DB12T 652-2016 轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆DAS-68416-4及其衍生品種定性檢測 實(shí)時熒光PCR法

67.050B

23

DB12天 津 市 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB12/T

652—2016轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆

DAS-68416-4

及其衍生品種定性檢測

PCR

法Detection

of

plants

and

—Qualitative

method

herbicide-resistant

soybean

and

derivates2016-09-27

發(fā)布 2016-11-01

實(shí)施天津市市場和質(zhì)量監(jiān)督管理委員會發(fā)布DB12/T

652—2016 本標(biāo)準(zhǔn)按照

GB/T

—

給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由天津市農(nóng)村工作委員會提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所、天津市東麗區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：蘭青闊、李亮、趙新、劉雪巖、宛煜嵩、王成、陳銳、朱珠、劉娜、徐石勇。本標(biāo)準(zhǔn)

年

9

月首次發(fā)布。DB12/T

652—2016

DAS-68416-4

PCR

1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆

DAS-68416-4

轉(zhuǎn)化體特異性的定性

PCR

檢測方法的術(shù)語和定義、檢測方法、結(jié)果分析與表述。本標(biāo)準(zhǔn)適用于轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆

DAS-68416-4

DAS-68416-4

轉(zhuǎn)化體成分的定性

PCR

檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T

6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法農(nóng)業(yè)部

1485

4—2010 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測

DNA

農(nóng)業(yè)部

2031

8—2013 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測

大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定性

PCR

法農(nóng)業(yè)部

2031

19—2013 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測

NY/T

轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測

通用要求3 術(shù)語和定義農(nóng)業(yè)部

2031

8—2013

界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1Lectin

Lectin

編碼大豆凝集素的基因。3.2DAS-68416-4

轉(zhuǎn)化體特異性序列

sequence

DAS-68416-4DAS-68416-4

外源插入片段

5′端與大豆基因組的連接區(qū)序列。4 原理根據(jù)轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆DAS-68416-4DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。依據(jù)是否擴(kuò)增獲得典型的實(shí)時熒光擴(kuò)增曲線，判斷樣品中是否含有

5 檢測方法5.1

試劑和材料除非另有說明，僅使用分析純試劑和重蒸餾水或符合

GB/T

6682

規(guī)定的一級水。5.1.1

熒光定量

PCR

反應(yīng)試劑盒。5.1.2 引物和探針。DB12/T

652—20165.1.2.1

基因。lec-1215F：5′′lec-1332R：5′′lec-1269P：5′′預(yù)期擴(kuò)增片段大小為

（參見附錄

A）。5.1.2.2

DAS-68416-4

轉(zhuǎn)化體特異性序列。DAS-68416-4-F：5'-

-

3'：

-

3'：5'

-

3'預(yù)期擴(kuò)增片段大小為

128

（參見附錄

A

10

μmol/L需避光保存。5.2 儀器

0.1

g

和

0.1

PCR

儀；其他相關(guān)儀器設(shè)備。5.3 分析步驟5.3.1 按

NY/T

672

和農(nóng)業(yè)部

2031

號公告—19—2013

規(guī)定執(zhí)行。5.3.2 試樣準(zhǔn)備按

NY/T

672

和農(nóng)業(yè)部

2031

號公告—19—2013

規(guī)定執(zhí)行。5.3.3 試樣預(yù)處理按農(nóng)業(yè)部

1485

號公告—4—2010

規(guī)定執(zhí)行。5.3.4 DNA

模板制備按農(nóng)業(yè)部

1485

號公告—4—2010

規(guī)定執(zhí)行。5.3.5 PCR

反應(yīng)5.3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品和試樣實(shí)時熒光

PCR

同時進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)樣品和試樣的

PCR

反應(yīng)，每個

PCR

反應(yīng)設(shè)置

3

次平行。DAS-68416-4

轉(zhuǎn)化體實(shí)時熒光

PCR

1

在

PCR

Lectin內(nèi)標(biāo)基因?qū)崟r熒光

PCR

反應(yīng)按表

2

在

PCR

反應(yīng)管中依次加入反應(yīng)試劑，混勻。將

PCR

管放在離心機(jī)上，500

g~3

g

離心

10

s

PCR

PCR

熒光

PCR

反應(yīng)。（反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃變性

5

；進(jìn)行

45

次循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)（94

15

s，60℃退火延伸

1

）；（60

1×10

DAS-68416-4-F0.8

2.0

10

DAS-68416-4-R0.8

2.0

10

DAS-68416-4-P0.4

.0

2.0

25.0

表示體積不確定。根據(jù)

25.0

1×10

lec-1215F0.2

0.5

10

lec-1332R0.2

0.5

10

lec-1269P0.2

0.5

.0

25.0

表示體積不確定。根據(jù)

25.0

DB12/T

652—2016表

1 DAS-68416-4表

1 DAS-68416-4

PCR

反應(yīng)體系表

2 Lectin

PCR

反應(yīng)體系在試樣

PCR

反應(yīng)的同時，應(yīng)設(shè)置陰性對照、陽性對照和空白對照。以非轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%~1.0%的基因組

DNA（或采用

與非轉(zhuǎn)基因大豆基因組相比的拷貝數(shù)分?jǐn)?shù)為

0.1%~1.0%的DNA

溶液）作為陽性對照；以水作為空白對照。各對照

PCR

反應(yīng)體系中，除模板外，其余組分及

PCR

反應(yīng)條件與

5.3.5.1

6 結(jié)果分析與表述6.1 Lectin內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因無典型擴(kuò)增曲線，表明樣品中未檢出大豆成分，結(jié)果表述為“樣品中未檢測出大豆成分，檢測結(jié)果為陰性”。6.2 LectinCt值≤38DAS-68416-4轉(zhuǎn)化體特異性序列出現(xiàn)典型Ct值≤因耐除草劑大豆轉(zhuǎn)化體成分，檢測結(jié)果為陽性”。DB12/T

652—20166.3 LectinCt值≤38DAS-68416-4轉(zhuǎn)化體特異性序列未出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，表明樣品中未檢測出DAS-68416-4轉(zhuǎn)化體成分，結(jié)果表述為“樣品中未檢測出轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆DAS-68416-4

轉(zhuǎn)化體成分，檢測結(jié)果為陰性”。6.4 Lectin

/或

轉(zhuǎn)化體特異性序列出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，但

Ct

值在

～之間，進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合

～

的情形，依照

6.1～6.3

進(jìn)行判斷。如重復(fù)實(shí)驗(yàn)檢

Ct

值仍在

38～

內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和/或轉(zhuǎn)化體特異性序列，根據(jù)檢出參數(shù)情況，參照

～

對樣品進(jìn)行判定。DB12/T

652—2016附錄A（資料性附錄）A.1 Lectin基因?qū)崟r熒光PCR擴(kuò)增產(chǎn)物核苷酸序列（Accession

No.K00821）1

CCACATTTGG

CCGGTAGCGT

TGCCAGCTTC61

GCCGCTTCCT

CTTCTATGCC

AAAGGCTTGC

AGATGGGC

A.2耐除草劑大豆DAS-68416-4轉(zhuǎn)化體特異性序列1 GGGCCTAACT