第14章-高效液相色譜法

第十四章高效液相色譜法

highperformanceliquidchromatography

HPLC2024/10/31第十四章高效液相色譜法第一節(jié)概述第二節(jié)基本原理第三節(jié)高效液相色譜法的主要類型第四節(jié)高效液相色譜儀第五節(jié)高效液相色譜法的應(yīng)用2024/10/32第一節(jié)概述高效液相色譜法（HPLC）－－以高壓液體為流動(dòng)相的液相柱色譜法。又稱為高壓液相色譜法；高速液相色譜法。一、高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法的比較二、高效液相色譜法與氣相色譜法的比較2024/10/33一、高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法的比較經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，引入氣相色譜法的理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)，高壓輸送流動(dòng)相，流速快，分析速度快；高效固定相，顆粒極細(xì)（一般為10μm以下）、規(guī)則均勻的固定相，(鍵合相)傳質(zhì)阻抗小，柱效高，分離效率高；高靈敏度檢測(cè)器，靈敏度大大提高。紫外檢測(cè)器最小檢測(cè)限可達(dá)10-9g，而熒光檢測(cè)器最小檢測(cè)限可達(dá)10-12g。2024/10/34二、高效液相色譜法與氣相色譜法的比較不受試樣的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，應(yīng)用范圍廣；可選用各種溶劑作為流動(dòng)相，對(duì)分離的選擇性有很大作用，選擇性高；一般在室溫條件下進(jìn)行分離，不需要高柱溫。特點(diǎn)：高壓、高效、高速、高靈敏度、適用范圍廣適用：高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析。2024/10/35第二節(jié)基本原理一、柱內(nèi)展寬二、柱外展寬2024/10/36高效液相色譜法對(duì)基本概念和理論如塔板理論、速率理論、保留值與分配系數(shù)的關(guān)系、分離度等與氣相色譜法基本一致，由于流動(dòng)相分別為液體和氣體，兩者的擴(kuò)散系數(shù)和粘度差別較大，因而在應(yīng)用色譜基本理論時(shí)，必須考慮本身的特點(diǎn)。其中最重要的是速率理論中，各種動(dòng)力學(xué)因素對(duì)高效液相色譜峰展寬帶影響與氣相色譜中有所不同。這種影響可分為柱內(nèi)因素和柱外因素二類2024/10/37一、柱內(nèi)展寬——是由色譜柱內(nèi)各種因素所引起的色譜峰擴(kuò)展，依據(jù)速率理論（即VanDeemter

方程）H=A+B/u+Cu來(lái)討論與GC同（略）（一）渦流擴(kuò)散項(xiàng)A（二）縱向擴(kuò)散項(xiàng)B/u（三）傳質(zhì)阻力項(xiàng)2024/10/38二、柱外展寬

柱外展寬—色譜柱外各種因素引起的峰展寬。柱外因素主要指低劣的進(jìn)樣技術(shù)和包括進(jìn)樣器連接管、接頭、檢測(cè)器在內(nèi)的管路體積（死體積）。死體積越大，對(duì)色譜峰展寬影響越大。為了減少柱外因素對(duì)峰寬的影響，必須盡量減小駐外死體積。如采用進(jìn)樣閥進(jìn)樣，使用“零死體積接頭”連接管路各部件，并盡可能使用內(nèi)腔體積小的檢測(cè)器。2024/10/39第三節(jié)高效液相色譜法的主要類型一、液-固吸附色譜法二、化學(xué)鍵合相色譜法三、流動(dòng)相的要求和洗脫方式2024/10/310第三節(jié)高效液相色譜法的主要類型分配色譜法(partitionhromatography)吸附色譜法(adsorptionchromatography)離子交換色譜法（IEC）空間排阻色譜法（SEC）化學(xué)鍵合相色譜法(bondedphasechromatography.BPC)膠束色譜法(micellarchromatography；MC)2024/10/311根據(jù)固定相和流動(dòng)相相對(duì)極性的大小正相液液分配色譜法(normal-phaseliquid-liquidpartitionnchromatography,NLLC)反相液液分配色譜法(reversed-phaseliquid-liquidpartitionchromatography,RLLC)2024/10/312一、液-固吸附色譜法

(一)液-固吸附色譜法的固定相常用的有硅膠、氧化鋁及高分子多孔微球(有機(jī)膠)，其次還有分子篩及聚酰胺等1.硅膠表孔硅膠、全多孔硅膠、堆積硅珠(1)全多孔硅膠優(yōu)點(diǎn)：表面積大，容量大缺點(diǎn)：孔徑深，傳質(zhì)阻力大無(wú)定形全多孔硅膠(YWG)：粒徑5～10um，理論塔板數(shù)每米2～5萬(wàn)，價(jià)格便宜、載樣量大，但滲透性差球形全多孔硅膠(YWG)：粒徑3～10um，理論塔板數(shù)每米8萬(wàn)，渦流擴(kuò)散項(xiàng)小，滲透性好。2024/10/313(2)堆積硅珠(YQG)

由二氧化硅溶膠加凝結(jié)劑聚合而成。粒徑3～5um，理論塔板數(shù)每米8萬(wàn)，傳質(zhì)阻力小，柱容量大，是一種好的高效填料2.高分子多孔微球(YSG)又稱有機(jī)膠，表面為芳烴官能團(tuán)，由苯乙烯與二乙烯苯交聯(lián)而成用于分離芳烴、雜環(huán)、甾體、生物堿、脂溶性維生素、酚、醛、醚等。柱效低，但選擇性好，峰形好。2024/10/314(二)液-固吸附色譜法的流動(dòng)相常用溶劑:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。流動(dòng)相的選擇應(yīng)重點(diǎn)考慮溶劑的極性溶劑的極性強(qiáng)弱可用Snyder提出的溶劑極性參數(shù)ε0來(lái)表示。ε0為溶劑分子在單位吸附劑表面的吸附自由能。ε0越大，說(shuō)明溶劑的極性越強(qiáng)，洗脫能力就越強(qiáng)。

2024/10/315類型分類流動(dòng)相按組成不同可分為單組分和多組分；按極性可分為極性、弱極性、非極性；按使用方式有固定組成淋洗和梯度淋洗。在液-固吸附色譜法中，常常采用二元或二元以上的混合溶劑系統(tǒng)這樣可以找到適合強(qiáng)度的溶劑系統(tǒng)，而且還可以保持溶劑的粘度以降低柱壓和提高柱效，還可以提高分離的選擇性

2024/10/316選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題：（1）盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。（2）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。2024/10/317二、化學(xué)鍵合相色譜法以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法，簡(jiǎn)稱鍵合相色譜法(bondedphasechromatography；BPC)化學(xué)鍵合相：采用化學(xué)反應(yīng)的方法將官能團(tuán)鍵合在載體表面所形成的固定相2024/10/318化學(xué)鍵合相色譜法優(yōu)點(diǎn)：耐溶劑沖洗，化學(xué)性能穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性好(70℃以下不致破壞)，使用壽命長(zhǎng)；可以通過(guò)改變鍵合官能團(tuán)的類型來(lái)改變分離的選擇性；傳質(zhì)速度快，柱效高；適于梯度洗脫。正相(normalphase，NP)鍵合相色譜法固定相極性比流動(dòng)相的極性要強(qiáng)，適合于分離中等極性和極性強(qiáng)的化合物反相(reversedphase，RP)鍵合相色譜法固定相的極性比流動(dòng)相極性弱，適用于分離非極性至中等極性的化合物2024/10/319(一)化學(xué)鍵合相色譜法的固定相鍵合相的種類:化學(xué)鍵合相按基團(tuán)與載體(硅膠)相結(jié)合的活性鍵類型，分為酯化型(Si-O-C)和硅烷化型(Si-O-Si-C)化學(xué)鍵合相按基團(tuán)的極性可將其分為非極性、中等極性和極性三類1.非極性鍵合相2.中等極性鍵合相3.極性鍵合相2024/10/3201。非極性鍵合相(反相色譜鍵合相)硅膠表面鍵合烴基硅烷，為非極性基團(tuán)，其烴基配基可以是不同鏈長(zhǎng)的正構(gòu)烷烴，如十八烷基硅烷(octadecylsilane,ODS或用C18表示)應(yīng)用最廣泛辛烷基硅烷(用C8來(lái)表示)又可以是帶有苯基的碳鏈非極性鍵合相型號(hào)（國(guó)產(chǎn)）：YWG-C18H37、YQG-C18H37、YWG-C6H5(一)化學(xué)鍵合相色譜法的固定相2024/10/3212.中等極性鍵合相常見(jiàn)的有醚基鍵合相。這種鍵合相可作為正相或反相色譜的固定相，視流動(dòng)相的極性而定。3.極性鍵合相如氨基或氰基等，分別將氨丙硅烷基[-Si(CH2)3NH2

]和氰乙硅烷基鍵合在硅膠表面制成。它們常作為正相色譜的固定相。該鍵合相表面基團(tuán)為極性較大的基團(tuán)，(一)化學(xué)鍵合相色譜法的固定相2024/10/322(二)化學(xué)鍵合相色譜法的流動(dòng)相在化學(xué)鍵合相色譜中，溶劑的洗脫能力(即溶劑的強(qiáng)度)直接與溶劑的極性有關(guān)。正相鍵合相色譜中，由于固定相是極性的，因此極性強(qiáng)的流動(dòng)相洗脫能力強(qiáng)；反相鍵合相色譜中，由于固定相是非極性的，因此，極性弱的流動(dòng)相洗脫能力強(qiáng)2024/10/323(三)固定相和流動(dòng)相的選擇

1.固定相的選擇分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物選擇極性鍵合相。其中氨基鍵合相是分離糖類最常用的固定相；氨基鍵合相對(duì)雙鍵異構(gòu)或含雙鍵數(shù)不等的環(huán)狀化合物的分離有較好的選擇性。分離非極性和極性較弱的化合物選擇非極性鍵合相，在反相離子抑制色譜和反相離子對(duì)色譜中也常用非極性鍵合相。十八烷基硅烷（ODS）是應(yīng)用最廣泛的非極性鍵合相，對(duì)于各類化合物都有很強(qiáng)的適應(yīng)能力.2024/10/3242.流動(dòng)相的選擇正相鍵合相色譜法采用在烷烴中加適量極性調(diào)節(jié)劑的方法反相鍵合相色譜法一般以極性最大的水為主體，加入一定量與水互溶的甲醇、乙腈和四氫呋喃等極性調(diào)節(jié)劑。水－甲醇是反相色譜最常用的流動(dòng)相混合溶劑（二元或多元流動(dòng)相）2024/10/325三、流動(dòng)相的要求和洗脫方式(一)流動(dòng)相的要求1.與固定相不互溶，也不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。2.對(duì)被分離的樣品有適宜的溶解性。3.溶劑的純度高4.溶劑應(yīng)與檢測(cè)器相匹配。如使用紫外檢測(cè)器，流動(dòng)相在檢測(cè)波長(zhǎng)下不能有吸收。5.粘度要小，有利于提高傳質(zhì)速度，提高柱效，降低柱壓。2024/10/326(二)洗脫方式1.恒定組成溶劑洗脫采用恒定組成及配比的溶劑系統(tǒng)洗脫。優(yōu)點(diǎn):操作簡(jiǎn)便、柱易再生缺點(diǎn):對(duì)于成分復(fù)雜的樣品往往難以獲得理想的分離結(jié)果2024/10/327(二)洗脫方式2.梯度洗脫(gradienelution)梯度洗脫又稱梯度淋洗或程序洗脫。它是指在一定分析周期內(nèi)，按一定程序不斷改變流動(dòng)相的組成配比或pH等，改變流動(dòng)相的極性優(yōu)點(diǎn)能縮短分離周期、提高分離效能、改善色譜峰形、增加檢測(cè)靈敏度。缺點(diǎn)有時(shí)會(huì)引起基線漂移及重復(fù)性差。2024/10/328第四節(jié)高效液相色譜儀2024/10/329高效液相色譜儀2024/10/330主要部件

processandmainassemblyofHPLC一、高壓輸液系統(tǒng)二、進(jìn)樣系統(tǒng)三、分離系統(tǒng)四、檢測(cè)系統(tǒng)五、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)2024/10/331輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)2024/10/332一、輸液系統(tǒng)高壓輸液泵壓力：150～350×105Pa恒流泵：在輸送流動(dòng)相過(guò)程中流量恒定。常用柱塞往復(fù)泵輸液泵應(yīng)具備的性能：無(wú)脈動(dòng)；流量恒定；流量范圍寬且可調(diào)節(jié)；耐高壓；耐腐蝕；適于梯度洗脫由玻璃、不銹鋼或氟塑料制成容量為1~2L流動(dòng)相要經(jīng)常更換溶劑貯存器2024/10/333過(guò)濾和脫氣流動(dòng)相和樣品溶液的過(guò)濾目的：以免其中的細(xì)小顆粒堵塞色譜柱以及影響高壓輸液泵的正常工作。流動(dòng)相進(jìn)入高壓泵前必須進(jìn)行脫氣處理目的：除去其中溶解的氣體(如氧氣)，防止流動(dòng)相由色譜柱進(jìn)入檢測(cè)器時(shí)因壓力降低而產(chǎn)生氣泡，增加基線的噪音，造成靈敏度降低，甚至無(wú)法分析。脫氣方法：常用的脫氣方法有低壓脫氣法、吹氦脫氣法和在線脫氣法。目前，許多高檔的高效液相色譜儀都配有在線脫氣裝置。2024/10/334梯度洗脫(gradientelution)定義——在分離過(guò)程中使兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的比例，目的——使流動(dòng)相的強(qiáng)度、極性、pH或離子強(qiáng)度相應(yīng)地變化，達(dá)到提高分離效果，縮短分析時(shí)間的目的。梯度洗脫裝置分類：一類是外梯度裝置（又稱低壓梯度；另一類是內(nèi)梯度裝置（又稱高壓梯度）2024/10/335二、進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣器優(yōu)點(diǎn)是裝置簡(jiǎn)單、價(jià)廉、死體積小缺點(diǎn)是隔膜的穿刺部分在高壓情況下容易漏液，而且進(jìn)樣量有限，重復(fù)性差，有時(shí)需停泵進(jìn)樣。2024/10/336進(jìn)樣閥（六通閥）優(yōu)點(diǎn)是進(jìn)樣時(shí)可保持系統(tǒng)的高壓，進(jìn)樣方便、易操作，而且由于進(jìn)樣量是由定量管的體積嚴(yán)格控制，進(jìn)樣準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，自動(dòng)化程度高，適于做定量分析。2024/10/337自動(dòng)進(jìn)樣裝置計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制進(jìn)樣閥，取樣、進(jìn)樣、復(fù)位、清洗和樣品盤的轉(zhuǎn)動(dòng)全部按預(yù)定的程序自動(dòng)進(jìn)行。優(yōu)點(diǎn)：自動(dòng)進(jìn)樣重現(xiàn)性好，適合大量樣品分析，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。目前比較典型的自動(dòng)進(jìn)樣裝置：圓盤式和鏈?zhǔn)絻煞N。2024/10/338

三、分離系統(tǒng)分析柱:柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑2～5mm，柱長(zhǎng)10～30cm。制備柱:柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑6～20mm，柱長(zhǎng)10～30cm。新型毛細(xì)管柱:柱體為石英管，內(nèi)徑0.2～0.5mm，2024/10/339四、檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)器的作用是將樣品組成和含量的變化轉(zhuǎn)變?yōu)榭晒z測(cè)的信號(hào)。檢測(cè)器的要求是：靈敏度高，重復(fù)性好、線性范圍寬、死體積小以及對(duì)溫度和流量的變化不敏感等。2024/10/340檢測(cè)器的類型專用型檢測(cè)器，又稱溶質(zhì)性質(zhì)檢測(cè)器，它僅對(duì)被分離組分的物理或物理化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)。有紫外、熒光、電化