牛副流感病毒3型診斷技術規(guī)范

1牛副流感3型診斷技術規(guī)范本文件規(guī)定了牛副流感3型的臨床癥狀、病原分離鑒定、RT-PCR、ELISA等實驗室診斷技術要求。本文件適用于奶牛飼養(yǎng)場（戶）、肉牛飼養(yǎng)場（戶）和動物疫病診療單位對牛副流感病毒3型的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款，其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術語與定義下列術語和定義適用于本文件。3.1牛副流感病毒3型Bovineparainfluenzavirustype3,BPIV3牛副流感病毒3型，屬于副黏病毒科，呼吸道病毒屬成員，為有囊膜的單股負鏈RNA病毒。該病毒可引起牛以發(fā)熱、呼吸困難、流漿液性或黏膿性鼻液和咳嗽等呼吸道癥狀為特征的疾病。4縮略語下列縮略語適用于本文件。RT-PCR：逆轉錄聚合酶鏈式反應（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）TAE緩沖液：是由三羥甲基氨基甲烷(Trisbase)、乙酸(aceticacid)和乙二胺四乙酸(EDTA)組成的緩沖液FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）PBS：磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffersolution）5流行病學牛副流感3型一年四季均發(fā)，以秋冬、初春季多見。各種年齡牛均可感染。6臨床癥狀2病牛以高熱、呼吸困難和咳嗽為臨床特征。7實驗室診斷7.1病毒分離方法7.1.1材料棉簽、胎牛血清（FBS）或新生牛血清（NBS）、DMEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、細胞培養(yǎng)瓶（板）。7.1.2儀器電子天平、研磨儀、低溫高速離心機、生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、細胞培養(yǎng)瓶、冰箱。7.1.3細胞牛腎細胞（MDBK）和非洲綠猴腎細胞（Vero）。7.1.4病料采集7.1.4.1呼吸道拭子用無菌棉簽采取鼻道分泌物，然后放入含1000IU/ml青霉素和1000μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基的凍存管中，編號，記錄，2℃~8℃條件下盡快送往實驗室。7.1.4.2血清樣品用促凝管采集新鮮血液，靜置分離血清，編號，記錄，2℃~8℃條件下盡快送往實驗室。7.1.4.3組織樣品剛死亡的牛，采集肺組織樣品，放入離心管，編號，記錄，2℃~8℃條件下盡快送往實驗室。7.1.5樣品處理7.1.5.1拭子先經(jīng)凍融兩次，擰干棉拭子，將樣品液經(jīng)6000r/min離心10min，使用一次性注射器吸取上清經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌，-20℃以下保存?zhèn)溆谩?.1.5.2血清將促凝管中靜置分層的血清轉移到滅菌離心管，-20℃以下保存?zhèn)溆谩?.1.5.3組織按照體積比為1:3～1:5加入PBS（pH7.2～7.4使用組織研磨儀制成勻漿液，取懸液經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌，-20℃下保存?zhèn)溆谩?.1.6樣品接種取處理過的樣品200μl（樣品接種量根據(jù)細胞數(shù)目調整）接種到長滿80%的MDBK細胞（25cm2培養(yǎng)瓶），37℃吸附30min；加入含2%FBS或NBS的細胞培養(yǎng)液5ml，同時設對照組，置于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱。37.1.7結果判定逐日觀察細胞病變，培養(yǎng)5日后凍融兩次，繼續(xù)盲傳，觀察細胞病變。BPIV3致細胞病變特點：細胞大量脫落、貼壁細胞變長聚集形成網(wǎng)狀。盲傳三代后，若出現(xiàn)病變則收獲培養(yǎng)物，經(jīng)反復凍融，以3000r/min離心10min，取上清傳代擴繁病毒并進一步鑒定。7.2RT-PCR7.2.1材料移液器及吸頭、無菌無酶離心管、PCR管、病毒RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、PCR試劑盒、TAE緩沖液、瓊脂糖、核酸染料、引物（見附錄A）7.2.2儀器PCR儀、臺式冷凍離心機、電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像儀。7.2.3待檢樣品處理的樣品或細胞培養(yǎng)物。7.2.4病毒RNA提取用病毒RNA提取試劑盒對已處理的待檢樣品、陰性對照樣品、陽性對照樣品進行RNA提取，并使用核酸分析儀對RNA質量及含量進行測定。7.2.5RT-PCR反應體系7.2.5.1RT反應65℃保溫5min后，冰上迅速冷卻。在上述Microtube管加5×PrimeScriptIIBuffer4μl，RNase4.5μl，緩慢混勻。反應條件42℃45min，95℃5min后，冰上冷卻。7.2.5.2PCR反應25μl體系：Premix溶液12.5μl，上下游引物（見附錄A)各0.5μl，cDNA模板2μl，無菌無酶水9.5μl。反應條件為：95℃預變性5min,95℃30s，50℃30s，72℃60s，進行35個循環(huán)，72℃延伸10min。7.2.6結果判定取PCR產(chǎn)物10μl，在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，電壓100V，時間30min，電泳結束后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結果。當陽性對照樣品出現(xiàn)400bp擴增帶、陰性對照樣品無擴增帶出現(xiàn)時，試驗結果成立。被檢樣品出現(xiàn)400bp擴增帶為牛副流感病毒陽性，否則為陰性。7.3酶聯(lián)免疫吸附試驗7.3.1材料4牛副流感病毒3型重組N蛋白、陰性血清對照、陽性血清對照、辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG、抗原包被緩沖液（見附錄B.1）、洗滌液（見附錄B.2）、封閉液（見附錄B.3）、TMB底物顯色試劑盒和終止液（見附錄B.4）。7.3.2儀器設備酶標板，酶標儀，移液器及吸頭。7.3.3操作方法7.3.3.1抗原包被BPIV3重組N蛋白用包被緩沖液稀釋至終濃度為0.05μg/ml包被反應板，每孔100μl，4℃包被16h。7.3.3.2洗板甩掉孔內的包被液，洗滌液洗滌三次，200μl/孔。7.3.3.3封閉每孔加封閉液，200μl/孔，置37℃封閉1h,洗滌三次。7.3.3.4加樣標準陰、陽性血清和被檢血清均用封閉液作100倍稀釋，每份被檢血清加2孔，每孔100μl，每塊板均設標準陰、陽性血清及稀釋液對照各2孔。加樣完畢后封板，放37℃孵育1h，洗滌三次。7.3.3.5加酶標抗體每孔加入用封閉液稀釋至工作濃度的酶標記抗體100μl，置37℃再孵育1h，洗滌三次。7.3.3.6加底物溶液加入顯色底物(TMB)溶液100μl/孔，置37℃避光反應15min。7.3.3.7終止反應加入終止液50μl/孔,混勻后即刻測量OD450值。7.3.4結果判定7.3.4.1P/N比法被檢樣品(P)的吸光度值和陰性標準樣品(N)值之比。2.0>P/N>1.50P/N>2.07.3.4.2目視比色法判為陰性判為可疑判為陽性被檢血清孔近于或淺于標準陰性血清孔者判為陰性；略深于標準陰性血清孔者判為可疑；明顯深于標準陰性血清孔者判為陽性。8綜合判定58.1經(jīng)6判定為疑似BPIV3感染病例，經(jīng)病毒分離培養(yǎng)和PCR方法檢測出BPIV3，可判為牛副流感3型病毒感染。8.2臨床無明顯特異癥狀的非免疫動物經(jīng)間接ELISA方法檢測出抗體陽性，可判為該動物曾感染或已感染牛副流感3型病毒，需結合其他方法進行綜合確診。6（資料性）A.1引物序列產(chǎn)物大小上游引物CATTGAATTCATACTCAGCAC400bp下游引物AGATTGTCGCATTT(AG)CCTCA.2引物溶解上下游引物用無菌的DEPC處理水配制成10μmol/L。（資料性）試劑的配制B.1抗原包被緩沖液（0.05mol/lpH9.6碳酸鹽緩沖液）碳酸鈉碳酸氫鈉去離子水0.318g0.588g200ml