《淀粉及其制品中玉米、木薯源性成分梯型熔解溫度等溫擴增檢測方法》編制說明（征求意見稿）

《食用玉米淀粉》和GB/T25219-201法》；木薯淀粉的GB2713-2015《淀本標準的制定參考了GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化本文件規(guī)定了淀粉及其制品中玉米、木薯源性成分的梯型熔解溫度等溫擴增檢測方法。本文件適用于淀粉及其制品中玉米、木薯源性成分的定性檢測。本文件所規(guī)定方法的檢出限（LOD）為1%（質量比）。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T12104淀粉術語GB/T27403-2008實驗室質量控制規(guī)范食品分子生物學檢測3術語和定義GB/T12104界定的術語和定義適用于本文件。4方法提要提取樣品DNA，用已知含玉米、木薯成分的樣品DNA作陽性對照，用已知不含玉米、木薯成分的樣品DNA作陰性對照，滅菌雙蒸水作為空白對照，使用特異性引物和探針，采用梯型熔解溫度等溫擴增技術，根據(jù)熒光信號和擴增現(xiàn)象，判定是否存在玉米、木薯源性成分。5原理選擇Tm值曲線為梯型（包括人字梯型、半人字梯型和直梯型）的特異性核酸片段為靶序列設計巢式引物，將巢式引物的外引物與內引物分別連接成一對引物作為等溫擴增用引物，借助外引物與核酸靶序列上對應片段的熔解溫度差異提供單鏈模板，在DNA聚合酶（大片段）催化下通過合成反應與鏈替代反應對梯型Tm值曲線的靶標核酸片段進行等溫擴增，進行不同淀粉成分的定性分析。6試劑或材料除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。實驗用水符合GB/T6682中一級水的規(guī)格。所有試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。6.1植物基因組DNA提取試劑盒。6.2梯型熔解溫度等溫擴增檢測LMTIA試劑盒。Proofman探針法6.3梯型熔解溫度等溫擴增檢測LMTIA的引物和探針。玉米、木薯引物和探針詳見表1。玉米和木薯引物擴增的靶標序列參見附錄A。6.4梯型熔解溫度等溫擴增檢測反應混合液（5μL（2X）通用型LMTIA預混液，0.4μL(100U/μL)(U，Unit，酶學單位)Bst酶）。表1玉米、木薯成分鑒定用引物和探針序列名稱序列(5’→3’)靶基因玉米正向引物F:ACCTGGGGTCGCGGTTTTTATTCGGCCCTAAGGACCCATITS反向引物B:CCCCAGGTCAGTCGGGTTTTATATGCTTAAACTCAGCGGG環(huán)引物LF:GGCAAGCTCGGTCGCT探針:BHQ1-GGCAAGCTCGGTCGCC-FAM木薯正向引物F:GCCCACGGCCGTTTTCACGGCTATCGGTGGTTGITS反向引物B:CGGCCGTGGGCTTTTCCCGTTCGGCAGACGTTC環(huán)引物LF:TGTCCGAGGGTCTTC探針:BHQ1-TGTCCGAGGGTCTTT-ROX7儀器設備7.1等溫熒光擴增儀。7.2恒溫水浴鍋。7.3離心機：離心力≥12000g。7.5恒溫混勻儀。7.6渦旋震蕩器。7.7pH計，精度為0.01。7.8天平：感量0.01g。7.9微量紫外-可見分光光度計。8檢測步驟8.1DNA提取采用市售的植物基因組DNA提取試劑盒提取。將樣品研磨至粉末（淀粉樣品直接稱取取100mg~200mg于2mL離心管中，詳見試劑盒說明書進行后續(xù)DNA的提取。注意：洗脫緩沖液體積不應少于50μL，體積過小影響回收效率。洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用雙蒸水做洗脫液應保證其pH值在7.0-8.5范圍內，pH值低于7.0會降低洗脫效率；且DNA產物應保存在-20℃,以防DNA降解。8.2DNA濃度與純度的檢測使用核酸蛋白儀或微量紫外-可見分光光度計檢測提取DNA的濃度與純度。分別檢測260nm和280nm處的吸光值，每個樣品重復測三次，取平均值。當A260/A280比值在1.6～2.0時，可用于LMTIA擴增。8.3梯型熔解溫度等溫擴增8.3.1梯型熔解溫度等溫擴增反應體系梯型熔解溫度等溫擴增反應體系見表2。PCR八聯(lián)管中按表1依次加入反應試劑，混勻。放入等溫熒光擴增儀。表2梯型熔解溫度等溫擴增反應體系（10μL）試劑體積(μL）梯型熔解溫度等溫擴增反應混合液5.4正向引物F（100μmol/L）0.16反向引物B（100μmol/L）0.16環(huán)引物LF（100μmol/L）0.04探針（10μmol/L）0.1滅菌雙蒸水DNA模板2.08.3.2梯型熔解溫度等溫擴增反應程序按照表2配制玉米、木薯基因的反應體系。反應程序為：等溫熒光擴增儀，玉米和木薯的檢測溫度分別設置為61℃和62℃,設置40個循環(huán)，每個循環(huán)30s。在樣品等溫擴增的同時，檢測過程中應分別設立陽性對照、陰性對照和空白對照。用已知含玉米、木薯成分的樣品DNA作陽性對照，用已知不含玉米、木薯成分的樣品DNA作陰性對照，和空白對照（滅菌雙蒸水），實驗重復三次。9結果判定若有FAM熒光檢出，等溫熒光擴增儀中出現(xiàn)S型或S型趨勢的曲線，則判定樣品含有玉米源性成分，表述為“檢出玉米成分”;S曲線參考附錄B；若有ROX熒光檢出，等溫熒光擴增儀中出現(xiàn)S型或S型趨勢的曲線，則判定樣品含有木薯源性成分，表述為“檢出木薯成分”;S曲線參考附錄B；如無FAM熒光檢出，無S典型擴增曲線，則判定為不含玉米源性成分，表述為“未檢出玉米成分”;如無ROX熒光檢出，無S典型擴增曲線，則判定為不含木薯源性成分，表述為“未檢出木薯成分”;在樣品梯型熔解溫度等溫擴增的同時，應設置梯型熔解溫度等溫擴增陰性對照、梯型熔解溫度等溫擴增陽性對照和梯型熔解溫度等溫擴增空白對照，實驗重復三次。管理委員會頒發(fā)的玉米淀粉的GB1353-2018《玉米》、GB/T10463-2008《玉標準GB/T29343-2012bz《國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的BJS201707《植物蛋