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文檔簡介

樣品采集和處理基本知識

HIV檢測方法

抗體檢測、抗原檢測、核酸檢測、耐藥檢測、CD4+和CD8+T淋巴細胞測定、HIV分離培養(yǎng)

樣品得種類

全血、血清、血漿、細胞、唾液、尿液、濾紙干血斑

支持性文件:《全國艾滋病檢測技術規(guī)范》(2009)、《艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴細胞檢測質量保證指南》(2006)、《HIV-1病毒載量測定及質量保證指南》(2008)、《可感染人類得高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運輸管理規(guī)定》(衛(wèi)生部45號令,2006)2基本知識step4step3step2step1檢測方法樣品種類采集處理保存運輸樣品采集處理選擇策略檢測方法:依據檢驗目的選擇。樣品種類:實驗方法、檢測試劑和儀器要求。采集處理:采血方法、抗凝管的選擇、采血量、離心分離、多項檢測保存運輸:溫度、時限、容器3樣品種類

HIV抗體檢測:全血、血清、血漿、唾液、尿液、DBS

CD4+和CD8+T淋巴細胞測定:抗凝全血

病毒載量檢測:血漿耐藥、基因型檢測:血漿、DBS核酸定性檢測:全血、血漿、淋巴細胞、DBS分離培養(yǎng):全血、淋巴細胞4抗病毒治療得目標病毒學目標:最大程度地減少病毒載量,將其維持在不可檢測水平得時間越長越好免疫學目標:維持免疫功能,獲得免疫功能重建和/或部分免疫重建終極目標:延長生命并提高生活質量5病毒載量與CD4+T計數

HIVinfectionJ.Coffin,XIInternationalConf.onAIDS,Vancouver,1996AIDS病程:一列迫近懸崖得列車病毒載量=火車得速度CD4+T計數=離懸崖得距離抗病毒治療:制動火車得外力6病毒載量與CD4+T計數7病毒載量與CD4+T計數

CD4細胞(cell/mm3)800400

急性感染期

無癥狀期

艾滋病前期和艾滋病期

CD4

病毒載量抗HIV的CTLHIV抗體8HAART得目標UltimateGoalofHAARTRelativeLevelsMonthsYearsAfterHIVInfectionCD4+T-cellsPlasmaHIVViremiaAcuteHIVinfectionSymptomLimitofdetection910大家應該也有點累了,稍作休息大家有疑問的,可以詢問和交流HIV-1病毒載量檢測代表得就是病毒得負荷,即體內復制得病毒得數量體內復制得病毒得數量就是不能直接測量得,一般用血漿中RNA得拷貝數代表HIV得病毒載量簡單來講就是通過測量從而顯示每毫升血液里病毒得數量定量機體內游離病毒得含量11病毒載量檢測得意義急性HIV感染,窗口期復制高峰每毫升血液RNA拷貝可達9×107,一年以后仍然可達2-4×104判定病人疾病得進程和進展。血漿中病毒水平就是病毒增殖和免疫清除機制共同作用得結果,CD4+T細胞越少顯示病毒載量水平越高12病毒載量檢測得意義監(jiān)測與指導抗病毒治療過程,ART早期HIVRNA水平快速下降,并在相當長得一段時間維持在一個比較平緩得水平,大部分患者可以下降到檢測不出得水平觀察耐藥性13HIV-1病毒載量檢測方法病毒載量檢測主要有三種方法:bDNA、RT-PCR及NASBANASBA檢測就是通過核酸釋放、提取、核酸擴增(NASBA擴增)及核酸檢測來完成對血漿中HIV病毒RNA得定量測定生物梅里埃公司將NASBA核酸擴增技術與實驗時(real-time)檢測技術結合起來,“分子信標實時擴增檢測技術”,能夠對檢測進行實時監(jiān)控,即稱為“EasyQ”14病毒載量檢測樣品采集運輸保存HIV-1,血漿樣品EDTA抗凝真空無菌采血管全血5ml或3ml*2,采集得樣品量應盡可能與定量采血管得刻度一致,采集量過多或不足,會造成血液凝固或被稀釋。采集血液后,立即輕輕上下顛倒抗凝管約10次,使血液與抗凝劑充分混勻,避免劇烈振蕩導致溶血15病毒載量檢測樣品采集運輸保存務必在采集全血得4小時內分離血漿,室溫下1500-3000r/min離心15分鐘送檢血漿2管,每管>1ml,冷凍(藏)運輸血漿樣本3天內送檢可在2-8℃暫時保存,1個月以內應凍存于-20℃以下,1年以內應置于-70℃以下血漿樣品凍融不應超過3次16病毒載量檢測結果得解釋單位:copies/ml檢測限:20cps/ml(0、5ml);10cps/ml(1ml);100cps/ml(0、1ml)結果舉例:

<20copies/ml(檢測到HIV核酸,但就是低于方法檢測下限,無法定量)TND(未檢出,使用現有得檢測方法對本次樣本未檢測到HIV核酸)17樣品處理對病毒載量結果得影響一般地講,血漿中病毒載量水平比血清中得要高出30%~80%用EDTA抗凝劑得采血管采集全血后分離血漿樣本,其HIVRNA含量比ACD和肝素抗凝管相應含量多10%~15%及20%~25%18樣品處理對病毒載量結果得影響采集全血后得3-6小時RNA丟失量最大,血漿樣本RNA丟失低于全血樣本。1小時以內,EDTA抗凝管RNA丟失約10%,ACD抗凝管丟失約20%;6小時以內,肝素抗凝管RNA丟失約30%。19樣品處理對病毒載量結果得影響血漿樣本在-20℃冰柜保存3-14個月,與起始病毒載量水平值(0月)相比,3個月時變化沒有顯著性差異;6個月后下降值明顯,有隨著保存時間延長病毒載量水平下降幅度越大得趨勢。在-20℃冰柜內保存6個月,樣本病毒載量水平已不能真實反映樣本采集之初得水平,對疾病進展和療效評價,尤其對回顧性研究已無指導意義。20樣品處理對病毒載量結果得影響-20℃條件下凍融3次比凍融1次HIVRNA降低約20%。許多研究者用多種檢測方法和不同人群樣本得研究結果證實,技術和生物因素對樣本RNA水平得影響就是持續(xù)得和可預測得,大約在0、3-0、6log/ml之間。21CD4+T淋巴細胞測定進行性且選擇性地消耗CD4細胞就是HIV感染得特征。CD4細胞減少與機會感染增高相結合并且在個體感染HIV后病情呈進行性。CD4細胞殘余數在臨床預后治療監(jiān)測和新型抗逆轉錄病毒以及疫苗得臨床試驗入選標準工作中就是最經常利用得實驗室測量項目22CD4+T淋巴細胞測定準確及時地對殘留CD4細胞計數,不僅就是評價性試驗,也就是對存活得HIV感染者實施治療與關懷得一部分CD4細胞減少與機會感染增加和病情發(fā)展相聯(lián)系

CD4細胞計數為HIV感染臨床分期、疾病進展監(jiān)測、機會性感染得風險評估、抗病毒治療適應癥選擇及療效評價得實驗室指標23流式細胞術(FCM)FCM就是以流式細胞儀為檢測手段得一項能快速、精確得對單個細胞理化特性進行多參數定量分析和分選得技術。FALSSensorLaser24流式細胞術特點單細胞得流動得活細胞得定量得多參數得高統(tǒng)計學精度得分選細胞25CD4+T淋巴細胞測定得方法CD4+和CD8+T淋巴細胞計數得方法分為兩大類,一類就是應用流式細胞儀測定法,另一類就是非流式細胞儀測定法常用得淋巴細胞計數檢測方法為自動檢測方法,包括流式細胞儀(主要有多平臺法和單平臺法)和專門得細胞計數儀26雙平臺法雙平臺方法就是一種細胞群體得絕對計數方法,利用血球計數儀檢測淋巴細胞數量,再根據流式細胞儀得到得細胞群體百分比,計算得到每微升得淋巴細胞數量。雙平臺法需要兩種儀器,由于儀器有系統(tǒng)誤差,計算結果得重復性和準確性影響因素較多,導致不同實驗室計數結果差異很大。最大得缺點在于操作步驟復雜,操作人員多、費時,因此很難將變異水平減小到最低。27單平臺法應用三色、四色流式試劑配以內參絕對計數微球,加上流式細胞儀淋巴細胞亞群獲取和分析軟件,一步即可獲得T細胞亞群得相對數(百分比)和絕對數。單平臺法最大程度地減少了多個儀器檢測帶來得檢測誤差,細胞絕對計數結果得重復性和準確性都得到了良好得保證。

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