MMP-2在早產兒視網膜病變新生小鼠模型中的表達-0

1/1MMP-2在早產兒視網膜病變新生小鼠模型中的表達MMP-2在早產兒視網膜病變新生小鼠模型中的表達【摘要】目的檢測MMP-2在新生小鼠模型中的表達，探討MMP-2在早產兒視網膜病變發(fā)病過程中的作用。

方法將7日齡C57BL/6J小鼠置于75%2%高氧環(huán)境中，5天后再置于正常空氣環(huán)境中，建立高氧誘導的早產兒視網膜病變的小鼠模型。

于鼠齡17天時處死動物并摘除眼球，應用免疫組化方法檢測視網膜組織中MMP-2的表達情況。

結果MMP-2在對照組和高氧組的積分光密度值分別為16.334.13和21.126.29，兩者比較有顯著性差異(t=3.160，Plt;0.01)。

結論MMP-2可能對早產兒視網膜病變的新生血管生成有一定作用。

【關鍵詞】早產兒視網膜病變;MMP-2;視網膜新生血管Abstract:ObjectiveThisresearchusingOxygenInducedRetinopathymodelexaminestheexpressionsofMMP-2andinquiresitscontributionintoretinopathypathologyofprematurebabies.Methods7-daynewbornC57BL/6Jratswereraisedinstandardizedincubatorandexposedto(752)%oxygenconcentrationfor5days,thenreturnedtonormalair,inordertoestablisharatmodelofretinopathypathologyofprematurebabies.Ratswerekilledonthe17thdayoflife.Retinasweredissectedandstainedbyimmunohistochemicalmethod.ResultsIODofMMP-2wassignificantlyincreased21.126.29intheROPgroup,and16.334.13inthecontrolgroup.Therewassignificantdifference(t=3.160，Plt;0.01)inthelevelofMMP-2betweenROPgroupandcontrolgroup.ConclusionsItsuggeststhattheexistenceofMMP-2inaratmodeldoexertsomeeffectonthegenerationofretinalneovascularizationofprematurebabiesretinopathypathology.Keywords:retinopathypathologyofprematurebabies;MMP-2;retinalneovascularization早產兒視網膜病變(Retinopathyofprematurity，ROP)是發(fā)生于早產和低體重兒的一種致盲性視網膜病變，其病理特征為視網膜血管異常增生，嚴重者可引起玻璃體出血、視網膜變性、視網膜脫離等多種并發(fā)癥。

上世紀80年代以來，由于醫(yī)療技術的快速發(fā)展，早產兒的成活率也顯著提高，ROP的發(fā)病率也隨之呈上升趨勢，在體重低于1000g的超低體重兒，發(fā)病率高達80%以上[1,2]。

目前，ROP已經成為世界范圍內兒童致盲的重要原因，約占兒童致盲原因的6%～18%[3]。

防治ROP以改善早產兒的生存質量己成為全球關注的焦點。

己經明確ROP與吸氧治療高度相關，早產、高氧和低出生體重是發(fā)病過程中最為關鍵的因素，但其發(fā)病的確切機制至今仍不明確。

研究表明，視網膜新生血管形成在ROP的發(fā)病機制中起主導作用。

盡管近年來人們對視網膜新生血管的認識研究有了不少突破，但由于其確切發(fā)病機制仍然不明，目前臨床上尚無完全根治性手段。

在對視網膜新生血管發(fā)生機制的研究中，諸多生長因子、細胞因子和炎癥介質發(fā)揮的作用一直是關注的重點。

近些年來，對基質金屬蛋白酶的研究成為熱點。

本研究在早產兒視網膜病變的小鼠模型中，應用免疫組化方法，檢測了基質金屬蛋白酶2(MMP-2)的表達，進一步探討MMP-2在早產兒視網膜病變發(fā)病過程中的作用。

1材料和方法1.1實驗動物中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院動物實驗中心提供的健康的清潔級C57BL/6J幼鼠(與哺乳母鼠在一起)，選擇鼠齡7天的共40只，雌雄兼有。

1.2實驗試劑MMP-2免疫組化試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3早產兒視網膜病變小鼠模型的建立選擇鼠齡7天的健康清潔級C57BL/6J幼鼠40只，與哺乳母鼠在一起，雌雄兼有，隨機分成2組，高氧組20只，對照組20只。

對照組在正常環(huán)境溫度下飼養(yǎng);高氧組置于密閉有機玻璃容器內。

容器內接入100%濕潤醫(yī)用純氧氣，使容器內氧分壓保持在75%2%，并用測氧儀全程監(jiān)測容器內的氧分壓，確保氧濃度的恒定。

高氧環(huán)境下飼養(yǎng)5天，然后移置正常環(huán)境溫度中飼養(yǎng)。

每天日光照明12小時，環(huán)境溫度控制在(232)℃。

每日打開氧箱更換墊料、加食、替換母鼠1次。

1.4標本的制備鼠齡17天時處死幼鼠，將眼球摘除，浸泡于4%多聚甲醛中性緩沖液中固定24小時，保存溫度為4℃。

梯度酒精脫水、二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋。

標記方向，制作切片時應避開視乳頭周圍，含有視神經的切片應排除在外。

連續(xù)切片，厚度6m，切片方向平行于角膜至視乳頭的矢狀位平面。

1.5免疫組化法按照即用型SABC免疫組化試劑盒使用說明書進行操作：

石蠟切片置于60℃烘箱2～3小時溶解石蠟，二甲苯常規(guī)脫蠟至水，0.3%過氧化氫室溫孵育5～10分鐘，切片置于抗原修復液中92～98℃水浴10min，室溫中冷卻20min。

滴加5%BSA封閉液，滴加適當稀釋的一抗(1：

150)，4℃過夜。

次日滴加生物素標記的二抗工作液，置濕盒內37℃，滴加試劑SABC，室溫孵育30min。

DAB顯色：

使用DAB顯色劑試劑盒，取蒸餾水1mL，加試劑盒中A、B、C試劑各一滴，混勻后加至切片，室溫避光10min。

蘇木素復染1min，脫水、透明、封片、鏡下觀察。

1.6統(tǒng)計學分析實驗數據采用均數標準差表示，所有數據均以統(tǒng)計分析軟件SPSS11.5forwindows進行分析，采用獨立樣本t檢驗方法，以Plt;0.05作為差異有統(tǒng)計學意義的標準。

2結果2.1MMP-2在視網膜的表達MMP-2以背景清晰細胞漿出現棕黃色顆粒為陽性，主要位于視網膜內界膜附近，神經節(jié)細胞層，內核層。

2.2免疫組化的半定量檢測每張切片在高倍顯微鏡下隨機選擇10個視野，采用Metamorph/DP10/BXS1圖像分析軟件，測量其積分光密度值(IOD值)，MMP-2在對照組和高氧組的積分光密度值(IOD值)分別為16.334.13和21.126.29，兩者比較有顯著性差異(t=3.160，Plt;0.01)。

3討論研究認為早產兒視網膜病變的主要病理改變?yōu)橐暰W膜新生血管生成，而視網膜新生血管的發(fā)生過程是從預先存在的血管形成新的毛細血管，因此在其最初階段必須使血管內皮細胞趨化、遷移通過基底膜，而這一過程必須通過基質金屬蛋白酶消化血管內皮細胞層下面的細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)屏障[4]。

基質金屬蛋白酶是一類活性依賴鋅離子和鈣離子的可以降解細胞外基質的蛋白水解酶，包括約20種酶，主要分為膠原酶類(MMP-1、MMP-8、MMP-13、MMP-18)，明膠酶類(MMP-2、MMP-9)，基質水解酶類(MMP-3、MMP-10、MMP-11)，膜型酶類(MT-MMP)等，它們的分子量從20～100kDa不等，作用的底物有一定的重疊性，其中明膠酶的作用主要是清除變性的膠原和Ⅳ型膠原。

而Ⅳ型膠原是組成血管基底膜和細胞外基質的主要結構蛋白，因而明膠酶MMP-2作為主要降解Ⅳ型膠原的基質金屬蛋白酶在新生血管形成過程中起著重要作用[5]。

研究表明，MMP-2與新生血管形成密切相關[6]。

MMP-2通過降解變性的膠原和基底膜Ⅳ型膠原，有利于血管內皮細胞的遷移，并為毛細血管網絡增生提供了空間，而基底膜和間質膠原的降解產物對內皮細胞也有趨化作用，有利于血管內皮細胞的定向遷移，從而引起新生血管的形成。

一些研究團體已經檢測了在視網膜新生血管中MMPs的表達形式和可能的作用。

Das等[7]報道糖尿病人視網膜外層新生血管膜含有高水平的細胞外蛋白水解酶，其中包含MMP-2、MMP-9和尿激酶。

Majka等[8]報道在小鼠增殖性視網膜病變模型中MMP-2、MMP-9和I型MMP的表達增加。

Das等[9]報道氧誘導的視網膜病變模型中，腹膜內注射MMPs抑制劑可顯著抑制視網膜新生血管的生成。

我們通過建立高氧誘導的視網膜新生血管小鼠模型，發(fā)現高氧組MMP-2的表達明顯高于對照組，提示MMP-2與視網膜新生血管生成之間存在關聯(lián)。

KyokoOhno-Matsui，TomokoUetama等[10]建立了氧誘導的視網膜病變小鼠模型，發(fā)現MMP-2缺乏型(MMP-2-/-)的小鼠視網膜外新生血管形成明顯少于野生型小鼠(MMP-2+/+)，這也可以證實我們的結論。

因此認為MMP-2可能是視網膜新生血管形成的調節(jié)中所必須的。

也有研究認為[11]，MMP-2無論對小鼠視網膜血管生成還是病理性視網膜新生血管生成都不是必不可少的。

用MMP-2抑制劑進行干預將成為治療早產兒視網膜病及其他新生血管性視網膜病的新途徑。

【參考文獻】[1]PalmerEA，FlynnJT，HardyRT,etal.Incidenceandearlycourseofretinopathyofprematurity[J].Ophthalmoloty，1991，98(11):1628-1640.[2]JoaoBorgesFortesFilho，CristianoKochBarros.RetinopathyofprematurityinatertiarycenterinsouthofBrazil[J].InternationalJournalofOphthalmology，2007，7(1):31-35.[3]GilbertC，RahiJecksteinM,EcksteinM，etal.Retinopathyofprematurityinmiddle-incomecountries[J].Lancet，1997，350(9070):12-14.[4]SmithLE.Pathogenesisofretinopathyofprematurity[J].SeminNeonatol，2003，8:469-473.[5]SangQA，DouglasDA.ComputationaSequenceAnalysisofMatrixMetalloproteinases.[J].ProteinChem,1996，15:137-160.[6]ForsythPA，WongH,LaingTD,etal.Gelatinase-A(MMP-2),gelstinase-B(MMP-9)andmembranetypematrixmetalloproteinase-1(MTl-MMP)areinvolvedindifferentaspectsofthepathophysiologyofmalignantgliomas[J].BrJCancer，1999，79(11-12):1828-1835.[7]DasA，McGuireP，EriquatC，etal.Humandiabeticneovascularmembranescontainhighlevelsofurokinaseandmetalloproteinaseenzymes[J].InvestOphthalmolVisSci，1999，40:809813.[8]MajkaS，McGuireP，Colomb