醫(yī)學教材單細胞基因組測序在胰腺癌診治中的應(yīng)用研究-梁廷波

匯報人：梁廷波申報單位：浙江大學

單細胞基因組測序在胰腺癌診治中的應(yīng)用研究匯報內(nèi)容一、課題目標二、研究內(nèi)容與技術(shù)路線三、課題任務(wù)的支撐條件四、經(jīng)費預算匯報內(nèi)容一、課題目標二、研究內(nèi)容與技術(shù)路線三、課題任務(wù)的支撐條件四、經(jīng)費預算研究目標完善胰腺癌患者CTC和CSC單細胞捕獲平臺，優(yōu)化單細胞的DNA/RNA提取、擴增、和測序分析技術(shù)利用CTC單細胞測序?qū)ふ揖哂性缙谠\斷價值的生物標志物利用CSC和CTC單細胞測序?qū)ふ乙认侔桶l(fā)及轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，預測預后并實現(xiàn)有效干預腫瘤進展利用CTC單細胞測序?qū)煰熜нM行評估，尋找耐藥相關(guān)基因，探索個體化治療根據(jù)CTC單細胞測序結(jié)果，建立外周血檢測胰腺癌基因變異的循環(huán)腫瘤DNA（CirculatingtumorDNA,ctDNA）的方法匯報內(nèi)容一、課題目標二、研究內(nèi)容與技術(shù)路線三、課題任務(wù)的支撐條件四、經(jīng)費預算研究內(nèi)容（1）單細胞操縱平臺的建立CTC、CSC捕獲、分離及技術(shù)優(yōu)化單細胞DNA/RNA微量擴增、測序技術(shù)優(yōu)化單細胞克隆演化信息分析ctDNA的檢測技術(shù)開發(fā)研究內(nèi)容（2）早期診斷復發(fā)轉(zhuǎn)移藥物治療挖掘早期診斷新的生物標記物發(fā)現(xiàn)復發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因研究化療耐藥機制尋找藥物治療靶點單細胞操縱平臺胰腺癌個體化綜合診治技術(shù)路線（1）單細胞分離捕獲DNA/RNA提取、MDA方法微量擴增文庫構(gòu)建DNA測序/RNA測序數(shù)據(jù)整合分析單細胞測序變異ctDNA檢測原發(fā)/轉(zhuǎn)移瘤組織外周血LCM/液態(tài)挑取(CSC-CD133與CD44+cMet)CellSearch微流控芯片SET-iFISHLCM/液態(tài)挑取技術(shù)路線（2）外周血CTC正常人10例胰腺癌10例挖掘早期診斷新的生物標記物癌前病變10例潛在的分子標記物LiquidBiopsy正常人/癌前病變/胰腺癌各50例臨床驗證技術(shù)路線（3）發(fā)現(xiàn)復發(fā)相關(guān)基因

胰腺癌根治性切除術(shù)20例術(shù)中門脈血/外周血各10mLCTC

術(shù)后每三月隨訪一次獲取外周血CTC無復發(fā)局部復發(fā)遠處復發(fā)

三年外周血CTC復發(fā)腫瘤組織原發(fā)瘤組織CSC技術(shù)路線（4）發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因局部晚期胰腺癌10例轉(zhuǎn)移胰腺癌10例可切除胰腺癌10例原發(fā)瘤CSC原發(fā)瘤CSC轉(zhuǎn)移瘤vs.vs.單細胞克隆演化信息分析技術(shù)路線（5）不可切除胰腺癌20例可切除胰腺癌20例輔助化療DFS評價一線化療PFS、OS評價50例患者進行驗證50例患者進行驗證研究化療耐藥機制尋找藥物治療靶點胰腺癌CTC鑒定捕獲技術(shù)總結(jié)前期研究基于表面標記物（EpCAM）的分離方法：-Cellsearch（在胰腺癌CTC捕獲中效率低，可能由于EpCAM等上皮標記物在CTC中多表達缺失）基于細胞大小差異的分離方法：-ISET(Isolationbysizeofepithelialtumorcells)，問題在于獲取的膜上的細胞不易被分離下來陰性富集（去除RBC、WBC）+免疫熒光染色-Inertialfocusingdevice,SET-iFISHCD45DAPIPan-CKFISH-CEP8SET-iFISH鑒定胰腺癌CTC:DAPI+CD45-CK+/-FISH+上皮標記物（CK、EpCAM等）常缺失前期研究鑒定獲得的胰腺癌CTC最終經(jīng)LCM或液態(tài)口吸法挑取最終得到單細胞微流控注射泵后期被黏附細胞的收集二維芯片（CTCs富集）前期研究基于電活性薄膜的CTC捕獲芯片微電壓響應(yīng)的界面材料和EpCAM抗體黏附分子的二維CTCs細胞捕獲芯片BenWang;ACSAppliedMaterials&Interface;underrevision.胰腺癌CTC1.25V具體任務(wù)指標發(fā)現(xiàn)2-3個與胰腺癌轉(zhuǎn)移、復發(fā)密切相關(guān)的基因；發(fā)現(xiàn)1-2個具有高度敏感性和特異性的基因水平診斷標記物；發(fā)現(xiàn)2-3個預后判斷和化療耐藥的標記物；撰寫高質(zhì)量SCI學術(shù)論文5～8篇，其中相關(guān)權(quán)威期刊3～5篇，影響因子大于10分以上1～2篇。參加國際會議交流、發(fā)言2～3次；申請國內(nèi)外技術(shù)發(fā)明專利2～3項；爭取獲得全國百篇優(yōu)秀博士畢業(yè)論文1篇；培養(yǎng)碩士研究生2～3名，博士研究生1～2名；匯報內(nèi)容一、課題目標二、研究內(nèi)容與技術(shù)路線三、課題任務(wù)的支撐條件四、經(jīng)費預算研發(fā)團隊胰腺癌治療歷史悠久，全國首例胰腺癌根治性切除手術(shù)；國家科技進步二等獎；

現(xiàn)為浙江省“胰腺癌綜合診治創(chuàng)新團隊”；每年診治胰腺癌500余例，手術(shù)技術(shù)達國際先進水平；

與國外最著名的幾大胰腺癌中心建立了廣泛的合作；

擁有完善的胰腺癌生物樣本庫。浙江大學附屬第二醫(yī)院—牽頭單位

復旦大學中山醫(yī)院、北京大學一院均為國內(nèi)大規(guī)模胰腺癌診治中心之一；

每年診治胰腺癌患者合計1000例以上，根治性切除500例以上；合作單位負責人楊尹默、樓文暉教授均為國內(nèi)胰腺外科著名專家；

深圳大學附屬一院在腫瘤單細胞捕獲技術(shù)以及基因測序上經(jīng)驗豐富；

華大科技在基因高通量測序技術(shù)上國際領(lǐng)先；

約翰霍普金斯醫(yī)院在胰腺癌診治上世界第一，在ctDNA方面全球領(lǐng)先。研發(fā)團隊合作單位工作基礎(chǔ)

在臨床方面，引領(lǐng)胰腺癌的綜合治療；

在基礎(chǔ)研究方面，在腫瘤的微環(huán)境、新生血管形成、免疫逃逸、耐藥機制、信號通路等取得了較多研究成果；

完成了相關(guān)多項國家自然科學基金項目；Oncogene,2014,onlineMolCancerTher,2014,13,2062.Gastroenterology,2013,144,1230.AnnSurgOncol,2013,20,S725.AmJHumGenet,2013,93,249.Carcinogenesis,

2013,34,962.ClinCancerRes,2012,18,6339.Pancreatology,2012,12,183.AnnSurg,2012,255,326.SciTranslMed,2011,3,92ra66.AJG,2011,106,1521.CACancerJClin,2013,63,318.(影響因子153.459)CancerRes,2012,72,1363.(影響因子8.650)工作基礎(chǔ)

華大基因研究院在單細胞測序技術(shù)處于國際領(lǐng)先水平Cell,2012,148,873.Cell,2012,148,886.約翰霍普金斯醫(yī)院具備國際上獨一無二的ctDNA研究實力NatMed,2008,14,985.SciTranslMed,2014,19,224ra24.梁廷波，教授，主任醫(yī)師，博導

教育部長江學者特聘教授

國家杰出青年基金獲得者衛(wèi)生部有突出貢獻中青年專家美國外科醫(yī)師學會會員（FACS），國際肝膽胰協(xié)會會員

中華外科學分會胰腺學組委員，中國抗癌協(xié)會胰腺癌專業(yè)委員會委員

浙江省胰腺癌綜合診治創(chuàng)新團隊負責人

浙江大學附屬第二醫(yī)院肝膽胰外科主任曾獲國家科技進步二等獎1項、省部級科技進步一等獎4項以第一/通訊作者發(fā)表SCI論文40余篇項目負責人匯報內(nèi)容一、課題目標二、研究內(nèi)容與技術(shù)路線三、課題任務(wù)的支撐條件四、經(jīng)費預算經(jīng)費預算序號預算科目名稱專項經(jīng)費(萬元)（一）直接費用4711設(shè)備費02材料費116.003測試化驗加工費259.54燃料動力費05差旅費11.006會議費11.007國際合作與交流費21.008出版/文獻/信息傳播/知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)費8.009勞務(wù)費44.5.0010專家咨詢費0（二）間接費用29.00合計500.00任務(wù)分工及經(jīng)費分配浙醫(yī)二院350萬復旦中山醫(yī)院50萬北大一院50萬華大科技10萬協(xié)調(diào)課題整體實施；構(gòu)建單細胞捕獲平臺，提供80例胰腺癌樣本，與華大科技合作完成單細胞測序和分析，以及ctDNA檢測和分析20例胰腺癌樣本獲取、保存，基于CTC的胰腺癌早期診斷研究優(yōu)化CTC、CSC單細胞捕獲平臺深大一院40萬20例胰腺癌樣本獲取、保存，基于CTC的胰腺癌耐藥相關(guān)基因研究單細DNA/RNA測序及數(shù)據(jù)分析前期預實驗課題年度計劃2015年利用Cellsearch與SET-iFISH捕獲胰腺癌CTC并進行比較；建立并優(yōu)化液態(tài)挑取和LCM進行單細胞捕獲；優(yōu)化微流控芯片系統(tǒng)分離單細胞技術(shù)；分離CSC單細胞；DNA/RNA微量擴增，鑒定單細胞分離效果。 2016年對CTC、CSC單細胞進行基因組、轉(zhuǎn)錄組測序，優(yōu)化生物信息學分析；基于此尋找胰腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因、尋找具有早期診斷價