葡萄糖氧化酶及其應(yīng)用

葡萄糖氧化酶及其應(yīng)用【摘要】:葡萄糖氧化酶是一種需氧脫氫酶,對(duì)人體無(wú)毒、副作用，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料等行業(yè)中，起到了去除葡萄糖、脫氧、殺菌等作用。該文從葡萄糖氧化酶的性質(zhì)、生產(chǎn)和應(yīng)用等方面對(duì)其進(jìn)行了簡(jiǎn)單介紹?！娟P(guān)鍵詞】：葡萄糖氧化酶性質(zhì)生產(chǎn)應(yīng)用TheglucoseoxidaseanditsapplicationAbstract:Glucoseoxidase(GOD)isanaerobicdehydrogenase.Ithasnosideeffectsandnon-toxicityonhuman.GOX，whichhasplayedanimportantroleonremovingglucose，de-oxidizationandsterilization，iswidelyapplicatedinfood,medicine,feedstuffandotherfields.Thispaperreviewstheproperty,productionandapplicationofGlucoseoxidase.KeyWords:Glucoseoxidasepropertyproductionapplication葡萄糖氧化酶（GlucoseoxidaseEC1.1.3.4.）全稱(chēng)為β-D-吡喃型葡萄糖需氧脫氫酶，簡(jiǎn)稱(chēng)GOD，它能在有氧的條件下專(zhuān)一性將β-D-葡萄糖氧化為葡萄糖酸和過(guò)氧化氫。早在1904年，人們就發(fā)現(xiàn)了葡萄糖氧化酶，但當(dāng)時(shí)對(duì)其商業(yè)價(jià)值認(rèn)識(shí)的不足，并未引起人們的重視。直到1928年，Muller首先從黑曲霉的無(wú)細(xì)胞提取液中發(fā)現(xiàn)葡萄糖氧化酶，并進(jìn)一步通過(guò)試驗(yàn)確定了酶的作用機(jī)理，并命名為葡萄糖氧化酶，之后把他歸入脫氫酶類(lèi)。葡萄糖氧化酶廣泛的存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)，微生物繁殖快，來(lái)源廣的特點(diǎn)事其成為葡萄糖氧化酶的主要來(lái)源，主要生產(chǎn)菌株為黑曲霉和青霉。其廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥等行業(yè)中，起到了去除葡萄糖、脫氧、殺菌等作用。產(chǎn)量低、酶活低、檢測(cè)方法復(fù)雜是GOD產(chǎn)業(yè)化的限制性因素。國(guó)外由于對(duì)葡萄糖氧化酶的研究較早，在菌種篩選、產(chǎn)酶條件的優(yōu)化、酶的分離純化、酶學(xué)特性以及葡萄糖氧化酶基因的克隆與表達(dá)等方面研究都已較為深入。相比國(guó)外，我國(guó)對(duì)葡萄糖氧化酶的研究工作起步較晚，從20世紀(jì)末期對(duì)其展開(kāi)了較為系統(tǒng)的研究。我國(guó)受技術(shù)水平以及儀器設(shè)備的限制，目前生產(chǎn)的工業(yè)酶制劑不僅生產(chǎn)成本高，而且純度以及穩(wěn)定性方面都達(dá)不到要求，工業(yè)酶制劑市場(chǎng)基本被國(guó)外企業(yè)所壟斷，而如何降低葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)成本和提高其應(yīng)用適應(yīng)性是急待解決的問(wèn)題[1]。1.葡萄糖氧化酶的性質(zhì)1.1物理性質(zhì)粉狀的葡萄糖氧化酶呈灰黃色，液狀的葡萄糖氧化酶為淡褐色，精制液體狀酶為淡黃色。易溶于水，不溶于不溶于乙醚、氯仿、丁醇、吡啶、甘油、乙二醇等有機(jī)溶劑，50%丙酮和66%甲醇能沉淀該酶，溶液在搖動(dòng)時(shí)泡沫呈棕綠色，不能透過(guò)硝化纖維膜。固體葡萄糖氧化酶在0℃條件下至少能保存2年，在-15℃下可保存8年[2]。1.2化學(xué)性質(zhì)葡萄糖氧化酶相對(duì)分子質(zhì)量一般在1.5×105左右，每分子酶含2分子FAD。pH作用范圍3.5~6.5，最適pH為5.0左右，在沒(méi)有保護(hù)劑存在的條件下pH>8.0或pH<3.0時(shí)會(huì)迅速失活。葡萄糖氧化酶的作用溫度范圍一般為30～60℃，最適作用溫度為50～55℃。葡萄糖氧化酶能高度特異性的結(jié)合β-D-吡喃葡萄糖，葡萄糖分子C1上的羥基對(duì)酶的催化作用是必要的條件，而且羥基位于β-位時(shí)酶的活性比位于α-位時(shí)酶的活性高大約160倍。底物的分子結(jié)構(gòu)在C1、C2、C3、C4、C5、C6位上的改變使葡萄糖氧化酶的活性大幅度下降，但在不同的程度上還表現(xiàn)出一定的活性，見(jiàn)表1。葡萄糖氧化酶對(duì)于L-葡萄糖和2-O-甲基-D-葡萄糖是完全沒(méi)有活性的[3]。表1葡萄糖氧化酶的底物特異性葡萄糖改性的位置

化合物

同β-D-葡萄糖的差別

相對(duì)速率

β-D-葡萄糖

100

1

α-D-葡萄糖

C1上OH的構(gòu)型

0.64

續(xù)表1葡萄糖氧化酶的底物特異性葡萄糖改性的位置

化合物

同β-D-葡萄糖的差別

相對(duì)速率

2

2-脫氧-D-葡萄糖

C2上OH被H取代

3.3

曲霉米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)、土曲霉（Aspergillusterreus）其他菌屬鐮刀霉屬(Fusarium)、檸檬酸霉屬(Citromyces)2.2利用菌株誘變獲得葡萄糖氧化酶對(duì)葡萄糖氧化酶生產(chǎn)菌株的誘變通常采用紫外誘變和化學(xué)誘變劑誘變等方法［6］。紫外線照射通過(guò)改變菌體DNA從而引起菌體的突變。李筱瑜等人[7]。將黑曲霉菌株P(guān)-采用紫外線進(jìn)行誘變，得到突變菌株U-69產(chǎn)酶酶活是出發(fā)菌株P(guān)-的2.5倍.化學(xué)誘變是用化學(xué)誘變劑處理菌種，以誘發(fā)遺傳物質(zhì)的突變。化學(xué)誘變相比于紫外誘變更具定向性，化學(xué)誘變劑不同，作用的菌株、細(xì)胞及基因不同，誘變的效果也會(huì)存在差異。常用的化學(xué)誘變劑有甲基磺酸乙酯(EMS)和硫酸二乙酯(DES)等[1]。選擇單獨(dú)一種誘變方法，也可以幾種方法復(fù)合使用，篩選出其中的正突變菌株，提高原始菌株產(chǎn)酶能力。2.3利用基因重組技術(shù)獲得葡萄糖氧化酶工業(yè)化生產(chǎn)中常用黑曲霉或青霉發(fā)酵來(lái)獲得葡萄糖氧化酶，但黑曲霉和青霉菌發(fā)酵過(guò)程中常會(huì)伴隨產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶淀粉酶等其他雜蛋白，給后期的分離純化工作帶來(lái)困難，因此用基因工程方法構(gòu)建更優(yōu)良的葡萄糖氧化酶生產(chǎn)菌株一直受到各國(guó)科學(xué)家的注視。將葡萄糖氧化酶的基因進(jìn)行克隆，連接相應(yīng)的表達(dá)載體后轉(zhuǎn)化基因工程菌株，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)葡萄糖氧化酶基因來(lái)獲取大量的葡萄糖氧化酶蛋白。由于基因工程菌株分泌到基質(zhì)中的其本身內(nèi)源蛋白量很少，基質(zhì)中主要是基因工程菌株分泌到胞外的外源目的蛋白，因此能簡(jiǎn)化后期的蛋白純化操作。目前國(guó)外主要用基因克隆、表達(dá)來(lái)提高菌株的產(chǎn)酶活力，在這一領(lǐng)域研究已經(jīng)比較深入。WhittingtonH成功地將青霉菌的GOD基因?qū)氲结劸平湍钢?，獲得了具有生物活性的；Szynol實(shí)現(xiàn)了葡萄糖氧化酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)［8］；SilviaCrognale將一株青霉的葡萄糖氧化酶基因成功導(dǎo)入到畢赤酵母中，發(fā)酵培養(yǎng)酶活達(dá)到50U/ml;國(guó)內(nèi)在這一方面的研究也取得了一定的進(jìn)展。母敬郁等[9]采用瑞氏木霉表達(dá)了黑曲霉來(lái)源的葡萄糖氧化酶基因，經(jīng)過(guò)對(duì)重組后的瑞氏木霉進(jìn)行誘變篩選，突變株的葡萄糖氧化酶發(fā)酵液酶活達(dá)到25U/ml。目前已有多種外源基因表達(dá)系統(tǒng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)等大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)雖然發(fā)展較為成熟，操作簡(jiǎn)單、周期短、產(chǎn)量高，但其表達(dá)產(chǎn)物無(wú)翻譯后的修飾與加工過(guò)程，不能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯，酵母繁殖速度快、易于培養(yǎng)、基因工程操作簡(jiǎn)便，并能夠?qū)δ康牡鞍走M(jìn)行翻譯后加工與修飾，越來(lái)越廣泛地用作外源基因表達(dá)的宿主菌株［1］。雖然目前利用基因工程的手段實(shí)現(xiàn)了葡萄糖氧化酶的異源表達(dá)，但是由于表達(dá)量不高導(dǎo)致的生產(chǎn)成本高的問(wèn)題仍然沒(méi)有得到有效的解決，阻礙了葡萄糖氧化酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用。因此如何采用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)葡萄糖氧化酶基因的高效表達(dá)，使葡萄糖氧化酶的產(chǎn)量得到大幅度的提高成為了亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。3.葡萄糖氧化酶的應(yīng)用葡萄糖氧化酶由于具有催化專(zhuān)一性、高活性和催化高效性，對(duì)人體無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)被廣泛地應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)藥、飼料添加等方面。其最主要的用途是生產(chǎn)葡萄糖酸及作為抗氧化劑而廣泛用于食品保鮮過(guò)程中。3.1葡萄糖氧化酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用目前葡萄糖氧化酶在食品工業(yè)中主要應(yīng)用在以下五個(gè)方面：脫氧、改良面粉、去葡萄糖、測(cè)定葡萄糖含量、殺菌。3.1.1脫氧葡萄酒、啤酒、果汁、奶粉等食品常常出現(xiàn)變色、渾濁、沉淀等現(xiàn)象，影響了產(chǎn)品的品質(zhì)究其原因是因?yàn)檠鯕庋趸似渲械倪€原性物質(zhì)如黃酮、亞油酸、亞麻酸等。GOD可快速高效地去除食品中的氧氣，保護(hù)食品中還原性物質(zhì)不被氧化破壞，達(dá)到脫氧保鮮的效果[10]。在啤酒生產(chǎn)中，氧氣的存在一方面會(huì)導(dǎo)致啤酒的色澤加深、氧化變質(zhì)，同時(shí)氧氣又為微生物的生長(zhǎng)提供了便利條件，降低保存期，通過(guò)添加無(wú)毒副作用的葡萄糖氧化酶可以將葡萄糖氧化成葡萄糖酸內(nèi)酯，葡萄糖酸內(nèi)酯性質(zhì)較穩(wěn)定，沒(méi)有酸味、無(wú)毒副作用，對(duì)啤酒的質(zhì)量沒(méi)有什么影響，而且不具有氧化能力。并且反應(yīng)在消耗氧氣的同時(shí)產(chǎn)生過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫本身就是一種殺菌劑，可以抑制微生物的生長(zhǎng)，氧氣的消耗減緩了啤酒的氧化變質(zhì)過(guò)程，有效防止啤酒老化，明顯降低啤酒濁度，改善啤酒的風(fēng)味，延長(zhǎng)啤酒的保質(zhì)期。葡萄糖氧化酶的價(jià)格適宜,添加量少,每瓶啤酒只需加入10單位葡萄糖氧化酶,可使總氧從2.5mg/L降為0.05mg/L,去氧達(dá)98%,去氧效果之佳為其他同類(lèi)產(chǎn)品所無(wú)法比擬。每瓶啤酒(640mL)成本才人民幣0.003元。不需要增添任何設(shè)備,不需改變?cè)a(chǎn)工藝,使用方便,適合大生產(chǎn)使用。在酸奶和各種發(fā)酵乳的生產(chǎn)中，添加GOD消耗掉氧氣，延緩產(chǎn)品氧化變質(zhì),乳酸菌采用厭氧發(fā)酵，GOD的加入不會(huì)影響功能性乳制品中的益生菌，同時(shí)能抑制好氧雜菌的生長(zhǎng)，提升了乳制品的品質(zhì)和風(fēng)味［11］.在水果貯存中,GOD脫除氧氣，水果的非酶褐變得到抑制，水果的品質(zhì)及儲(chǔ)存期都得到改善。3.1.2改良面粉葡萄糖氧化酶是面粉改良劑與面包品質(zhì)改良劑。傳統(tǒng)的小麥粉強(qiáng)筋劑以溴酸鉀的應(yīng)用最為普遍，但經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)溴酸鉀能夠使動(dòng)物組織致癌，不利于人體健康。目前，GOD作為面粉改良劑溴酸鉀的替代品，已經(jīng)用作一種更為安全的面粉改良劑［12］。改良面粉的原理是，GOD催化β-D-葡萄糖生成過(guò)氧化氫，而面筋蛋白中的巰基(-SH)在過(guò)氧化氫的作用下被氧化形成二硫鍵(-S-S-)，而二硫鍵的形成有助于面團(tuán)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成；同時(shí)面粉中過(guò)氧化物酶作用于過(guò)氧化氫產(chǎn)生自由基，促進(jìn)戊聚糖的氧化交聯(lián)反應(yīng)，有利于可溶性戊聚糖氧化凝膠形成較大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了面團(tuán)的彈性在這個(gè)過(guò)程中需要控制GOD的添加量，否則多余的酶不利于強(qiáng)筋作用。GOD在面包焙烤中能夠改善耐機(jī)械攪拌性、入爐急漲特性等影響面包品質(zhì)的關(guān)鍵因素，使面團(tuán)更加穩(wěn)定，增大面包體積，增加彈性，改善面包的外形和口感。3.1.3去葡萄糖食品加工工藝中部分糖蛋白分解后，還原糖的醛基和氨基酸的羧基會(huì)產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，使產(chǎn)品褐變，破壞產(chǎn)品品質(zhì)，全球每年因?yàn)槊览路磻?yīng)造成的食物浪費(fèi)都很巨大。GOD能將葡萄糖分子上的醛基轉(zhuǎn)變?yōu)轸然?，消除美拉德反?yīng)，從而抑制食品的非酶褐變，保持產(chǎn)品的色澤和溶解性。將GOD添加到蛋白粉、果醬制品等糖含量較高的食品中，能除去葡萄糖，抑制產(chǎn)品加工過(guò)程中產(chǎn)生的褐變。同時(shí)由于葡萄糖含量降低，微生物生長(zhǎng)受到抑制，產(chǎn)品的貨架期得以延長(zhǎng)[12]。3.1.4葡萄糖的定量分析酶的專(zhuān)一性的特點(diǎn)，使得GOD可用于測(cè)定各種食品和混合物中葡萄糖含量。目前用固定化技術(shù)制成的GOD分析儀已用于測(cè)定發(fā)酵液的殘?zhí)橇浚摲椒ê?jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確,真正起到了指導(dǎo)生產(chǎn)的作用。據(jù)此原理制成的葡萄糖測(cè)定試劑盒，可定量測(cè)定果汁、飲料及牛奶等多種食品中葡萄糖的含量。3.1.5殺菌由于葡萄糖氧化酶的脫氧作用，消耗氧氣，從而有效的抑制了好氧微生物的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫本身就是一種殺菌劑。在實(shí)際的生產(chǎn)應(yīng)用中，常將過(guò)氧化氫酶與葡萄糖氧化酶組成酶系添加于食品中，這樣既能利用過(guò)氧化氫的殺菌作用，同時(shí)由于過(guò)氧化氫酶的存在能去除殘留在食品中的過(guò)氧化氫，不僅延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期，對(duì)食品的品質(zhì)也不會(huì)造成影響。GOD相比于其他化學(xué)抑菌劑的優(yōu)勢(shì)在于其作為生物制劑安全性更高，添加于食品中更加安全放心。3.2葡萄糖氧化酶在吃飼料行業(yè)中的應(yīng)用葡萄糖氧化酶是一種新型的酶飼料添加劑，能夠改善動(dòng)物腸道環(huán)境，調(diào)節(jié)飼糧消化，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。含葡萄糖氧化酶、乳酸過(guò)氧化物和乳鐵蛋白的混合飼料添加劑，可用于預(yù)防牲畜胃腸道感染、腹瀉，并有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)作用。由于葡萄糖氧化酶能催化腸道內(nèi)的葡萄糖產(chǎn)生葡萄糖酸和過(guò)氧化氫，當(dāng)過(guò)氧化氫積累到一定濃度時(shí)，直接抑制大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、巴氏桿菌、葡萄球菌、弧菌的生長(zhǎng)繁殖。其作用機(jī)理完全不同于抗生素，不會(huì)產(chǎn)生菌體抗藥性或藥物殘留。葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖去除腸道內(nèi)氧氣，為厭氧有益菌雙歧桿菌的增殖制造厭氧環(huán)境。生成的葡萄糖酸可降低胃腸內(nèi)pH值，為乳酸菌生長(zhǎng)制造酸性環(huán)境。有益菌大量增殖形成微生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，不利于大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等有害菌的存活，控制感染，排除腐敗物質(zhì)，提高巨噬細(xì)胞活性，從而提高機(jī)體免疫力。葡萄糖氧化酶可以作為單一酶制劑，添加到動(dòng)物的基礎(chǔ)日糧中，也可與其它功能成分組成復(fù)合添加劑，如飼用動(dòng)物腸道保護(hù)劑、飼用動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、飼料霉菌毒素脫除劑等。其作為一種新型綠色的飼料酶制劑，已被廣泛應(yīng)用于雞用配合飼料、豬用配合飼料、牛羊配合飼料以及其他配合飼料，然而由于微生物發(fā)酵制備高產(chǎn)高活葡萄糖氧化酶還存在一定困難，從而制約了葡萄糖氧化酶在我國(guó)飼料工業(yè)中的規(guī)模化應(yīng)用[13]。3.3葡萄糖氧化酶在醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用葡萄糖氧化酶和乳酸過(guò)氧化物酶（LPO）、淀粉葡糖苷酶、葡聚糖酶、溶菌酶等酶制劑可除去或緩解牙斑、牙垢和齲齒的形成。含有葡萄糖氧化酶的藥物，其穩(wěn)定性提高3倍。含有GOX、LPO和含碘化合物等成分的制劑，可用于口腔衛(wèi)生除口臭，并具有抗頭皮屑的作用。含GOX和LPO的雙酶口香糖，在咀嚼時(shí)抑菌有效率達(dá)96%99%。GOX可用于對(duì)H2O2敏感的淋巴瘤的導(dǎo)向目標(biāo)的治療。作為試劑盒、酶電極等用于血清（漿）、尿液及腦脊液中葡萄糖的體外定量分析[4]。4、葡萄糖氧化酶的發(fā)展前景葡萄糖氧化酶是一種綠色、安全的酶制劑，在食品、醫(yī)藥、飼料等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用。但目前規(guī)模化生產(chǎn)高活性的葡萄糖氧化酶還有困難。發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖氧化酶的同時(shí)產(chǎn)生大量雜蛋白，分離提取復(fù)雜，成本高。國(guó)內(nèi)葡萄糖氧化酶產(chǎn)量與國(guó)外報(bào)道的最高產(chǎn)量120U/mL尚有差距，有待提高。酵母菌的基礎(chǔ)研究較透徹，生長(zhǎng)代謝速度快，是目前最有潛力的改造菌株，但基因工程構(gòu)建菌株耗資大，菌株易退化，工業(yè)生產(chǎn)還有難度。利用葡萄糖氧化酶延長(zhǎng)食品的保質(zhì)和保鮮期是非常有潛力的課題。葡萄糖氧化酶在動(dòng)物體內(nèi)的作用方式、最佳作用條件、代謝過(guò)程有待研究。如何更經(jīng)濟(jì)、更有效地制備和提純葡萄糖氧化酶也是今后研究的方向。隨著研究的不斷深入，葡萄糖氧化酶的應(yīng)用前景將會(huì)更加廣闊。參考文獻(xiàn)：[1]朱運(yùn)平，伍少明，李秀婷，等.微生物葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)及其在食品工業(yè)中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)食品添加劑，2013（5）：165-172.[2]劉超，袁建國(guó)，王元秀，等·葡萄糖氧化酶的研究進(jìn)展[J]·食品與藥品，2010,12（07）：285—289[3]何慶國(guó)，丁立孝主編·食品酶學(xué)·北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006[4]李艷，李靜·葡萄糖氧化酶及其應(yīng)用[J]·食品工程，2006（3）：9-11.[5]朱運(yùn)平，伍少明，李秀婷等.微生物葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)及其在食品工業(yè)中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]中國(guó)食品添加劑，2013（5）：165-172.[6]RayS,BnaikAK.EffectofammoniumandnitrateratioonglucoseoxidaseactivityduringgluconicacidfermentationbyamutantstrainofAspergillusniger[J].IndianJ.Exp.Biol.1999,37(4):391-395.[7]梁靜娟，李筱瑜，官威，等.產(chǎn)葡萄糖氧化酶黑曲霉的誘變選育及葡萄糖酸鈣發(fā)酵條件的研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，31(12):218-220.[8]SzynolA,SoetD,TuylE.Bactericidaleffectsofafusion