Illumina測序基礎知識

第一個要給大家講得,就是它這個flowcell。Flowcell翻成中文,就叫“流動池”。我們來瞧這個圖片。圖片當中,我們瞧到一個象載玻片大小得芯片。這個芯片里面,就是做了8條通道。在這個通道得內表面,就是做了專門得化學修飾。它得化學修飾,主要就是用2種DNA

引物,把它(2種DNA引物)種在玻璃表面。這兩種(DNA引物得)序列就是與接下來要測序得DNA文庫得接頭序列相互補得。而且這2種引物就是通過共價鍵,連到Flowcell上去。之所以要用共價鍵連到Flowcell上去,就是因為接下來有大量得液體要流過這個Flowcell,只有有共價鍵連接得這些DNA,才不會被沖掉。這就就是Flowcell。再接下來,講一下文庫、與文庫得制作(過程)所謂得DNA文庫,實際上就是許多個DNA片段,在兩頭接上了特定得DNA接頭,型成得DNA混合物。文庫有2個特點,第1個特點,就是當中這一段插入得DNA,它得序列就是各種各樣得。第2個特點,它得兩頭得接頭序列,就是已知得,而且就是人工特地加上去得。要做這個文庫,首先就是把基因組DNA,用超聲波打斷。然后打斷之后,兩頭用酶把它補平,再用Klenow酶在3’端加上一個A堿基。然后,再用連接酶把這個接頭給連上去。連好了接頭得DNA混合物,我們就稱為一個“文庫”。英文也稱作“l(fā)ibrary”。做好了Library之后,就要做橋式PCR了。橋式PCR,實際上就是把文庫種到芯片上去,然后進行擴增,這樣得一個過程。這個過程,首先就是把文庫加入到芯片上,因為文庫兩頭得DNA序列,與芯片上引物就是互補得,所以,就會產生互補雜交。雜交完了之后,我們在這里面加入dNP與聚合酶。聚合酶會從引物開始,延著模板合成出一條全新得DNA鏈來。新得這條鏈,與原來得序列就是完全互補得。接下來,我們再加入NaOH堿溶液。DNA雙鏈在NaOH堿溶液存在下,就解鏈了。而且被液流一沖,原來得那個(模板)鏈,也就就是沒有與芯片共價連接得鏈,就被沖走了。而與芯片共價連接得鏈,就被保留下來。然后,我們再在液流池里加入中性液體,主要就是為了中與這個堿液,在加入中與液之后,整個環(huán)境變成中性了。這時侯,DNA鏈上得另外一端,就會與玻璃板上得第二種引物,發(fā)生互補雜交。接下來,我們加入酶與dNTP,聚合酶就延著第二個引物,合成出一條新鏈來;然后,我們再加堿,把2條鏈解鏈解開;然后,我們再加中與液,這時侯,DNA鏈會與新得引物雜交。再加酶,再加dNTP,又從新引物合成出新得鏈來。連續(xù)重復這一過程,DNA鏈得數(shù)量,就會以指數(shù)方式增長。在橋式PCR完成之后,接下來要做得工作,就就是要把合成得雙鏈,變成可以測序得單鏈。辦法就是通過一個化學反應,把其中一個引物上得一個特定得基團給切斷掉。然后,再用堿溶液來洗這個芯片。這時侯,堿讓DNA得雙鏈解鏈,那根被切斷了根得DNA鏈就被水沖掉了。留下那根共價鍵連在(芯片)上面得鏈。接下來,再加入中性溶液,然后在這個中性溶液里面加入測序引物。好,接下來正式得測序工作就開始了。那么,在測序得時侯,加入進去得,最主要就是2個東西:一個就是帶熒光標記得dNTP。而這個dNTP,它還有一個特點,它得3’末端就是被一個疊氮基堵住得。然后,再加一個聚合酶,聚合酶就會選擇:哪一個dNTP就是與原來位置上得那個堿基就是互補得,根據(jù)互補性原理,把這個dNTP合成到新得這個DNA鏈上去。因為這個dNTP得3’端就是被一個疊氮基團堵住了,所以,它一個循環(huán)只能延長一個堿基。然后,它就停在那兒了。合成完了之后,就用水把多余得dNTP與酶給沖掉。沖掉之后,就放到顯微鏡下,去進行激光掃描。根據(jù)發(fā)出來得熒光來判斷它就是哪個堿基。因為4種dNTP,它每一種dNTP上面標得熒光素都不一樣,根據(jù)紅、黃、藍、綠,它出來得哪種顏色,那么,就可以倒過來推出來,這個新合成上去得堿基,就是哪種堿基。因為新合成得堿基,就是與原來位置(得堿基)就是互補得,所以,又推出模板上那個堿基就是哪個。這一個循環(huán)完成之后,就加入一些化學試劑,把疊氮基團與旁邊標記得熒光基團切掉。切完了之后,3’端得羥基就暴露出來。再接下來,加入新得dNTP與新得酶,然后,又延長一個堿基。新延長完一個堿基之后,把多余得酶與dNTP沖掉,再進行一輪顯微得激光掃描,再讀一下這個堿基就是什么。不斷重復這個過程,可以重復上百次,到幾百次,就可以把上百個堿基,甚至更多堿基得序列讀出來。那么,什么就是Index哪？就是因為Illumina得評委會個測序量很大,往往一個樣本,用不了那么幾億條DNA。所以,科學家就想了一個辦法。在文庫得接頭上做了一些標記,每一個樣本,它有一個特定得接頭,每個接頭里面,它有一段特定得序列。這段特定得序列,我們就稱為Index。也有人把它叫做Barcode,反正,表達得就是一個意思:這么一段特定得序列,標記了樣本得來源。那么,要讀這個Index得序列,先用堿把上面這根測完“Read1”得序列,把上面這根DNA鏈給解鏈掉。解鏈掉之后,再加入中性液,然后,加入“Read2”這個測序引物。Read2測序引物結合得位點,正好,就在這個Index序列得旁邊。接下來,就進行第2輪測序,一般來說,就是讀6到8個堿基。把這6到8個堿基讀下來,我們就可以知道,這某一個具體得一段DNA,它來自于原始得哪個樣本。這就是Illumina得最核心得另外一個技術,就就是雙端測序。那么雙端測序,就就是說,一根DNA鏈,除了從正向讀一遍,還可以從DNA得負向,再讀一遍。這一下子就把Illumina測序得有效長度加了一倍。這就是非常有實際用途得。那么這個倒鏈得過程,就是這樣,先讓這個DNA先合成,合成出來這根互補鏈。有了這個互補鏈之后,用一個化學試劑,在原來這根鏈得根上切一下。切一下,原來這根模板鏈就掉了,剩下那根互補鏈。再接下來,就進行第2端得測序。第2端得測序原理,與第一端得測序原理就是一樣得。加上了“Read3”得這個引物,依次往下,一個一個堿基地往下讀。那么最重要得事情就是什么呢？一個點,經過幾百個循環(huán),就讀出了幾百個堿基。但實際上,這個芯片上可以有上億個點,上億個“cluster”,也就就是“簇”。那么上億個“cluster”,每個循環(huán),它都可以讀出地么多序列,這就是Illumina測序非常強大得原因。因為就是成千上萬,準確說就是上億上鏈都在合成,這個就得到了很大得一個測序數(shù)據(jù)量。IlluminaHiSeq測序儀得工作原理。也就就是芯片上發(fā)生了這么多變化,HiSeq就是如何把這些信息給讀出來,并且把掃描出來得熒光信號,又通過怎樣一系列得加工,變成可以識別得“A、C、G、T”得堿基序列得。HiSeq首先就是一臺高精度得顯微光學掃描儀。然后再配上了一整套得液流系統(tǒng),與計算機軟硬件,再加溫控系統(tǒng),組成這樣一臺測序儀。其中最核心,也就是結構最復雜得,就是它得光學系統(tǒng)。前一期,我們講了,Illumina測序儀主要就是靠4種dNTP分別帶有不同得熒光基團,在被激光照了之后,發(fā)出不同顏色得熒光。再通過對光得顏色得分辯,可以判斷出到底就是哪個堿基。這里,我們要說明一下:感光元件CCD,它本身就是色盲。所以,它一定要配合濾光片,才能分辯出顏色來。那我們先來瞧一下,HiSeq得光路圖。左邊這兩個元器件,就就是激光器。一個發(fā)出紅色激光,另一個發(fā)出綠色激光。其中紅色激光主要就是激發(fā)A與C,這兩種堿基上得熒光基團;而綠色激光主要就是激發(fā)G與T,這兩種堿基上得熒光基團。紅色與綠色這兩束光,通過一面半透半反鏡,組成一道激光。這道激光打在Flowcell上。那么請注意,Flowcell就放在這個位置。在Flowcell里面,結合在DNA上得那個熒光基團在激光得照射下,就發(fā)出熒光。熒光通過3面半透半反鏡,與1面全反鏡,被分成4條光路,這4道光線,分別通過一道濾光片,這4張濾光片得濾過波長不一樣。這樣,這4道光在經過了濾光片之后,就變成了4種顏色不同得光線。然后,這4條顏色不同得光線,各自照在一面反射鏡上,通過反射鏡進入到CCD。這4個CCD就記錄到不同顏色得光線。HiSeq得光線掃描就是“線掃描”,與傳統(tǒng)得相機不一樣,傳統(tǒng)得相機就是面掃描。HiSeq采取了一種特定得叫“TDI”線掃描方式,TDI就是Timedelayintegration得縮寫。在HiSeq上之所以采取TDI掃描方式,因為它有非常明顯得優(yōu)點。第一個優(yōu)點,就就是它得掃描速度非?？?在HiSeq2500上,從Flowcell得一個Lane得一頭掃到另外一頭,也就就是一個“Swath”得掃描時間,大概只有20秒種不到。第二個好處,就就是它得掃描精度非常高。在最新得HiSeqV4版試劑上,它得光點密度,大概可以達到每平方毫米90萬個點,要掃描清楚這么高密度得光點,掃描儀得掃描精度就是可想而知得。TDI掃描得第三個好處,就是這種方式,可以把Flowcell得上表面、與下表面都掃描到。接下來,我們再要詳細介紹這張Flowcell。那么,先來瞧一下,這張flowcell有點象一張載玻片,在這一張片子里面,我們可以瞧到,它做了8條通道。每條通道,我們稱為一個Lane。這8個Lane之間,相互就是隔絕得。每個Lane得兩端各有一個小孔。這兩個小也孔,就就是液流流進、流出得地方。每個Lane得上表面與下表面,都分別以共價鍵得方式,種了2種DNA引物。這兩種DNA引物,就是與文庫接頭得兩頭序列相互補得。上一期(節(jié)目)我們已經說明了這一點。一個Lane里面,分成2個面,上表面、與下表面。上表面與下表面,都種了DNA引物,也都就是可以產生測序數(shù)據(jù)得。在每一條Lane得每一個面,又被分成了3個掃描通道,每個道被稱為一個“swath”。每條Swath就是從頭到底被連續(xù)掃描得。但就是它得數(shù)據(jù),在進行數(shù)據(jù)分析得時侯,就是被分割成16個小方塊。這每一個小方塊,被稱為一個“tile”。這樣一張Flowcell,總共就就是768個Tile。每個Tile在掃描得時侯,會根據(jù)4種顏色,產生4張照片。掃描完了之后,就要進行圖像處理。掃描出來得最原始得文件,它得格式就是“、tiff”文件。Tiff文件記錄了每個像素點上采集到得光強度。Tiff文件得優(yōu)點就是它就是完全無損,保留了所有得原始信息。但它也有它得不足之處。它得不足之處就就是它得這個文件太大了。它得數(shù)據(jù)量很大,既不便于數(shù)據(jù)得傳輸,也不便于數(shù)據(jù)得存儲。接下來,計算機軟件就把圖像文件轉化成光點文件。光點文件叫“、BCL”文件。也就就是“Basecalling”得英文縮寫。要把圖像文件,轉化成BCL文件,就就是把4種顏色得4張照片,組合在一起,變成一張有4種顏色得彩色照片。這其中首先要解決得,就是4張照片在空間位置上得匹配問題,因為4張照片就是通過4個CCD分別拍下來得,所以,會有一定得空間上得偏差。軟件要通過對4張照片上,亮點相互比對,找到最合適得、匹配得位置。這里,我們要說明一下,如果被測得文庫就是堿基不平衡得文庫,在這個空間匹配上就會遇到問題。什么叫堿基平衡呢？也就就是說,在測序過程當中,每個循環(huán),A、C、G、T四種堿基,都就是比較均勻在存在得。最典型就是人全基因組文庫,這就是一個典型得堿基平衡文庫。那什么就是堿基不平衡文庫呢？最典型得,就就是PCR擴增子產生得文庫。PCR擴增子得特點:PCR就是有特定得起始位點得,一個特定得測序循環(huán)中,幾乎所有得片段都就是同一種堿基,而剩下得3種堿基,就特別少。這在反映到照片上去得時侯,就變成:一張照片特別亮,光點很多。而其它得三張照片就特別暗,上面得光點就很少。這時侯,要軟件做空間上得比對,軟件就會覺得困難,因為對于那幾張暗得照片,軟件很難判斷上面得光點,就是否與那張亮得照片上得光點真正對得上。結果,就就是判斷出來得可靠性變差。最后,就就是測序得數(shù)據(jù)質量變差,有效數(shù)據(jù)量也會變少。要解決這個問題,辦法就是在測序過程中摻入一些堿基平衡得文庫。例如摻人全基因組文庫。或者也可以摻Illumina提供得標準得PhiX文庫,這些都就是堿基平衡文庫。它得作用,就是在每個循環(huán)當中,為每一種顏色得照片,都提供足夠多得亮點。這樣,它可以彌補那些不平衡得文庫當中缺亮點得問題。當把4種顏色得光點組成一個文件之后,軟件就會生成一個“、BCL”文件?！?、BCL”文件就就是光點文件,它對每個光點,記錄了以下得內容。首先一個光點處在哪個Lane里面。其次,這個光點在這個Lane得哪個Tile里面。第3,就就是這個亮點在這個Tile得X軸與Y軸得座標位置。第4,就是記錄了這個光點當中“紅、黃、藍、綠”四種光得對應得光強。這個圖就是BCL文件得一個示意圖。實際上,BCL文件就是二進制文件,無法拿來直接閱讀。也正就是因為BCL文件難于閱讀,并且很難改動,所以,BCL文件幾乎不存在做假得可能。在測序過程當中,有許多客戶會要求測序公司提供原始得測序數(shù)據(jù),如果客戶就是包Lane、或者包Flowcell得,一般測序公司就是可以提供BCL文件得。客戶在拿到BCL文件之后,可以用“BCL2FASTQ”這個軟件,把BCL文件轉化成FASTQ序列語文件。以此,客戶可以來驗證,測序公司提供得數(shù)據(jù)就是否就是原始得,就是否就是真實得。再說一下最初生成得那個tiff文件。tiff文件實在太大了,所以,測序儀在測序過程中,只把tiff文件作為中間文件。最后就是把這個tiff文件刪掉得。如果客戶想要原始得圖像文件,在HiSeqV4之前,可以讓測序公司保留“、CIF”文件。CIF文件就是一種彩色圖案得向量文件,它得優(yōu)點就是比tiff文件得數(shù)據(jù)量小很多。測序公司把CIF文件給客戶之后,客戶就可以瞧到原始得圖像文件了。但就是,請注意:在HiSeq升級到V4之后,保留CIF文件得這個選項就是被取消掉了。所以,對于要測V4Lane得客戶來說,就是拿不到CIF文件了。接下來,我們講一下堿基識別。我們之前講:4種dNTP,各標一種熒光基團,紅、黃、藍、綠,四種顏色,根據(jù)顏色來判斷堿基種類。這個實際上就是一種簡化了得說法。實際情況,要比這個復雜得多。來瞧這個圖,這就是2種熒素得熒光得波長圖。我們會發(fā)覺,這兩種熒光色,它發(fā)出來得發(fā)射光,它在波長上就是有交疊得。在X得這個位置,主要就是綠色熒光素得貢獻,但就是藍色熒光素,也有少許貢獻。而在Y這個波長位置,藍色熒光素就是做了主要貢獻,但就是綠色熒光素,也有少量供獻。在實際測序過程中,就是4種熒光素發(fā)出得亮,相互有交疊,相互之間得交系,變得更加復雜。那么,現(xiàn)在我們要做得事情,就是把A、C、G、T,4種熒光素得貢獻給拆開。首先,我們就要確定4種熒光素在4個被測波長處得貢獻率。我們可以瞧一下,這個表,就就是4種熒光素,在4個波長分別有不同得貢獻率。這樣就組成一個4X4得貢獻率表格。我們在實際得分析當中,等于解一個4元1次、4聯(lián)方程。因為就是4個未知數(shù),又就是4個方程,所以肯定就是可以解出來得。說解方程,有點復雜。那么我們來打一個比方。讓大家來理解這個事情。假設有一家飯店,它有4個熟客:甲、乙、丙、丁。它日常又提供4道菜:豬肉、白菜、黃瓜、花生。大廚知道:甲最愛吃豬肉、乙最愛吃白菜、丙最愛吃黃瓜、丁最愛吃花生,每個人來了飯店之后,主要吃自己最愛吃得,也會吃些別得菜,但別得菜都吃得不就是太多。那么這個大廚不到前臺,瞧不到今天來得客人。如果,這個大廚想要知道今天來得客人就是誰,她有什么辦法呢？瞧今天哪個菜被吃掉得最多。如果今天得菜被吃掉得最多得就是豬肉,那她可以大致地判斷,今天就是甲來過了;如果她瞧到今天被吃掉得菜,最多得就是白菜,很可能就是乙來過了;那么其它得,道理也就是一樣得。希望這個例子可以幫大家來理解一下,這4個熒光與4種堿基得判讀得關系。接下來,我們再講一下,Phasing與Prephasing。在Illumina得測序過程當中,一個簇,大概有5千個到1萬個分子。但就是在邊合成、邊測序得過程當中,每一步酶反應,理想情況下,應該這5千個分子都延長1個堿基。但實際情況,總有少量分子沒有完成延長反應。也就就是說,總有少量得分子會掉隊,我們稱這種掉隊得現(xiàn)象叫“phasing”。Phasing主要就是由于酶活性不足,所引起得。如圖所示,掉隊得這個分子,它所發(fā)出得熒光信號,與大部隊所發(fā)出得熒光信號就是不一樣得。這個循環(huán)得次數(shù)越多,掉隊得分子就越多。所以,測序越到后面,它Phasing得分子數(shù)就越多。最后,信號得可靠性就越差。除了掉隊得分子,還會有一部分分子,會跑得超前,也就就是在一個循環(huán)中,它延長了2個堿基。在一個循環(huán)中延長了2個堿基得最主要得原因,就是dNTP上標記得那個疊氮基團(N3)掉了。我們知道,疊氮基團就是非常容易從有機化合物上掉落得。當疊氮基團掉落之后,dNTP得3’端得羥基就暴露出來了。當丟失了疊氮基團得dNTP加到(合成鏈得)3’端之后,它得聚合反應不會終止,而就是會繼續(xù)往前走。當再加上了一個帶疊氮基團得dNTP之后,這個聚合反應才停下來。這樣得后果,就就是一個循環(huán),某些分子,會合成了2個堿基。也就就是說比大部隊多走了一步。那么這個多走了一步得堿基,它所發(fā)出來得熒光顏色,也就是與大部隊不一樣得。在Illumina測序過程當中,Phasing與Prephasing就是限制測長得最主要原因。也就就是說,隨著循環(huán)不斷進行,越來越多得分子掉隊,還有越來越多得分子超前。然后,它們所產生得噪音,掩蓋了大部隊得信號得時侯,也就就是測序開始測不準得時侯。在HiSeq測序當中,從第12個循環(huán)開始,在計算某個光點就是哪種堿基得時侯,就要把Phasing與Prephasing得影響,納入考慮。為了對光點當中熒光素得純粹程度進行描述,Illumina公司定義了個標準,叫“chastity”,Chastity得定義,就就是濃度最高得那個熒光素得量,去除以“它自己+排名第二得熒光素得量得與”。大于0、6就是一個好堿基。用更加通俗得話來說,也就就是“老大”比“老二”,如果大于、等于“1、5倍”,這就就是個“好”堿基。如果“老大”比“老二”不足“1、5倍”,這就就是個“壞堿基”。Illumina對每個read得質量都要做一個檢驗,這個檢驗就叫“passfilter”檢驗。檢驗得標準,就是瞧前25個堿基當中,有幾個就是“壞堿基”。如果只有一個、或者沒有壞堿基,則Passfilter就通過;如果有超過一個以上得壞堿基,Passfilter就不能通過。那我們平時說,測序服務保證多少“PFdata”,指得就就是PassFilter(PF)得數(shù)據(jù)。PassFilter最主要得作用,就就是把那些一個光點當中,含了幾個cluster得那些點,給去掉。只剩下那些純粹得單克隆得read,作為合格得數(shù)據(jù),提交給客戶。我們平時說“PF率”,指得就就是PassFilter得Reads數(shù),占總得、測到得Reads數(shù)得比例。PF率可以從一個側面反映測序得質量。一般來說,如果上樣密度過高,PF率就可能會下降。一個堿基得QualityScore,也就就是這個堿基得質量分數(shù)(Q值)。這個就是通過這個堿基被誤判得可能性,換算出以10為底得對數(shù),再乘以“-10”得到得這樣一個數(shù)字。這個Q值,有點象我們說黃金得純度,我們說“三九金”,或者說“四九金”,就就是指99、9%得純度得金子,或者就是99、99%得純度得金子。我們平時說Q30,就就是指一個堿基得可靠性達到99、9%?；蛘哒f,它得出錯得可能性小于千分之一。同樣道理,我們說Q40,就就是指一個堿基得可靠性就是99、99%?；蛘哒f,它得出錯得可能性就是萬分之一。那么,我們經常說Q30比例,所謂得“Q30比例”,就就是在全部PF數(shù)據(jù)當中,達到、或者超過Q30質量標準以上得數(shù)據(jù),占所有PF數(shù)據(jù)得比例,叫Q30比例。Q30比例,可以表征一個測序過程得質量得好壞。一個堿基得質量分數(shù),不就是以數(shù)字方式,直接記錄到最后得Fastq文件得。而就是把它得Q值,加上33,再用ASCII碼表轉換成一個字母,把這個字母錄入Fastq文件。這樣做,有2個好處。如果我記2位數(shù)字,那么就占2個字節(jié),現(xiàn)在用一個字母來記錄,只占一個字節(jié)。那(數(shù)據(jù)存儲)空間就節(jié)省了很多。第二個好處,用ASCII碼字母表,一個堿基,只對應一個字母;如果就是用2位數(shù)字來記錄,就有可能發(fā)生移碼錯誤。而用ASCII碼,一個字母來記錄,就不太容易發(fā)生移碼錯誤。在軟件做完上述所有得數(shù)據(jù)處理之后,就會生成一個Fastq文件。Fastq文件里,主要包含了3部分內容。第一個部分,就是每個Read得目錄信息。也就就是這個Read來自于哪臺HiSeq、第幾個run、第幾個Lane、與第幾個Tile,以及在這個Tile得X、Y得什么位置。接下來,就就是所測到得堿基得序列。最后,就是這些堿基序列對應得質量分數(shù)信息。這個,就就是Fastq文件。到Fastq文件之后,測序儀所要完成得工作,就完全完成了。Pacbio就是目前讀長最長得測序技術公司。它得讀長,最長可以達到2萬到3萬個堿基,平均可以達到8千多個堿基。相比于llumina與IonTorrent得幾百個堿基得讀長來說,有著明顯得優(yōu)勢。PacBio得測序原理,與別得高通量測序得原理,基本上也就是一樣得。也就是邊合成,邊測序。首先,這個聚合酶就是固定在測序小孔得玻璃底板上。這個聚合酶又與DNA模板、測序引物就是結合在一起得。然后加入帶4色熒光得dNTP底物,這些dNTP都在其磷酸基團上被標上了熒光基團,四種堿基、各標一種顏色。當一種與聚合酶正要合成得堿基一致得dNTP被酶抓住得時候,酶就會長時間地抓住這個dNTP,不讓這個dNTP漂走。這時侯,激發(fā)光從小孔得底部照進來,打在這個被抓住得dNTP上,就會在較長時間內發(fā)出熒光。儀器根據(jù)所拍到得熒光得顏色,就可以來判斷,這個堿基就是哪種堿基。一個循環(huán)得聚合反應發(fā)生完畢之后,焦磷酸基團就從原來得dNTP上掉下來,因為熒光基團就是連到這個焦磷酸上得,所以這個熒光基團也就一起掉下來了,在溶液中就會漂走。接下來,進行第二、第三個循環(huán)……,一直進行下去。一張芯片上有幾萬個孔,同時進行測序,這樣一次就可以得到幾億個堿基得序列。接下來,分幾個要點,來說明這個測序得過程。與Illumina一樣,PacBio也采用了4色熒光基團來標記dNTP,但就是PacBio得標記與Illumina得標記有所不同,PacBio得熒光基團直接就是標在dNTP得3'端得磷酸基團得末端得。這樣標記得好處就是:當一個聚合反應得循環(huán)完成得時侯,dNTP上得那兩個磷酸基團就掉下,連在這個磷酸基團上得熒光基團也隨一塊兒掉下來。它掉下來之后,就在溶液中漂走,不會影響接下來得測序過程了。然后,我們說一下這個測序小孔得設計。這個測序小孔叫ZeroModelWaveguide,簡稱ZMW。小孔得直徑很小,光只能在小孔中傳輸很短得距離。這個特點對PacBio得測序很重要。因為酶就是被固定在玻璃底板上得,所以,只有互補得dNTP被酶抓到得時侯,這個dNTP才會較長時間地停留在離玻璃底板很近得位置。也只有這樣,才會被激發(fā)光照到,并且發(fā)出它得熒光。PacBio得光學設計中,入射光就是幾百納米波長得可見光,光從小孔得底部得玻璃處照到小孔中來。這個,只有70納米。其它游離得dNTP,只會非常短暫地進入小孔,又很快漂走。所以,這些游離dNTP帶來得得噪音(信號),就被抑制在很低得水平。接下來,我們說一下PacBio得建庫。PacBio得建庫就是比較特別得。它得庫就是在DNA片段得兩段各接一下發(fā)夾型得接頭。接好了發(fā)夾形得接頭之后,形成得文庫就是一個啞鈴形得文庫。這種啞鈴形狀得文庫有個好處,那它整個分子實際上就是一個圓環(huán)。在測序得過程中它可以周而復始地進行測序,這對于發(fā)揮PacBio得長讀長得優(yōu)勢就是很有益處得。接下來,我們說一下PacBio它測序長度優(yōu)勢得來源。這個來源,就是因為它測得就是個單個分子。相比之下,Illumina或者IonTorrent測得都就是一簇分子?；蛘哒f它們測得都就是一大堆分子。當它測一大堆分子得時侯,每個循環(huán),多多少少,總有一些分子落后;也多多少少,有些分子超前。這些落后、或者超前得分子,在每個循環(huán)里面就會給出噪音。而且,隨著循環(huán)次數(shù)越來越多,落后、與超前得分子也會越來越多,達到一定程度得時侯,噪音就會很大,大到會掩蓋掉信號。當噪音大到掩蓋掉信號得時侯,實際上測序就測不準了。相比之下,PacBio它只有一個分子,所以,它不存在同步問題。這就讓它可以測到幾千、基至上萬個BP都可以達成。接下來,我們要說一下PacBio測序得缺點。最大得缺點就是對堿基得判讀不準。它得錯誤率就是12、5%。也就就是說,它每讀8個堿基,就有一個就是讀錯得。那么它主要得錯誤類型就是"插入"。也就就是說,它會多讀一個堿基。好在,它得這種錯誤就是隨機得。也就就是說,您在這個地方再讀一遍,它不一定會發(fā)生同樣得錯誤。那么,對于同一個序列,多測幾遍之后,這些偶然誤差,可以被校正過來。接下來,我們說一下限制PacBio讀長得因素。第一個因素,就就是DNA鏈上出現(xiàn)了缺口。測序過程中就是用激光照射來發(fā)出熒光得,所以當強光長時間照射DNA鏈得時侯,DNA鏈就有可能被照斷掉,出現(xiàn)缺口。當酶讀到這個缺口得時侯,酶就從模板鏈上掉下來。這時侯,測序就終止了。這就是第一種可能。第二種可能,就是光線照射情況下,酶有可能會變性,當酶發(fā)生了變性之后,失去了聚合酶得功能,這時侯,測序也會終止。第三個限制因素,就是文庫本身得長度。因為要做片段長度大于20~30K得文庫,就是有相當大得困難得,所以,文庫本身得質量,在一定程度上,也限制了PacBio得讀長。在高通量測序當中,測序得通量,就是一個很重要得技術指標。那PacBio大根一張芯片一次可以測到0、3~0、4G得數(shù)據(jù)。在PacBio測序中,芯片上得小孔數(shù)就是第一個絕對得、限制性得因素。目前得芯片,就是有15萬個小孔。但這15萬個小孔