D.①④答案:B3.基因工程的核心是(

)A.目的基因的獲取B.基因表達(dá)載體的構(gòu)建C.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)