醫(yī)學(xué)教案GPC3-CAR-T回輸制劑生產(chǎn)工藝的研究資料及驗(yàn)證資料VIP

申請(qǐng)分類(lèi)：新藥注冊(cè)分類(lèi)：治療用生物制品1類(lèi)藥品名稱(chēng)靶向GPC3的自體CAR-T細(xì)胞回輸制劑資料項(xiàng)目名稱(chēng)生產(chǎn)工藝的研究資料及驗(yàn)證資料資料項(xiàng)目編號(hào)申請(qǐng)機(jī)構(gòu)：申請(qǐng)機(jī)構(gòu)地址：申請(qǐng)機(jī)構(gòu)電話(huà)：申請(qǐng)機(jī)構(gòu)主要研究者姓名：試驗(yàn)者姓名：試驗(yàn)起止日期：原始資料的保存地點(diǎn)：聯(lián)系人姓名、電話(huà)：藥品注冊(cè)申請(qǐng)人名稱(chēng)：目錄1靶向GPC3的自體CAR-T細(xì)胞 頁(yè)共11頁(yè)靶向GPC3的自體CAR-T細(xì)胞回輸制劑生產(chǎn)工藝研究資料及驗(yàn)證資料本注冊(cè)申報(bào)資料擬對(duì)靶向GPC3的自體CAR-T細(xì)胞回輸制劑的生產(chǎn)工藝和貯藏條件進(jìn)行研究，采用懸浮培養(yǎng)法，經(jīng)過(guò)分離、分選、培養(yǎng)、激活、擴(kuò)增、收獲等步驟制得的細(xì)胞懸液，含適量保存液。建立了一套從分離培養(yǎng)至細(xì)胞制劑的標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)工藝方案和質(zhì)控方法，為靶向GPC3的自體CAR-T細(xì)胞回輸制劑成品提供質(zhì)量可控的細(xì)胞來(lái)源。1靶向GPC3的自體CAR-T細(xì)胞本產(chǎn)品屬于基因改造的免疫細(xì)胞，以GPC3為靶點(diǎn)，通過(guò)將靶向GPC3的單鏈抗體GC33與共刺激分子CD28、CD137和CD3ζ鏈的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行融合重組，構(gòu)建抗-GPC3-CD28-CD137-CD3ζ的慢病毒表達(dá)載體，制備GPC3-CAR分子修飾的T細(xì)胞。2培養(yǎng)基的選擇2.1研究背景細(xì)胞培養(yǎng)是指模擬體內(nèi)環(huán)境，使細(xì)胞在體外生長(zhǎng)繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。常用的細(xì)胞培養(yǎng)體系包括細(xì)胞培養(yǎng)基，無(wú)菌無(wú)毒環(huán)境，恒定的溫濕度等等。培養(yǎng)基的主要成份為氨基酸，碳水化合物，無(wú)機(jī)鹽，維生素，血清，生長(zhǎng)因子以及其它成份。胎牛血清是細(xì)胞體外擴(kuò)增時(shí)常常采用的培養(yǎng)成份，這種血清帶有動(dòng)物來(lái)源的抗原，會(huì)在臨床上引起很多潛在的危險(xiǎn)，移植到人體內(nèi)后可能會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)和免疫排斥反應(yīng)ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA。其他的危險(xiǎn)性包括病毒和細(xì)菌感染、朊病毒和未知的動(dòng)物傳染病ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[1-3]。有報(bào)道采用異基因的人血清、富含血小板的血漿和人血小板裂解物ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA來(lái)培養(yǎng)擴(kuò)增干細(xì)胞ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[4-6]。然而，血清因?yàn)榕沃g的差異性影響體外培養(yǎng)細(xì)胞的可重復(fù)性。為了培養(yǎng)質(zhì)量可控，使用安全，重復(fù)性高的細(xì)胞產(chǎn)品，本項(xiàng)目選擇了無(wú)血清無(wú)抗生素成份的細(xì)胞培養(yǎng)體系，避免以往使用的含人或動(dòng)物血清培養(yǎng)體系,導(dǎo)致不同程度的異種蛋白混入而引起的排異反應(yīng)，以及抗生素殘留對(duì)人體的影響。本研究擬對(duì)不同培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，通過(guò)考察細(xì)胞的收獲量，形態(tài)等指標(biāo)，最終確定最優(yōu)化的細(xì)胞培養(yǎng)基體系，為臨床應(yīng)用提供支持。根據(jù)培養(yǎng)基臨床應(yīng)用的需要，選擇了以下3種國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上常見(jiàn)的無(wú)血清培養(yǎng)基（見(jiàn)下表9-1），作為細(xì)胞的備用培養(yǎng)基進(jìn)行考察。表9-1培養(yǎng)基選擇方案一覽表編號(hào)無(wú)血清培養(yǎng)基貨號(hào)廠(chǎng)商A免疫細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基ALyS505N珠海貝索BPC-1TM培養(yǎng)基77232Lonza（龍沙）集團(tuán)CFasGrow10150北京百樂(lè)通2.2儀器設(shè)備醫(yī)用潔凈工作臺(tái)SW-CJ-2F蘇州凈化設(shè)備有限公司離心機(jī)8420KUBOTA(日本久保田)生物顯微鏡CX21OLYMPUS(奧林巴斯公司)倒置相差顯微鏡IX71OLYMPUS(奧林巴斯公司)細(xì)胞培養(yǎng)箱MCO-20AICSANYO(三洋電機(jī)有限公司)2.3實(shí)驗(yàn)方案(1)將外周血分離所得的單個(gè)核細(xì)胞取樣，用countstar全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)；(2)按照免疫磁珠分選試劑盒（Dynabeads?人T細(xì)胞活化劑CD3/CD28）的說(shuō)明書(shū)的方法，按照1:1的比例加入偶聯(lián)CD3/CD28抗體的磁珠(beads)，輕輕震蕩20min，利用磁力架，得到CD3陽(yáng)性的T細(xì)胞。(3)將CD3陽(yáng)性T細(xì)胞用上述三種培養(yǎng)基進(jìn)行分別培養(yǎng)，按照1*106/ml細(xì)胞接種，進(jìn)行培養(yǎng)，加入300U/mLIL-2、50ng/mLIL-7、100ng/mLPHA，進(jìn)行培養(yǎng)。(4)72小時(shí)后，細(xì)胞激活，且得到純度比較高的T細(xì)胞，可以用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD69/CD8的細(xì)胞的比例。此時(shí)，可以用含CAR的慢病毒對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行感染。(5)再過(guò)12小時(shí)后，進(jìn)行全量換液，以去除感染用的病毒，然后繼續(xù)培養(yǎng)；根據(jù)細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)在后續(xù)的培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行細(xì)胞半換液，以補(bǔ)充細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。2.4結(jié)果討論通過(guò)A/B/C三種不同培養(yǎng)系統(tǒng)下培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究，考察不同培養(yǎng)體系下不同細(xì)胞的形態(tài)，融合度，計(jì)數(shù)等指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1)細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果表明：B，C培養(yǎng)基細(xì)胞生長(zhǎng)較差，不適合本生產(chǎn)工藝。2)細(xì)胞融合情況：A的細(xì)胞生長(zhǎng)較密集，培養(yǎng)72小時(shí)后，融合度達(dá)到85%-95%左右；而B(niǎo)和C就相對(duì)長(zhǎng)得比較稀松，融合度在70%-75%左右。3)計(jì)數(shù)結(jié)果：收獲量最大的是A培養(yǎng)基。B培養(yǎng)的細(xì)胞出現(xiàn)了很多亮點(diǎn)，已經(jīng)呈現(xiàn)老化現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)表明,隨著培養(yǎng)代次的增加，C培養(yǎng)體系下細(xì)胞形態(tài)逐漸老化。綜上所述，細(xì)胞在A培養(yǎng)基下培養(yǎng)都能獲得最多的細(xì)胞收獲量和較佳的細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)A培養(yǎng)基培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)胞也符合GPC3-CAR-T細(xì)胞的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，故A培養(yǎng)基為優(yōu)選培養(yǎng)基。2.5培養(yǎng)基主要成分試劑中文名試劑英文名來(lái)源供應(yīng)商L-谷氨酸L-Glutamine非動(dòng)物源invitrogenDMEM/F12DMEM非動(dòng)物源invitrogen胰蛋白酶TRYPSIN0.25%EDTA非動(dòng)物源invitrogen人轉(zhuǎn)鐵蛋白HumanHoloTransferrin人源R&DPBSPBS非動(dòng)物源invitrogenDME/F12培養(yǎng)基DME/F12非動(dòng)物源hyclone羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液HEPES非動(dòng)物源sigma重組人血小板源性生長(zhǎng)因子PDGF-BB非動(dòng)物源R&D成纖細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF非動(dòng)物源R&D人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1非動(dòng)物源R&D3制備工藝路線(xiàn)的選擇根據(jù)國(guó)內(nèi)外有關(guān)CAR-T細(xì)胞的分離培養(yǎng)研究方法，結(jié)合本公司實(shí)際情況，研究出一套生產(chǎn)可行，質(zhì)量可控的靶向GPC3的自體CAR-T細(xì)胞回輸制劑的分離、培養(yǎng)、傳代、收獲等一系列的制備工藝和質(zhì)控方法，并在該工藝下對(duì)培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)胞純度，形態(tài)，鑒別，檢查以及相關(guān)生物學(xué)特性進(jìn)行質(zhì)量研究，制訂本產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。3.1實(shí)驗(yàn)方案采集外周血50mL，以2000r·min-1離心l0min，收集上層自體血漿，56℃水浴滅活30min，置于4℃冷藏備用。下層血液與磷酸鹽緩沖液（PBS）按1∶1稀釋吹打均勻，加入2倍體積的淋巴細(xì)胞分離液，以2000r·min-1離心30min。吸取單個(gè)核細(xì)胞層，PBS洗滌細(xì)胞2次，以1500r·min-1離心10min。將細(xì)胞沉淀用含10%自體血漿的ALyS505N無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，添加終濃度為50ng·mL-1抗CD3單克隆抗體、1000U·mL-1IFN-γ，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。于第2天，添加CD3/CD28抗體偶聯(lián)磁珠激活T淋巴細(xì)胞（CD3/CD28抗體偶聯(lián)磁珠與T淋巴細(xì)胞的比例為3:1），同時(shí)添加終濃度為100U·mL-1IL-1α、300U·mL-1IL-2、30ng·mL-1IL-7。于第3天，按病毒和培養(yǎng)基的體積比1：500添加病毒液，病毒感染10天后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CAR的表達(dá)情況。儀器設(shè)備：醫(yī)用潔凈工作臺(tái)SW-CJ-2F蘇州凈化設(shè)備有限公司離心機(jī)8420KUBOTA(日本久保田)生物顯微鏡CX21OLYMPUS(奧林巴斯公司)倒置相差顯微鏡IX71OLYMPUS(奧林巴斯公司)細(xì)胞培養(yǎng)箱MCO-20AICSANYO(三洋電機(jī)有限公司)3.1.1實(shí)驗(yàn)步驟（1）設(shè)計(jì)GPC3-CAR分子。選擇可特異性識(shí)別GPC3的單鏈抗體GC33、CD8α鉸鏈區(qū)、CD28的穿膜結(jié)構(gòu)域，以及共刺激分子CD28、CD137和CD3ζ鏈的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域?yàn)槟０?，通過(guò)柔性連接鏈將這些結(jié)構(gòu)串聯(lián)，獲得完整的可固定表達(dá)于Ｔ細(xì)胞膜上的CAR分子。此外，在遵循偏愛(ài)密碼子的基礎(chǔ)上，根據(jù)氨基酸密碼子的簡(jiǎn)并性在保證氨基酸序列不變的情況下對(duì)基因序列進(jìn)行改造，以增強(qiáng)CAR分子的表達(dá)效率。（2）構(gòu)建GPC3-CAR慢病毒表達(dá)載體。利用PCR和分子克隆技術(shù)按上述設(shè)計(jì)將識(shí)別GPC3抗原的單鏈抗體GC33與共刺激分子CD28、CD137和CD3ζ鏈的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行基因重組，隨后通過(guò)人工合成和拼接技術(shù)，獲得靶向GPC3抗原的GPC3-CAR基因片段，再以XbaⅠ和BamHⅠ限制性酶切位點(diǎn)為克隆位點(diǎn)，利用亞克隆技術(shù)將GPC3-CAR基因片段插入慢病毒表達(dá)載體pCDH-CMV-MCS-EF1α-copGFP中，最終獲得攜帶GPC3-CAR基因片段的慢病毒表達(dá)載體pCDH-CMV-GPC3-CAR-EF1α-copGFP。（3）包裝GPC3-CAR慢病毒。用DMEM-HG培養(yǎng)基培養(yǎng)293FT細(xì)胞，將匯合度70%~80%的培養(yǎng)細(xì)胞接種到10cm培養(yǎng)皿中，含10%胎牛血清的DMEM-HG培養(yǎng)基換液。取2個(gè)1.5mlEP管，各加入500μl無(wú)血清DMEM-HG培養(yǎng)基，將3種慢病毒包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG與慢病毒表達(dá)載體按1∶1∶1∶1的比例混合后加入到1個(gè)EP管，另1個(gè)EP管加入PolyJetTM，3種包裝質(zhì)粒加上慢病毒表達(dá)載體的質(zhì)量與PolyJetTM體積比為1∶3。將2個(gè)EP管各自混勻后靜置5min，隨后將裝有Poly-JetTM的EP管中的液體緩緩加入裝有質(zhì)粒的EP管中，輕輕混勻后室溫靜置20min。然后將此復(fù)合物加入到培養(yǎng)的293FT細(xì)胞中，培養(yǎng)16h后棄掉上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM-HG培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24h后熒光顯微鏡觀察綠色熒光的發(fā)光情況，48h后收取上清液，于4℃條件下12000×g離心20min，0.45μm濾器過(guò)濾后用1.5mlEP管分裝后-80℃凍存?zhèn)溆?。?）制備GPC3-CAR慢病毒感染T細(xì)胞。取健康志愿者外周血，用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液和密度梯度離心法分離得到PBMC。用含10%胎牛血清的KBM551培養(yǎng)基重懸細(xì)胞（2×106個(gè)/ml），并接種于T25培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入IFN-γ（1000IU/ml），24h后加rIL-2（300IU/ml）和抗CD3抗體（50ng/ml）。72h后用GPC3-CAR慢病毒按8PFU慢病毒/細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)感染T細(xì)胞。感染后的T細(xì)胞（5×105/ml）繼續(xù)培養(yǎng)，每隔1d加rIL-2(300U/ml)。（6）流式細(xì)胞術(shù)鑒定GPC3-CAR分子陽(yáng)性Ｔ細(xì)胞比率。將GPC3-CAR慢病毒感染組T細(xì)胞收集到15ml離心管中，200×g離心5min后棄上清，加入1mlPBS重懸細(xì)胞，200×g離心5min后棄上清，再加入0.2mlPBS重懸細(xì)胞（5×106個(gè)/ml）后流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞的綠色熒光表達(dá)情況，以表達(dá)綠色熒光的T細(xì)胞為GPC3-CAR表達(dá)陽(yáng)性。（7）ELISA檢測(cè)GPC3-CAR-T細(xì)胞IFN-γ的分泌水平。將GPC3陽(yáng)性的Huh-7細(xì)胞與GPC3陰性的SK-HEP-1細(xì)胞接種于12孔板（5×104個(gè)/孔），待細(xì)胞貼壁后，CAR-T組按照效靶比0.5∶1、1∶1和2∶1分別加入2.5×104、5×104和1×105個(gè)GPC3-CAR-T細(xì)胞，空載病毒組按照效靶比0.5∶1、1∶1和2∶1分別加入2.5×104、5×104和1×105個(gè)空載病毒感染的T細(xì)胞，對(duì)照組只加入2.5×104、5×104和1×105個(gè)GPC3-CAR-T細(xì)胞。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，共培養(yǎng)24h后3000×g離心10min，收集上清液，用ELISA試劑盒檢測(cè)IFN-γ水平。將100μl收集的各組上清液加入到相應(yīng)孔中，之后按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)量450nm波長(zhǎng)處光密度（D）值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算各樣本的IFN-γ（μl/ml）水平。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.2.1Westernblotting檢測(cè)GPC3-CAR分子在CAR-T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)（屬于定性檢測(cè)）Westernblotting檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示，在GPC3-CAR-T細(xì)胞中可見(jiàn)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為16kD和55kD蛋白帶2條，而對(duì)照組T細(xì)胞僅見(jiàn)16kD內(nèi)源性CD3ζ條帶，而GPC3-CAR的相對(duì)分子質(zhì)量為55kD，提示GPC3-CAR-T細(xì)胞確實(shí)能表達(dá)GPC3-CAR分子。3.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)慢病毒感染T細(xì)胞后表達(dá)的GPC3-CAR分子GPC3-CAR重組的慢病毒感染T細(xì)胞后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞中GPC3-CAR分子表達(dá)結(jié)果（圖2）顯示，約54.88%GPC3-CAR慢病毒感染的T細(xì)胞（GPC3-Tcell）表達(dá)GPC3-CAR分子。3.2.3ELISA檢測(cè)GPC3-CAR-T細(xì)胞IFN-γ的分泌水平在ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子釋放實(shí)驗(yàn)中，與GPC3陽(yáng)性Huh-7細(xì)胞共培養(yǎng)，GPC3-CAR-T細(xì)胞組CAR-T細(xì)胞比空載慢病毒感染的空載病毒組產(chǎn)生更多的IFN-γ[(21371.4±1808.3)vs(152.8±12.5)pg/ml,P<0.01]（圖A）。然而，當(dāng)這兩組T細(xì)胞與GPC3的SK-HEP-1細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，IFN-γ的分泌量?jī)H輕微增加[(153.9±13.2)vs(150.6±21.9)pg/ml,P>0.05]（圖B）。4生產(chǎn)過(guò)程主要工藝參數(shù)和質(zhì)控參數(shù)4.1生產(chǎn)過(guò)程主要工藝參數(shù)見(jiàn)下表4-1。表4-1主要生產(chǎn)過(guò)程工藝參數(shù)一覽表序號(hào)工序關(guān)鍵控制項(xiàng)目控制參數(shù)1GPC3-CAR分子設(shè)計(jì)scfv的親和力10-4-10-8M胞內(nèi)區(qū)共刺激分子數(shù)量2添加酶切位點(diǎn)序列5’端和3’端添加不同的酶切位點(diǎn)，以便定向克隆2GPC3-CAR慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建GPC3-CAR質(zhì)粒酶切和慢病毒轉(zhuǎn)移載體酶切酶切時(shí)間2hGPC3-CAR質(zhì)粒酶切和慢病毒轉(zhuǎn)移載體連接GPC3-CAR質(zhì)粒酶切和慢病毒轉(zhuǎn)移載體摩爾比為3:1連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化熱激時(shí)間90s293T細(xì)胞密度接種密度為50%，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度為70%培養(yǎng)基要求含110mg/L丙酮酸鈉、10%FBS的高糖DMEM慢病毒轉(zhuǎn)染效率80%以上慢病毒收集時(shí)間48h和72h慢病毒過(guò)濾雜質(zhì)0.45微米的過(guò)濾器過(guò)濾4GPC3-CAR慢病毒感染T細(xì)胞制備Ficoll分離單個(gè)核細(xì)胞CD3/CD28磁珠與T細(xì)胞比例 3:1感染滴度5感染時(shí)間10-14d4.2生產(chǎn)過(guò)程主要質(zhì)控參數(shù)見(jiàn)下表4-1。表4-1主要生產(chǎn)過(guò)程質(zhì)控參數(shù)一覽表類(lèi)別樣品質(zhì)控項(xiàng)目質(zhì)控方法標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定頻次處理樣本檢測(cè)血液篩查HIV-1/2抗體酶聯(lián)免疫法陰性每份HBsAg酶聯(lián)免疫法陰性每份HCVAb酶聯(lián)免疫法陰性每份Anti-TP酶聯(lián)免疫法陰性每份細(xì)胞制備過(guò)程檢測(cè)細(xì)胞末次洗滌上清需氧菌及真菌全自動(dòng)細(xì)菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)法陰性每批厭氧菌及真菌全自動(dòng)細(xì)菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)法陰性每批細(xì)胞培養(yǎng)D5細(xì)胞形態(tài)鏡下觀察圓球狀細(xì)胞，呈集落狀聚團(tuán)每批含細(xì)胞的培養(yǎng)液無(wú)菌直接培養(yǎng)法不得檢出每批細(xì)胞凍存收集細(xì)胞前細(xì)胞形態(tài)鏡下觀察呈懸浮，應(yīng)為集落圓團(tuán)細(xì)胞每批細(xì)胞懸液細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)標(biāo)示量的90%～120%每批細(xì)胞懸液細(xì)胞活率細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)≥85%每批細(xì)胞懸液無(wú)菌需氧菌及真菌全自動(dòng)細(xì)菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)法陰性每批厭氧菌及真菌全自動(dòng)細(xì)菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)法陰性每批細(xì)胞懸液及上清支原體培養(yǎng)法及DNA染色法陰性每批細(xì)胞懸液細(xì)胞表面抗原分析流式細(xì)胞術(shù)（FCM）符合規(guī)定每批細(xì)胞懸液GPC3-CAR分子表達(dá)率流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)符合規(guī)定每批細(xì)胞懸液IFN-γ的分泌水平ELISA檢測(cè)符合規(guī)定每批5生產(chǎn)工藝的驗(yàn)證6生產(chǎn)過(guò)程的無(wú)菌控制本品作為注射用生物制品，成品具有生物活性無(wú)法進(jìn)行常規(guī)的滅菌程序，為保證靶向GPC3的自體CAR-T細(xì)胞的無(wú)菌，細(xì)胞在生產(chǎn)制備過(guò)程中分別通過(guò)人、機(jī)、料、法、環(huán)等幾個(gè)方面進(jìn)行無(wú)菌的管控工作。――人員：制備全過(guò)程涉及的制備人員、檢測(cè)人員均應(yīng)持有公司技術(shù)部門(mén)核發(fā)的《上崗證》，經(jīng)過(guò)相關(guān)無(wú)菌操作的培訓(xùn)及考核合格上方可上崗工作；制備期間，其個(gè)人健康及衛(wèi)生均應(yīng)符合相關(guān)規(guī)定，各項(xiàng)操作均需參照《無(wú)菌操作管理規(guī)程》《潔凈室衛(wèi)生管理規(guī)程》執(zhí)行；――儀器：制備全過(guò)程涉及的儀器設(shè)備均應(yīng)運(yùn)行正常且應(yīng)及時(shí)填寫(xiě)《設(shè)備運(yùn)行記錄》；需滅菌使用的容器具，其滅菌過(guò)程應(yīng)處于受控狀態(tài)，滅菌符合規(guī)定，且在規(guī)定有效期內(nèi)。――物料：細(xì)胞制備全過(guò)程所用原、輔料應(yīng)經(jīng)確認(rèn)來(lái)自合格供應(yīng)商，關(guān)鍵物料應(yīng)有廠(chǎng)家出具的全檢報(bào)告，無(wú)外源性污染。物料進(jìn)出潔凈區(qū)按照《物料進(jìn)入潔凈區(qū)標(biāo)準(zhǔn)操作程序》進(jìn)行消毒或滅菌后方可進(jìn)入潔凈工作區(qū)和用于生產(chǎn)制備。――環(huán)境：細(xì)胞制備區(qū)域環(huán)境監(jiān)控應(yīng)符合規(guī)定要求，定期對(duì)潔凈制備區(qū)的沉降菌、塵埃粒子以及潔凈空調(diào)系統(tǒng)的換氣、平均風(fēng)速等開(kāi)展檢測(cè)；如有傳染病原體或污染物，均應(yīng)得到有效隔離，并按照《實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)細(xì)胞污染的標(biāo)準(zhǔn)操作程序》執(zhí)行。――操作：細(xì)胞制備工藝操作過(guò)程應(yīng)符合對(duì)應(yīng)SOP的規(guī)定；操作過(guò)程應(yīng)滿(mǎn)足無(wú)菌要求，制備現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)無(wú)污染及交叉污染。細(xì)胞制備各工序完畢后均應(yīng)及時(shí)清場(chǎng)，符合《清場(chǎng)管理規(guī)程》的要求。制備記錄、監(jiān)控記錄填寫(xiě)應(yīng)符合規(guī)定要求，并與制備過(guò)程相符，有操作者，復(fù)核者簽名，細(xì)胞制備檔案內(nèi)容應(yīng)完整并經(jīng)復(fù)核。依據(jù)《細(xì)胞制備過(guò)程質(zhì)量控制點(diǎn)》的要求送樣并按規(guī)定要求進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)生產(chǎn)工藝各過(guò)程質(zhì)控點(diǎn)監(jiān)控產(chǎn)品是否受到微生物的污染，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)符合規(guī)定。QA人員依照《過(guò)程控制管理規(guī)程》，確保細(xì)胞制備過(guò)程相關(guān)因素受控，確保細(xì)胞質(zhì)量的安全。7參考文獻(xiàn)[1]WANGHL,ANATELLIF,ZHAIQJ,etal.Glypican-3asausefuldiagnosticmarkerthatdistinguisheshepatocellularcarcinomafrombenignhepatocellularmasslesions[J].ArchPatholLabMed,2008,132(11):1723-1728.DOI:10.1043/1543-2165-132.11.1723.[2]TOPALIANSL,WEINERGJ,PARDOLLDM.Cancerimmuno-therapycomesofage[J].JClinOncol,2011,29(36):4828-4836.DOI:10.1038/ncponc0101.[3]DRAKECG,JAFFEEE,PARDOLLDM.Mechanismsofim-muneevasionbytumors[J].AdvImmunol,2006,90:51-81.DOI:10.1016/S0065-2776(06)90002-9.[4]DAVILAML,RIVIEREI,WANGX,etal.