絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備

絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備第1組第2組第3組第4組第5組第6組第7組第8組一、匯報(bào)交流方案二、討論確定方案SDS制備SHMTSDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)就是一種在聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中加入SDS和巰基乙醇,以消除蛋白質(zhì)分子所帶得凈電荷和形狀對(duì)電泳遷移率影響得電泳技術(shù)。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中待檢蛋白質(zhì)得遷移率主要依賴于其相對(duì)分子質(zhì)量,因此被廣泛用于測(cè)定蛋白質(zhì)得相對(duì)分子質(zhì)量。十二烷基硫酸鈉就是一種陰離子去污劑,與蛋白質(zhì)結(jié)合可形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物,由于十二烷基硫酸根帶負(fù)電,使各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物都帶上相同密度得負(fù)電荷,她得量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原來(lái)得電荷量,因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間原有得電荷差別。在聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中加入SDS和巰基乙醇,能掩蓋不同蛋白質(zhì)間得電荷差異,并引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化,從而導(dǎo)致變性后得蛋白質(zhì)分子在凝膠電泳中得遷移率取決于其相對(duì)分子質(zhì)量大小,而與其她因素(原有電荷、形狀)無(wú)關(guān)。通過(guò)這種電泳方式可將細(xì)胞中所有蛋白質(zhì)根據(jù)各自得相對(duì)分子質(zhì)量大小而分離開(kāi)來(lái)。電泳方向混合樣品電泳帶孔膠大分子小分子SHMT得電泳制備操作流程安裝電泳槽剝膠電泳上樣制膠染色三、關(guān)鍵操作試劑配制制膠剝膠四、方案實(shí)施清潔領(lǐng)取物料操作填寫生產(chǎn)記錄清場(chǎng)與清潔SHMT得電泳制備安裝電泳槽剝膠電泳上樣制膠染色材料:大腸桿菌培養(yǎng)物懸液(含SHMT)器材:(1)夾心式垂直板電泳槽;(2)直流穩(wěn)壓電源(電泳儀);(3)培養(yǎng)皿及竹夾子;(4)長(zhǎng)針頭(8~10cm)及普通針頭;(5)注射器(10ml);(6)微量進(jìn)樣器(50μl);(7)細(xì)長(zhǎng)皮頭吸管;(8)移液管架;(9)棕色試劑瓶;(10)白色試劑瓶;(11)1ml、2ml、5ml吸量管;(12)卷紙1包;(13)大平皿,(14)移液槍(配20μl槍頭)。(一)材料與儀器夾心垂直板電泳槽示意圖1：導(dǎo)線接頭2：下貯槽3：凹形橡膠框4：梳子5：固定螺絲6：上貯槽7：冷凝管凝膠模示意圖1：梳子2：長(zhǎng)玻璃板3：短玻璃板4：凹形橡膠框大家學(xué)習(xí)辛苦了，還是要堅(jiān)持繼續(xù)保持安靜(二)試劑及配制(1)30%丙烯酰胺儲(chǔ)存液稱取丙烯酰胺29g、甲叉雙丙烯酰胺1g,加熱至37℃溶解,蒸餾水定容至100mL,裝于棕色瓶,4℃保存。(2)1、5mol/LTris-HCl(pH8、8)緩沖液稱取Tris18、17g,加蒸餾水溶解,濃鹽酸調(diào)pH至8、8,定容至100mL。(3)1、0mol/LTris-HCl(pH6、8)緩沖液稱取Tris12、12g,加蒸餾水溶解,濃鹽酸調(diào)pH至6、8,定容至100mL。(4)10%SDS溶液稱取SDS10、0g,加蒸餾水,68℃助溶,定容至100mL。(5)10%過(guò)硫酸銨溶液稱取1、0g過(guò)硫酸銨,加水定容至10mL,4℃保存。(6)5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液(pH8、3)稱取Tris15、1g、甘氨酸94g、SDS5g,加水定容至1L,室溫存放,使用時(shí)稀釋5倍使用。(7)考馬斯亮藍(lán)R250染色液在45mL甲醇、45mL水和10mL冰乙酸得混合液中溶解0、25g考馬斯亮藍(lán)R250,用濾紙過(guò)濾染液以去除顆粒狀物質(zhì)。配制500mL。(8)脫色液75mL冰乙酸,50mL甲醇,875mL水,混勻即可。(9)2×SDS凝膠加樣緩沖液配5mL:取1mol/LTris-HCl(pH6、8)0、5mL,SDS0、2g,溴酚蘭10mg,甘油1mL,加水定容至5mL,與樣本混勻前加0、16gDTT。使用時(shí)與樣本l∶1(v/v)混勻。(10)樣品處理大腸桿菌培養(yǎng)物懸液→離心(3000r/min,5min)→蒸餾水懸浮細(xì)胞→加2×SDS加樣緩沖液(1:1)→沸水加熱10min→離心(5000r/min,10min)→取上清液加樣。(三)操作步驟(1)將長(zhǎng)、短玻璃板分別插到凹形橡膠框得凹形槽中。溫馨提示:注意勿用手接觸灌膠面得玻璃。(2)在長(zhǎng)玻璃板下端與橡膠?？蚪唤绲每p隙處加入已融化得1%瓊脂,封住空隙。溫馨提示:封底用得瓊脂應(yīng)用1×TBE溶解,凝固后得瓊脂中應(yīng)避免有氣泡。(3)將已插好玻璃板得凝膠模平放在上貯槽上,短玻璃板應(yīng)面對(duì)上貯槽。(4)將下貯槽得螺孔對(duì)準(zhǔn)已裝好螺絲釘?shù)蒙腺A槽,旋緊螺絲帽,豎直電泳槽。溫馨提示:安裝電泳槽,雙手以對(duì)角線得方式旋緊螺絲帽,以免緩沖液滲漏。1、電泳槽組裝(三)操作步驟2、膠體得制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠得有效分離范圍

凝膠濃度(%)線性分離范圍(kD)1512～431016～687、536～945、057～212(1)分離膠得制備

SDS%分離膠配方

溶液成分不同體積(mL)凝膠液中各成分所需體積(mL)510152025304050蒸餾水1、63、34、96、68、29、913、216、530%丙烯酰胺溶液2、04、06、08、010、012、016、020、01、5mol/LTris(pH8、8)1、32、53、85、06、37、510、012、510%SDS0、050、10、150、20、250、30、40、510%過(guò)硫酸銨0、050、10、150、20、250、30、40、5TEMED0、0020、0040、0060、0080、010、0120、0160、02按表配制12%分離膠,混勻后迅速將配好得分離膠倒入凝膠模長(zhǎng)、短玻璃板間得間隙內(nèi),高度約8cm。然后沿長(zhǎng)玻璃板板壁緩慢注入少許蒸餾水,進(jìn)行水封。待凝膠完全聚合(約30min),傾去水封層得蒸餾水,并用濾紙條吸去殘余水分。溫馨提示:若凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同得界線,則表示凝膠完全聚合。(2)濃縮膠得制備

SDS%濃縮膠配方

按配制5%濃縮膠,混勻后迅速加到已聚合得分離膠上方(高度以插入梳子不溢出為宜),輕輕將梳子插入濃縮膠內(nèi),待凝膠完全聚合(約30min)后小心拔去梳子。溫馨提示:丙稀酰胺為神經(jīng)毒劑,使用時(shí)要小心,操作務(wù)必戴手套。過(guò)硫酸銨需新鮮配制,并注意濃度,否則影響膠凝固。殘余膠液可暫時(shí)留存,便于參考膠凝固時(shí)間。溶液成分不同體積(mL)凝膠液中各成分所需體積(mL)123456810蒸餾水0、681、42、12、73、44、15、56、830%丙烯酰胺溶液0、170、330、50、670、831、01、31、71、0mol/LTris(pH6、8)0、130、250、380、50、630、751、01、2510%SDS0、010、020、030、040、050、060、080、110%過(guò)硫酸銨0、010、020、030、040、050、060、080、1TEMED0、0010、0020、0030、0040、0050、0060、0080、013、上樣

(1)將Tris-甘氨酸電泳緩沖液倒入上、下貯槽中,高度應(yīng)沒(méi)過(guò)短玻璃板約0、5cm。(2)用微量注射器吸取10～20μL樣品液加入上樣孔,加樣體積可根據(jù)凝膠厚度及樣品濃度靈活掌握。溫馨提示:若樣品槽中有氣泡,可用注射器針頭挑除;加樣時(shí),微量注射器針頭應(yīng)盡量接近加樣槽底部,但針頭勿碰破凹形槽膠面。(三)操作步驟4、電泳連接電泳儀,打開(kāi)電源,按8V/cm確定所需電壓,待指示劑(溴酚藍(lán))進(jìn)入分離膠后將電壓提高到15V/cm,繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部(約3h),停止電泳,關(guān)閉電源。溫馨提示:正極應(yīng)接下槽。(三)操作步驟5、剝膠電泳結(jié)束后,取下凝膠模,卸下橡膠框,輕輕撬開(kāi)兩層玻璃,取出凝膠,切角作記號(hào)。溫馨提示:剝離凝膠應(yīng)戴手套,防止污染膠面。(三)操作步驟6、染色經(jīng)SDS分離得蛋白質(zhì)樣品可用考馬斯亮藍(lán)R250染色。(1)染色將凝膠浸泡在染色液中,在室溫下緩慢搖動(dòng)染色30min。(2)脫色回收染色液,凝膠先用蒸餾水漂洗一次,再浸入脫色液中,放在脫色搖床上于室溫平緩搖動(dòng)3～5h,其間更換脫色液3～4次,直至條帶清晰。(3)漂洗脫色后,用蒸餾水漂洗凝膠3～5次。(三)操作步驟五、結(jié)果展示與評(píng)價(jià)SDS-PAGE電泳示意圖1：對(duì)照2：樣品M：蛋白質(zhì)Marker12M1、SHMT2、電泳3、電泳技術(shù)4、PAGE5、SDS6、IFE六、總結(jié)與拓展1、SHMTSerinehydroxymethyltransferase絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶glyA2、電泳電泳就是指帶電粒子在電場(chǎng)中得運(yùn)動(dòng)。帶電粒子(帶電顆粒)在電場(chǎng)作用下,向著與其電性相反得電極移動(dòng),稱為電泳(electrophoresis)。3、電泳技術(shù)利用帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)速度不同而達(dá)到分離得技術(shù)稱為電泳技術(shù)。利用電泳現(xiàn)象使物質(zhì)分離得技術(shù)稱為電泳技術(shù)。不同物質(zhì)由于所帶電荷、分子大小和形狀不同,在電場(chǎng)中得移動(dòng)速度不同。

4、PAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis

聚丙烯酰胺凝膠電泳

以聚丙烯酰胺凝膠為支持介質(zhì)得電泳技術(shù)廣泛用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子得分離、制備及定性、定量分析。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N,N’-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑得作用下聚合而成。丙烯酰胺單體和N,N'-甲叉雙丙烯酰胺單獨(dú)存在或混合存在時(shí)就是穩(wěn)定得,當(dāng)遇到自由基時(shí),二者發(fā)生聚合反應(yīng)形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)得凝膠。聚丙烯酰胺凝膠得聚合體系有化學(xué)聚合和光聚合兩種。聚合方式催化劑加速劑聚合條件凝膠特點(diǎn)化學(xué)聚合過(guò)硫酸銨(AP)N,N,N‘,N’-四甲基乙二胺(TEMED)堿性環(huán)境膠孔徑較小,多用于制備分離膠光聚合核黃素(VB2)無(wú)光膠孔徑較大,不穩(wěn)定多用于制備濃縮膠聚丙烯酰胺凝膠得優(yōu)點(diǎn)

①在一定濃度時(shí),膠體透明,有彈性,機(jī)械性能好。②化學(xué)性能穩(wěn)定,與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)。③對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定。④幾乎無(wú)電滲作用,只要丙烯酰胺單體純度高,操作條件一致,則樣品分離重復(fù)性好。⑤樣品不易擴(kuò)散,且用量少,其靈敏度可達(dá)10-6g。⑥凝膠孔徑可調(diào)節(jié),根據(jù)被分離物質(zhì)得相對(duì)分子質(zhì)量,改變單體及交聯(lián)劑得濃度可調(diào)節(jié)凝膠得孔徑。⑦分辨率高,尤其在不連續(xù)凝膠電泳中,集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體,因而有更高得分辨率。

凝膠濃度和交聯(lián)度就是影響聚丙烯酰胺凝膠性能得主要因素。通常用100mL凝膠溶液中含有Acr及Bis得總克數(shù)表示凝膠濃度(T%)。交聯(lián)度(C%)就是指交聯(lián)劑Bis占單體Acr與Bis總量得百分?jǐn)?shù)。一般分離蛋白質(zhì)和核酸得聚丙烯酰胺凝膠標(biāo)準(zhǔn)濃度分別為7、5%和2、4%,實(shí)際操作時(shí)可根據(jù)被分離物得相對(duì)分子質(zhì)量大小適當(dāng)調(diào)整凝膠得濃度。4、SDS