分子生物學(xué)診斷技術(shù)概述

分子生物學(xué)診斷技術(shù)概述（中國器審2024年07月18日）檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)是醫(yī)學(xué)的重要組成部分，為臨床對(duì)疾病預(yù)防、診斷、治療和預(yù)后判斷等提供重要信息。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)和醫(yī)療設(shè)備的不斷發(fā)展，分子診斷學(xué)技術(shù)在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用越來越廣泛。分子診斷學(xué)是利用分子生物學(xué)理論、技術(shù)和方法來研究人體內(nèi)源性或外源性生物大分子及其體系的存在與否及其結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控的變化，為疾病的預(yù)防、預(yù)測(cè)、診斷、治療和轉(zhuǎn)歸提供信息和決策依據(jù)，從而為個(gè)體化醫(yī)療提供數(shù)據(jù)支持。經(jīng)過多年的發(fā)展，分子診斷學(xué)技術(shù)主要分為分子雜交技術(shù)、PCR技術(shù)、以及基因測(cè)序技術(shù)等。由于分子診斷學(xué)技術(shù)在疾病診斷方面有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，其在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中具有重要地位。一、基于核酸分子雜交技術(shù)的檢測(cè)技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)是指不同來源的2條核酸單鏈，在一定條件下，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則形成雙鏈的技術(shù)，主要包括熒光原位雜交技術(shù)(fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)、菌落原位雜交技術(shù)、Northern印跡法、斑點(diǎn)雜交技術(shù)、芯片雜交技術(shù)、Southern印跡法等。其中，F(xiàn)ISH技術(shù)指在人體的染色體?組織或者細(xì)胞上，將熒光素標(biāo)記的探針按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，使得靶基因得以顯示。FISH技術(shù)自問世以來，被迅速應(yīng)用于檢測(cè)各種類型的細(xì)胞遺傳學(xué)的改變，包括染色體拷貝數(shù)異常、復(fù)制、擴(kuò)增、缺失、倒位和易位等。同時(shí)，它也是臨床疾病診斷的重要手段，如腫瘤檢測(cè)、對(duì)染色體非整倍性異常引起的不孕不育檢測(cè)等。美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)會(huì)于1993年發(fā)布了應(yīng)用FISH進(jìn)行產(chǎn)前診斷的相關(guān)說明，F(xiàn)ISH技術(shù)在我國也應(yīng)用于臨床多年，主要應(yīng)用于癌癥輔助診斷、產(chǎn)前診斷等領(lǐng)域等。FISH技術(shù)在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域作為核型分析技術(shù)的補(bǔ)充已成為專家共識(shí)?，F(xiàn)批準(zhǔn)上市產(chǎn)品有HER-2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒、ALK基因重排檢測(cè)試劑盒、PML/RARα融合基因檢測(cè)試劑盒、13/16/18/21/22/X/Y染色體數(shù)目檢測(cè)試劑盒等?；蛐酒抢迷缓铣苫蛘唢@微點(diǎn)樣技術(shù)，將很多DNA探針按照順序固定在支持物的表面，然后與進(jìn)行標(biāo)記的樣本進(jìn)行雜交，并且將雜交后獲取的信號(hào)進(jìn)行分析，從而能夠獲得樣品的基因排列順序和基因表達(dá)等信息。根據(jù)不同的基因芯片制作方法，基因芯片可以被分為兩大類，一類是原位合成的芯片，另一類是DNA微陣列。根據(jù)基因芯片上探針的種類的不同，基因芯片還可以稱作是寡核苷酸芯片?cDNA芯片?DNA芯片等。具有高密度特性的寡核苷酸芯片，主要采用的方法就是原位合成，具有低密度特性的芯片采用的是點(diǎn)樣方法，而cDNA芯片和DNA芯片只能采用點(diǎn)樣的方法制成。由于基因芯片技術(shù)具有自動(dòng)化程度高?操作簡單?通量高等特點(diǎn)，在基因分型?基因表達(dá)?單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)等方面均有廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)批準(zhǔn)上市產(chǎn)品有葡萄糖6磷酸脫氫酶基因突變檢測(cè)試劑盒(基因芯片法)、人乳頭瘤病毒分型檢測(cè)試劑盒（基因芯片法）、人乳頭瘤病毒（20個(gè)型）基因分型檢測(cè)試劑盒（PCR-電化學(xué)基因芯片法）、電化學(xué)基因芯片檢測(cè)儀等。二、基于PCR技術(shù)的檢測(cè)技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR)，是以DNA半保留復(fù)制機(jī)制為基礎(chǔ)，發(fā)展出的體外酶促合成、擴(kuò)增特定核酸片段的一種方法，包括變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟。PCR技術(shù)由于具有速度快?操作方便?靈敏度高?標(biāo)本要求低以及特異性高等特點(diǎn)，在食品檢驗(yàn)?醫(yī)學(xué)?農(nóng)學(xué)等領(lǐng)域均得到廣泛應(yīng)用。隨著技術(shù)的發(fā)展，除常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)外，PCR技術(shù)已經(jīng)衍生出很多不同的細(xì)分技術(shù)，例如實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timequantitativepolymerasechainreaction，qPCR)、逆轉(zhuǎn)錄PCR（ReversetranscriptionPCR（RT-PCR）、逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-timequantitativeRT-PCR，real-timeRT-PCR（或RT-qPCR））、數(shù)字PCR(digitalPCR，dPCR)、多重PCR（MultiplexPolymeraseChainReaction，mPCR）也稱復(fù)合PCR、反向PCR（Inverse-PCR）等；恒溫?cái)U(kuò)增的技術(shù)還可以細(xì)分很多如LAMP、RPA、RCA、CPA、SDA和HDA。按照PCR技術(shù)的演進(jìn)，人們習(xí)慣性的將PCR技術(shù)劃分為三代：普通PCR技術(shù)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（qPCR）和數(shù)字PCR技術(shù)（dPCR）。普通PCR技術(shù)是經(jīng)典方法，國際和國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)齊全；儀器試劑成本較低，用于定性分析；qPCR技術(shù)具有方法成熟，配套儀器試劑齊全，試劑成本中等，操作簡單，檢測(cè)敏感性高，特異性高，可實(shí)現(xiàn)半定量檢測(cè)；dPCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，具有更高的敏感性和特異性，可以檢測(cè)低拷貝樣品，但dPCR技術(shù)所用到的儀器設(shè)備和試劑昂貴，操作復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間長。目前三代的PCR技術(shù)各有各的優(yōu)缺點(diǎn)，也各有各的應(yīng)用領(lǐng)域，并不是一代取代一代的關(guān)系。技術(shù)的不斷進(jìn)步給PCR技術(shù)注入了新的活力，使其能解鎖一個(gè)又一個(gè)的應(yīng)用方向，使核酸檢測(cè)更方便、更準(zhǔn)確。PCR技術(shù)在臨床檢測(cè)中主要用于癌基因的檢測(cè)和診斷及用藥指導(dǎo)、致病病原體的檢測(cè)、遺傳病的產(chǎn)前診斷等方面。PCR技術(shù)在臨床檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用，技術(shù)擴(kuò)展性強(qiáng)?，F(xiàn)批準(zhǔn)上市產(chǎn)品有人乳頭瘤病毒(HPV)核酸檢測(cè)及基因分型試劑盒（PCR毛細(xì)電泳片段分析法）、人SHOX2、RASSF1A基因甲基化DNA檢測(cè)試劑盒(PCR熒光法)、α-地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒（Gap-PCR法）、耳聾易感基因檢測(cè)試劑盒（PCR+導(dǎo)流雜交法）、KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒(TaqMan熔解曲線熒光PCR法)、人Y染色體AZF區(qū)微缺失核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）、淋球菌/沙眼衣原體/解脲脲原體檢測(cè)試劑盒（PCR+膜雜交法）、淋球菌/沙眼衣原體/解脲脲原體檢測(cè)試劑盒（PCR+膜雜交法）、MTHFRC677T基因檢測(cè)試劑盒（PCR-金磁微粒層析法）、人類EGFR突變基因檢測(cè)試劑盒（多重?zé)晒釶CR法）、BMPR1A/PLAC8基因甲基化檢測(cè)試劑盒（數(shù)字PCR法）等。三、基于基因測(cè)序技術(shù)的檢測(cè)技術(shù)基因測(cè)序就是通過各種測(cè)序技術(shù)把基因的序列測(cè)出來，進(jìn)而通過生物信息學(xué)分析對(duì)這些不同的序列進(jìn)行解讀，1977年由Sanger發(fā)明的DNA雙脫氧鏈末端終止測(cè)序法，也被稱作“Sanger法”，這就是第一代基因測(cè)序技術(shù)，早在2001年完成的人類基因組框圖，采用的就是該方法。該技術(shù)直到現(xiàn)在依然被廣泛使用，但是其一次只能獲得一條長度在700～1000個(gè)堿基的序列，無法滿足現(xiàn)代科學(xué)發(fā)展對(duì)生物基因序列獲取的迫切需求。經(jīng)過不斷的技術(shù)開發(fā)和改進(jìn)，以Roche公司的454技術(shù)、illumina公司的Solexa和Hiseq技術(shù)及ABI公司的Solid技術(shù)為標(biāo)記的第二代測(cè)序技術(shù)誕生了。第二代測(cè)序技術(shù)也稱高通量測(cè)序(high-throughputsequencing，HTS)技術(shù)，也被稱為新一代測(cè)序(NextGenerationSequencing,NGS)，是臨床檢測(cè)的主力軍，相對(duì)于一代測(cè)序，它可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模平行測(cè)序，其具備檢測(cè)用時(shí)短?靈敏度高?通量高?經(jīng)濟(jì)等諸多優(yōu)勢(shì)，極大地推動(dòng)了分子診斷在臨床檢測(cè)方面的應(yīng)用，也推進(jìn)了基因組學(xué)的發(fā)展。第三代測(cè)序技術(shù)主要是以單分子測(cè)序及納米孔測(cè)序?yàn)榇?，如牛津大學(xué)的納米測(cè)序技術(shù)(OxfordNanopore'snanoporesequencing)，PacificBiosciences公司的單分子實(shí)時(shí)技術(shù)(Singlemoleculerealtime,SMRT)等。與前兩代相比，第三代測(cè)序技術(shù)的最大特點(diǎn)就是單分子測(cè)序，測(cè)序過程無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增。目前，臨床用第二代測(cè)序技術(shù)（NGS）已經(jīng)商業(yè)化，并逐漸走向成熟，國內(nèi)外許多公司正積極開發(fā)和商業(yè)化更多臨床實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用產(chǎn)品。NGS在臨床應(yīng)用中的儀器設(shè)備復(fù)雜，檢測(cè)試劑需要根據(jù)不同檢測(cè)方法配制，操作技術(shù)難度較大，對(duì)操作人員技術(shù)能力要求高，對(duì)結(jié)果解釋的臨床水平要求也非常高。第三代測(cè)序較第二代測(cè)序?qū)⒆x長提升了萬倍，需克服錯(cuò)誤率、成本及樣本要求較高以及算法、軟件、數(shù)據(jù)庫等配套的技術(shù)問題。第一代基因測(cè)序技術(shù)因成本高?通量低而限制了其在臨床方面的應(yīng)用，但由于它的準(zhǔn)確率極高，因而被認(rèn)為是基因測(cè)序的“金標(biāo)準(zhǔn)”。未來基因測(cè)序技術(shù)發(fā)展方向：更快的序列獲取速度；更準(zhǔn)確的堿基識(shí)別方式；更長的單條測(cè)序序列長度；更輕便的測(cè)序儀器平臺(tái)；更簡便的操作過程；更便宜的測(cè)序價(jià)格?；驕y(cè)序技術(shù)是先對(duì)基因采取片段化的方式，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建基因文庫，然后將基因文庫和載體相交聯(lián)，與此同時(shí)使其擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)在載體上合成的同時(shí)，能夠?qū)?shù)量龐大的數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)序。基因測(cè)序技術(shù)近年來發(fā)展很快，應(yīng)用日益廣泛，在臨床上主要應(yīng)用于尋找疾病的候選基因，可用于單基因病、復(fù)雜疾?。ㄈ缣悄虿　⒎逝职Y等）甚至癌癥致病基因或易感基因的尋找。同時(shí)，極大地促進(jìn)了胎兒游離DNA的實(shí)驗(yàn)室研究和無創(chuàng)性產(chǎn)前基因診斷的發(fā)展?，F(xiàn)批準(zhǔn)上市的產(chǎn)品有：人類9基因突變聯(lián)合檢測(cè)試劑盒（可逆末端終止測(cè)序法）、呼吸道病原體核酸檢測(cè)試劑盒（可逆末端終止測(cè)序法）、染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒（聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法）、基因測(cè)序儀等。四、基于核酸質(zhì)譜技術(shù)的檢測(cè)技術(shù)20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)打破了以往質(zhì)譜僅可進(jìn)行小分子物質(zhì)分析的傳統(tǒng)，使得核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子也可應(yīng)用質(zhì)譜進(jìn)行研究，極大推進(jìn)了基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，并且給生物領(lǐng)域及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來了革命性的突破。核酸質(zhì)譜，顧名思義是一種能檢測(cè)核酸的質(zhì)譜技術(shù)，它是基于MALDI-TOFMS質(zhì)譜發(fā)展起來的一種多重PCR分析檢測(cè)系統(tǒng)。質(zhì)譜儀的核心構(gòu)成部分主要包括進(jìn)樣系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器與檢測(cè)器。質(zhì)譜儀器平臺(tái)雖然種類眾多，但可以通過樣品進(jìn)樣方式、離子源、質(zhì)量分析器等方面進(jìn)行簡易分類。質(zhì)譜技術(shù)的基本原理是通過樣品離子化，產(chǎn)生不同質(zhì)荷比的離子，然后再經(jīng)過質(zhì)量分析器測(cè)定該樣品中不同種類離子的分子量，并按照從小到大的順序依次排列從而得到一幅質(zhì)量圖譜。由于核酸為極性、非易失性和熱不穩(wěn)定的生物大分子，且基于通量要求和樣品制備的難度，目前核酸質(zhì)譜主要使用的質(zhì)譜技術(shù)為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix-AssistedLaserDesorption/IonzationTimeofFlightMassSpectrometry，MALDI-TOF-MS），其中MALDI為基質(zhì)輔助激光解吸電離（matrix-assistedlaserdesorptionionization）的縮寫，是一種軟電離方式的離子源，給樣品能量較小，容易獲得能指明相對(duì)分子質(zhì)量的準(zhǔn)分子離子，基本不產(chǎn)生碎片峰；TOF-MS為飛行時(shí)間分析器（timeofflightanalyzer,TOFanalyzer）其作用為將離子源產(chǎn)生的離子按m/z順序分開并排列成譜。核酸質(zhì)譜技術(shù)具有精準(zhǔn)度高、特異性高、靈敏度高等特點(diǎn)，成本經(jīng)濟(jì)且高通量，可實(shí)現(xiàn)一次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)，既具有PCR技術(shù)的高敏感性、模板濃度要求低特點(diǎn)，又具備高分辨率和陣列技術(shù)的高通量等特點(diǎn)，且直接利用質(zhì)譜峰值定性定量測(cè)定，無需化學(xué)發(fā)光、熒光法或其他任何二級(jí)標(biāo)記方法，符合臨床應(yīng)用上的通量和靈敏度的需求。核酸質(zhì)譜適合于復(fù)雜的、多靶標(biāo)疾病的分子診斷，可應(yīng)用于藥物基因組學(xué)、病原體檢測(cè)等領(lǐng)域。核酸質(zhì)譜的主要特點(diǎn)是：PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，加入SNP序列特異延伸引物，在SNP位點(diǎn)上，延伸1個(gè)堿基。然后將制備的樣品分析物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶，將該晶體放入質(zhì)譜儀的真空管，而后用瞬時(shí)納秒(10-9s)強(qiáng)激光激發(fā)，由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射所吸收的能量，導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，核酸分子就會(huì)解吸附并轉(zhuǎn)變?yōu)閬喎€(wěn)態(tài)離子，產(chǎn)生的離子多為單電荷離子，這些單電荷離子在加速電場(chǎng)中獲得相同的動(dòng)能，進(jìn)而在一非電場(chǎng)漂移區(qū)內(nèi)按照其質(zhì)荷比率加以分離，在真空小管中飛行到達(dá)檢測(cè)器。MALDI產(chǎn)生的離子常用飛行時(shí)間（Time-of-Flight，TOF）檢測(cè)器來檢測(cè)，離子質(zhì)量越小，就越快到達(dá)。理論上講，只要飛行管長度足夠，TOF檢測(cè)器可檢測(cè)分子的質(zhì)量數(shù)是沒有上限的?，F(xiàn)批準(zhǔn)上市的產(chǎn)品有：二十項(xiàng)遺傳性耳聾基因突變檢測(cè)試劑盒（飛行時(shí)間質(zhì)譜法）、人CYP2C19基因分型檢測(cè)試劑盒(飛行時(shí)間質(zhì)譜法)等。五、基于CRISPR-Cas的檢測(cè)技術(shù)CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌的一種適應(yīng)性免疫應(yīng)答系統(tǒng)，其通過體內(nèi)小RNA對(duì)外來核酸進(jìn)行序列特異性檢測(cè)和沉默，從而阻止病毒?質(zhì)粒等入侵。該系統(tǒng)發(fā)揮功能的過程主要包括適應(yīng)?表達(dá)和干擾3個(gè)階段。當(dāng)病毒首次入侵時(shí)，細(xì)菌會(huì)將一小段病毒DNA整合到自身CRISPR基因的間隔序列中;當(dāng)該病毒再次入侵時(shí)，之前整合的CRISPR轉(zhuǎn)錄生成成熟CRISPR序列，即crRNA，在crRNA引導(dǎo)下，Cas蛋白特異性識(shí)別并切割外源的基因組變?yōu)榫€性，使得病毒無法進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，最終被細(xì)菌體內(nèi)的酶降解。該現(xiàn)象最早被CRISPR先驅(qū)JenniferDoudna和張鋒報(bào)道。CRISPR/Cas系統(tǒng)由兩大部分組成:第一個(gè)部分是編碼Cas相關(guān)蛋白質(zhì)的基因，這些Cas蛋白在獲得外源基因片段和剪切外源基因上都起著重要的作用。第二大部分被稱為CRISPRarray，這個(gè)部分中包含了repeat序列和spacer序列，這兩種不同的序列是間隔開來的，本著兩個(gè)repeat序列夾一個(gè)spacer序列，Repeat序列在同一細(xì)菌中的堿基組成和長度是相對(duì)保守，基本不變的。根據(jù)Cas效應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，CRISPR/Cas系統(tǒng)被分為兩大類:Class1(包含了typeI,III,andIV),和Class2(包含了typeII和typeV和typeVI)，在Class1中,對(duì)于外源基因組的剪切需要一個(gè)大的Cas蛋白復(fù)合物(由不止一種Cas蛋白組成)和引導(dǎo)RNA，在Class2中,對(duì)于外源基因的剪切只需要一個(gè)單一的剪切蛋白,目前基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的檢測(cè)方法包括RNA引導(dǎo)的靶向識(shí)別系統(tǒng)(Cas9)，以及靶向識(shí)別觸發(fā)的附帶裂解系統(tǒng)(Cas12和Cas13)。根據(jù)檢測(cè)原理,可將這些基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸檢測(cè)技術(shù)分為兩類:典型的靶向識(shí)別切割和非典型的非特異性反式切割。根據(jù)檢測(cè)信號(hào)的方式主要包括四大類:基于熒光信號(hào)實(shí)時(shí)檢測(cè)?基于裸眼比色檢測(cè)?基于電化學(xué)檢測(cè)和基于其他信號(hào)檢測(cè)。其中較常用的為基于熒光信號(hào)的檢測(cè)方法，即在反應(yīng)體系中使用末端帶有熒光基團(tuán)和熒光猝滅基團(tuán)標(biāo)記的單鏈DNA或單鏈RNA報(bào)告基因，當(dāng)Cas效應(yīng)蛋白和crRNA復(fù)合物特異性識(shí)別切割目標(biāo)基因后，會(huì)對(duì)報(bào)告基因進(jìn)行非特異性切割，熒光素得以釋放從而顯示結(jié)果。準(zhǔn)確、快速、簡便、經(jīng)濟(jì)一直是IVD開發(fā)的目標(biāo)，但就目前已在臨床應(yīng)用的產(chǎn)品來看，CRISPR技術(shù)和傳統(tǒng)的成熟PCR相比還未顯現(xiàn)明顯優(yōu)勢(shì)，PCR的最低檢出限和檢測(cè)速度甚至可以超越CRISPR。一個(gè)新技術(shù)需要一定時(shí)間的成熟和發(fā)展，也需要越來越多的臨床應(yīng)用反饋來改進(jìn)，因此，隨著提取技術(shù)、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用以及更新更好的Cas蛋白的發(fā)現(xiàn)，CRISPR技術(shù)是否能超越傳統(tǒng)PCR，是否如發(fā)表文獻(xiàn)所說的有專屬的應(yīng)用場(chǎng)景還有待觀察。現(xiàn)批準(zhǔn)上市的產(chǎn)品有：新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑盒（恒溫CRISPR法）、新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑盒（CRISPR免疫層析法）等。六、基于微流控技術(shù)的檢測(cè)技術(shù)微流控(Microfluidics)，是一種精確控制和操控微尺度流體，尤其特指亞微米結(jié)構(gòu)的技術(shù)，又稱其為芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-a-Chip)或微流控芯片技術(shù)。是把生物?化學(xué)?醫(yī)學(xué)分析過程的樣品制備?反應(yīng)?分離?檢測(cè)等基本