當歸對宮內(nèi)缺氧后新生大鼠腎臟內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子表達的影響

1/1當歸對宮內(nèi)缺氧后新生大鼠腎臟內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子表達的影響當歸對宮內(nèi)缺氧后新生大鼠腎臟內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子表達的影響【摘要】目的研究當歸對宮內(nèi)缺氧后新生大鼠腎臟內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達的影響。

方法將孕期14d的SD大鼠隨機分為對照組、缺氧組和當歸治療組。

缺氧組孕鼠自孕第14天開始每天一次經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水8ml/kg（連續(xù)7d），后用低張性缺氧模型致胚鼠宮內(nèi)缺氧2h（連續(xù)3d：

孕期第14，15，16天）；當歸治療組用250g/L的當歸注射液代替生理鹽水，其余處理同缺氧組；對照組不缺氧，其余同缺氧組。

3組孕鼠分娩當日取腎組織、多聚甲醛固定，石蠟包埋切片、VEGF免疫組化、400倍拍照、IPP6.0軟件圖像分析。

結(jié)果缺氧組新生鼠VEGF陽性細胞的數(shù)量和積分光密度值均較對照組增大(P＜0.05)，當歸組VEGF陽性細胞數(shù)量和積分光密度值均較缺氧組減小(P＜0.05)。

結(jié)論一定時間、一定氧濃度的宮內(nèi)缺氧可刺激新生大鼠腎臟VEGF的表達增加；而當歸注射液可使VEGF的表達下降。

【關(guān)鍵詞】當歸；缺氧；腎；血管內(nèi)皮細胞生長因子血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是調(diào)節(jié)血管發(fā)生的基本生長因子,在腎臟中含量豐富，已有較多證據(jù)表明VEGF在腎臟胚胎發(fā)育中起重要作用。

宮內(nèi)缺氧是影響胚胎發(fā)育的常見因素，而腎臟是對缺血缺氧最敏感的器官之一，VEGF是調(diào)節(jié)血管發(fā)生的基本生長因子，它可以與內(nèi)皮細胞上的受體相結(jié)合，從而促進內(nèi)皮細胞的增殖，加速新生血管的生成。

許多組織器官在低氧環(huán)境下，都可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞生長因子VEGF的表達，使毛細血管代償增生，緩解缺氧狀態(tài)。

近年來也有報道VEGF與腎臟的生理和一些病理狀態(tài)相關(guān)。

本實驗試圖通過建立宮內(nèi)缺氧模型，觀察在體狀態(tài)下缺氧對新生大鼠腎臟VEGF表達的影響，探討VEGF與腎臟缺氧的關(guān)系，并觀察中藥當歸對腎臟缺氧狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用。

1材料鼠抗VEGF（中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒(棕黃色)購自武漢博士德生物工程公司；250g/L的當歸注射液購自武漢大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科（批號060926）。

OLYMPUSBx-70熒光顯微鏡成像系統(tǒng)為日本OLYMPUS光學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；德國萊卡切片機；三氣培養(yǎng)箱（購自美國REVCO公司）。

SD大鼠15只（220～250g）由瀘州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。

2方法2.1動物配種與分組成年健康SD雌大鼠15只(體質(zhì)量220～260g)，分別與SD雄鼠合籠配種，次日晨見陰栓記為大鼠懷孕0d，孕鼠隨機分為對照組、缺氧組、當歸組各5只。

2.2宮內(nèi)缺氧模型建立參照余鴻［1］等制作的宮內(nèi)缺氧模型。

當歸組孕鼠自孕14d開始，每天下午2：

00經(jīng)尾靜脈注射250g/L的當歸注射液8ml/kg（孕第14～20天，連續(xù)7d），1h后放入設(shè)置好的三氣培養(yǎng)箱(氧體積分數(shù)130ml／L，溫度25℃，二氧化碳體積分數(shù)0.4～0.6ml／L)內(nèi)缺氧2h，連續(xù)缺氧3d(孕第14～16天)，第17，18，19，20天仍給予當歸注射，但不缺氧。

缺氧組用生理鹽水代替當歸注射液，其余同當歸組。

對照組不缺氧，余同缺氧組。

2.3取材、石蠟切片及VEGF免疫組織化學(xué)測定每組隨機選取15個新生鼠腎臟，然后進行常規(guī)石蠟包埋，經(jīng)腎臟冠狀切面切片（片厚4m），每組切片脫蠟至水，各組隨機取12張切片分別作VEGF(1∶200）免疫組化染色(常規(guī)鏈酶親和素一生物素一過氧化物酶復(fù)合物法)。

其余切片做HE染色，免疫組化切片在400倍顯微鏡下觀察腎臟皮質(zhì)，每張切片隨機選取5個視野,每個視野隨機選取3～5個近曲小管。

采用OLYMPUSBx-70熒光顯微鏡成像系統(tǒng)拍照，經(jīng)Image-ProPlus5.1圖像分析系統(tǒng)對陽性細胞進行圖像分析。

2.4統(tǒng)計學(xué)處理各組間比較用方差分析，兩兩比較用LSD法檢驗。

采用SPSS13.0軟件包完成數(shù)據(jù)分析（Plt;0.05）。

3結(jié)果3.1對照組VEGF免疫組化反應(yīng)陽性細胞分布呈區(qū)域性，大多位于腎遠曲小管上皮細胞，胞質(zhì)中有棕黃色顆粒（圖1a及表1）。

3.2缺氧組VEGF免疫組化反應(yīng)陽性細胞分布區(qū)域與對照組相似，與對照組相比缺氧組陽性細胞染色增強、陽性細胞數(shù)量增加、積分光密度值增大（P＜0.05）（見圖1b及表1）。

3.3當歸治療組VEGF免疫組化反應(yīng)陽性細胞分布與對照組相似，與缺氧組相比缺氧組陽性細胞染色減弱、數(shù)量減少、其積分光密度值減?。≒＜0.05）（見圖1c，表1）。

表13組新生鼠腎臟皮質(zhì)區(qū)VEGF免疫組化結(jié)果（略）4討論新生兒窒息是新生兒死亡和傷殘的主要病因之一，本病致死致殘的主要原因是缺氧導(dǎo)致新生兒心、腦、腎等多種臟器損傷所致，由于腎血流量大，能量消耗大，因此腎對缺血缺氧比較敏感。

許多組織器官在低氧環(huán)境下，都可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子VEGF的表達，使毛細血管代償增生，緩解缺氧狀態(tài)［2］，目前有關(guān)在體狀態(tài)下缺氧對腎臟組織內(nèi)VEGF表達的影響研究較少，因此，對缺氧后腎組織VEGF表達變化的研究將有助于闡明缺氧引起腎損傷的發(fā)生機制。

腎臟有一套具特殊形態(tài)和功能的血管系統(tǒng)，在人腎發(fā)育過程中,腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)形成的同時,腎的血管也開始發(fā)生。

起誘導(dǎo)分化作用的間質(zhì)產(chǎn)生血管發(fā)生因子,分化的腎小球上皮細胞產(chǎn)生VEGF,此時,腎小球內(nèi)皮細胞表達豐富的VEGF受體（Flt21和KDRmRNA）,內(nèi)皮細胞被吸引入腎小球并向內(nèi)生長。

與此類似,集合管上皮細胞產(chǎn)生VEGF,皮髓質(zhì)腎小管周毛細血管內(nèi)皮細胞存在VEGF受體,促使腎小管周毛細血管發(fā)生。

在新生鼠腎臟發(fā)育時,抗體阻斷內(nèi)源VEGF,動物的腎皮質(zhì)表層的血管形成受阻,發(fā)育的腎單位數(shù)目明顯減少,有許多缺乏毛細血管叢的異常腎小球，說明VEGF在腎臟發(fā)育尤其腎小球形成中起重要作用。

本研究在HE染色切片上，觀察到缺氧組腎近曲小管上皮細胞體積變大，胞漿可見顆粒狀物，管腔變窄，部分核碎裂、溶解，出現(xiàn)了明顯水腫，說明3d(2h/d)缺氧后，導(dǎo)致了腎臟結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)改變。

另外在腎臟免疫組化染色切片上觀察到缺氧3d(2h/d)組胚鼠腎臟VEGF免疫組織化學(xué)反應(yīng)增強、陽性細胞增多，說明缺氧后VEGF表達量增加，但隨著氧濃度和缺氧時間的變化，VEGF在腎臟的表達尚需進一步的研究。

缺氧狀況下，有關(guān)腎組織中VEGF表達是否增加目前結(jié)論不一，有學(xué)者認為缺氧能顯著增加腎組織VEGF表達,但也有學(xué)者認為,缺氧并不能引起腎組織表達增加,只是的分布發(fā)生了變化，而Simon［3］等發(fā)現(xiàn)胚胎及成年在腎小球及周圍有大量VEGF的受體表達，導(dǎo)致以上結(jié)論不一可能與研究者采用的缺氧濃度大小或缺氧時間長短有關(guān)。

當歸是國藥精華，其味甘而重，專能補血；其氣輕而辛，又能行血。

現(xiàn)代研究表明，當歸含有揮發(fā)性和水溶性兩大類成分。

對人體不僅有抗貧血、血小板聚集和血栓形成、改善血流、清除氧自由基、抗衰老、解痙、抗炎［4］、抗過敏、增強人體免疫功能的作用，并且升高子宮組織中一氧化氮水平、降低鈣離子水平，具有明顯緩解痛經(jīng)的作用［5］。

此外，在腎保護方面，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明中藥黃芪與當歸能夠通過多種途徑改善微血管病變，包括增加局部組織的血流灌注以減輕組織的缺氧性損傷、促進缺血再灌注后腎血流量和腎小球濾過率的恢復(fù)、糾正一氧化氮／血管緊張素等血管活性物質(zhì)的失衡、抑制細胞內(nèi)鈣的釋放和促進血管表皮生長因子表達及血管內(nèi)皮細胞DNA合成以改善內(nèi)皮細胞功能。

提示黃芪、當歸可能通過上述機制起到延緩腎臟疾病進展作用［6］。

本實驗中，當歸組的VEGF的表達較缺氧組減少，說明當歸注射液減弱了缺氧刺激引起的VEGF的表達量的增加，即推測當歸對缺氧刺激有緩解、保護作用，可明顯減輕腎臟的損傷。

通過對以上當歸的藥理學(xué)方面綜合分析，當歸一方面可以通過擴張血管、改善循環(huán)，增加子宮及臍帶供血；另一方面，可以緩解平滑肌痙攣，減低子宮的反應(yīng)性；另外，還可以通過清除自由基、抗脂質(zhì)氧化能力等途徑起作用。

從本實驗的結(jié)果中推測當歸的具體保護機制可能與VEGF的大量激活有關(guān)，且當歸的緩解、保護理論也為以后的宮內(nèi)缺氧臨床預(yù)防與治療提供依據(jù)。

【參考文獻】1］HongYu,HeshengYue,XudongChen,etal.EffectofAngelicasinensisonneuralstemcellproliferationinneonatalratsfollowingintrauterinehypoxia［J］.NeuralRegenerationResearch，2008，3(7):733.［2］AtsushiN,EdiB,MarianneK,etal.Hypoxiainducesvascularendothelialgrowthfactorinculturedhumanendothelialcells［J］.JBiolChem,1995,270(52):31189.［3］SimonM，RocklW，HorniqC.etal.Receptorsofvascularendothelialgrowthfactor/vascularpermeabilityfactor(VEGF/VPF)infetalandadulthumankidney:localizationand［125I］.VEGFbindingsites［J］..JAmSocNephrol,1998，9(6):1032.［4］鄧敏,謝平，